CN1529164A - 松材线虫检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明松材线虫检测试剂盒及其检测方法属于农林作物防病治病及植物检疫范畴。设计了两个引物对，P1/P3为松材线虫特异性引物对，P2/P3为拟松材线虫特异性引物对。试剂盒：1.25ml溶液I，(Worm Lysis Buffer，500mM KCl，100mM Tris－Cl pH8.0，15mM MgCl₂，10mM DTT，4.5％Tween 20，0.1％gelatin，0.2ug/ul蛋白酶K)，1ml溶液II(2×PCR反应Buffer，4.0mMMgCl₂，0.2mM dNTP，0.8μMP₁、P₂、P₃)，100U taq酶，线虫对照DNA各50ul。该检测试剂盒具较强的特异性、灵敏性及稳定性，提供了快速、灵敏、特异的技术方法。

Description

松材线虫检测试剂盒及其检测方法

(一)技术领域

本发明松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)检测试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。专用于海关进出境木材和木质包装所带松材线虫的高灵敏度快速检测。同时可用于林间松材线虫病的检测和诊断。

(二)背景技术

松材线虫病又称作松树萎蔫病，是林业上的一种毁灭性病害，被称为森林癌症。感病松树被其侵染，当环境条件适宜时，仅仅一个月左右即全株枯死。该病最早于1905年在日本九州长崎被发现，而后在美国、加拿大、墨西哥、韩国、葡萄牙等地均有报道。该病的病原线虫是松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus(Steiner and Buhrer)Nickel]，分类上属滑刃目、滑刃总科、伞滑刃属。该病自1982年在南京中山陵首次报道以来，现已查明在我国江苏、安徽、浙江、广东、山东、香港、台湾等地均有分布，且各地有呈扩散蔓延之趋势。至1998年底，该病在江苏、安徽、浙江、广东、山东五省的37个县市发病面积超过100余万亩，累计枯死松树1600余万株，直接经济损失1.28亿元，对我国林业资源、自然景观和生态环境造成了严重破坏。目前，对于松材线虫病尚无很好的防治办法，只有通过检疫的手段防止其继续蔓延传播，控制传播媒体的入境渠道，加强该病的检疫。而检疫工作的有效实施，需要一套快速、准确的病原线虫检测鉴定技术。而且，在枯死松树中，往往除了松材线虫外，还有其它线虫，特别是与松材线虫同属的其它伞滑刃线虫，包括拟松材线虫(Bursaphelenchusmucronatus Mamiya & Enda，1979)、假伞滑刃线虫(B.fraudulentus)等。这些线虫与松材线虫形态相似、较难辨认。目前，在口岸中，松材线虫的主要检疫技术是形态学观察，但形态学观察存在以下缺点：第一，在口岸截获的松材线虫，一般存在于货物的木质包装板或垫板中，这些材料一般较为干燥，其中的线虫数量较少，而且大多都是幼虫，常处于休眠阶段，其口针和食道都已经退化，要准确鉴定有一定的困难。而要获得成虫做鉴定需要做进一步的培养，这一过程至少需要7-10天，满足不了口岸快速检疫的要求。第二，一些形态学鉴别特征如雌虫尾尖突长度、尾形、雄虫交合伞形状与拟松材线虫存在一定的重叠现象，给形态鉴定带来了一定困难，容易造成错检、漏检现象。针对这些情况，检疫上急需一套快速、准确的病原线虫的检测、鉴定技术。

近年来，随着生化及分子生物学技术的发展，国内外的一些学者先后采用同工酶电泳和PCR-ITS-RFLP技术对松材线虫进行检测鉴定，但是这些技术受到线虫群体的数量、线虫群体是否单一等方面的影响，必须将港口截获的线虫进行纯化培养，耗时费力，难以满足快速检测的要求。

随着我国进口木材和木质包装货物的增多，松材线虫从疫区进入我国的机会亦增多，但我国口岸缺乏必要的对该病原物进行快速检测的方法。故本发明的目的就是形成一整套松材线虫分子鉴定的试剂盒，以满足港口检疫部门快速检测的需要。

(三)发明内容

技术问题  由于现有技术的限制，要对松材线虫进行准确检测所需周期较长，同时由于松材线虫与拟松材线虫在形态发育、生理生化等方面的相似性，要准确地对两者(尤其是幼虫)进行鉴定有一定的难度。因此本发明的目的就是提供松材线虫与拟松材线虫检测方法及其检测试剂盒，对松材线虫和拟松线虫进行快速准确的鉴定。

技术方案

松材线虫检测试剂盒，包括以下成分：

1)松材线虫与拟松材线虫特异性引物序列：

上游引物P1：5′-GATGATGCGATTGGTGACT-3′

上游引物P2：5′-TGTTTGAGGAGTGCGTGCAC-3′

下游引物P3：5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG  3′

其中P1/P3构成松材线虫特异性引物对，P2/P3构成拟松材线虫特异性引物对；

2)1.25ml溶液I，内含1mlWLB和0.25ml1ug/ul蛋白酶K，其中1mlWLB(Worm Lysis Buffer)含有500mM KCl，100mM Tris-Cl pH8.0，15mM MgCl₂，10mM DTT，4.5％(质量比，下文同)Tween 20，0.1％明胶和水；

3)1ml溶液II，内含

2×PCR reaction Buffer，4.0mM MgCl₂，0.2mM dNTP，0.8μM P₁，0.8μMP₂，0.8μM P₃，100U taq酶，松材线虫和拟松材线虫对照DNA各50ul和水。

上述松材线虫检测试剂盒用于检测松材线虫的方法，包括：

1)线虫DNA的提取

将线虫挑入双蒸水中，用解剖刀将线虫切成3段以上；用取液器吸取带有线虫片段的线虫液5μl加入到已装有5μl权利要求1所述溶液I的0.2ml薄壁管中；将0.2ml薄壁管置于-20℃～-80℃冷冻3h～10min；冷冻后再将薄壁管在65℃下温育至少2h，最后94℃下保温10min；12000g离心4min即得到单条线虫DNA；

2)松材线虫双倍PCR检测

吸取所得的单条线虫的DNA 5μl作为PCR反应的模板进行PCR反应；按下列组成在PCR反应管中调制反应液，15μl反应体积包括：

溶液II                        7.5μl

ddH₂O                        2.4μl

Taq酶                         0.1μl

DNA                           5μl

3)在进行单条线虫扩增的同时还应进行松材线虫和拟松材线虫对照DNA的扩增反应，此时加入的模板体积为1μl，而ddH₂O体积为6.4μl；

4)双倍PCR反应程序

94℃变性10分钟；进入循环，94℃变性45秒，52℃退火45秒，72℃延伸1分钟，40个循环；最后72℃延伸10分钟；

5)反应结束后，取反应液5-10μl在1.5％的琼脂糖中电泳，与对照DNA的扩增片段比较，松材线虫扩增片段约为850bp，拟松材线虫扩增片段约为350bp(见附电泳图谱)，故当发现样本的扩增片段为850bp时则样本为松材线虫，如样本的扩增片段为350bp时则为拟松材线虫。

有益效果  本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：

(1)实用性好：从木材或木质包装中分离出的线虫可以直接用于检测，无需纯化培养，有重要的实际应用价值。松材线虫随贸易往来最可能的传播途径是木材或木质包装传播，在贸易口岸中，检疫部门主要是通过对线虫的分离、鉴定来判别是否携带松材线虫。但是目前的检测方法需要对该病原线虫进行分离纯化培养，需要5-7天的时间，无法满足进出境检疫部门快速检疫的需要。为了使我们的检疫方法具有实际的应用价值，我们将分离得到的线虫(无论成虫还是幼虫)提取DNA后直接进行PCR扩增，可在8小时内完成对松材线虫的检测。因此本方法大大提高了检测的效率。

(2)准确性高：由于传统松材线虫的检测技术只是根据形态特征来确定建议对象，容易受到虫龄的限制，同时无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相似种，尤其是松材线虫和拟松材线虫的区分，从而导致准确性不高；而本发明根据松材线虫和拟松材线虫的核糖体基因转录间隔区(Internal TranscribedSpacer，英文缩写为ITS)序列，利用Bioedit软件对该序列与其它相似种ITS序列进行比较，选择松材线虫和拟松材线虫特有序列做特异引物，进行PCR扩增，为病原线虫的鉴定和检测提供准确的靶标位点。

(3)灵敏度高：试剂盒研制中我们观察到，按照本试剂盒提供的说明方法，可以对单条线虫提取DNA进行PCR扩增，效果良好。

(四)说明书附图

图1：松材线虫与拟松材线虫粗提DNA为模板进行双倍PCR扩增M为分子量标记，1-4为松材线虫，5-8为拟松材线虫

图2：单条松材线虫与拟松材线虫DNA为模板进行双倍PCR扩增M为分子量标记，1-4为松材线虫，5-8为拟松材线虫

以设计的松材线虫和拟松材线虫特异引物对松材线虫和拟松材线虫进行双倍PCR检测，松材线虫可以扩增出850bp的条带，拟松材线虫可以扩增出350bp的条带。

(五)具体实施方式

实施例1：松材线虫与拟松材线虫特异性引物P1/P2/P3的双倍PCR扩增。

松材线虫检测试剂盒，包括以下成分：

松材线虫与拟松材线虫特异性引物序列

上游引物P1：5′-GATGATGCGATTGGTGACT-3′

上游引物P2：5′-TGTTTGAGGAGTGCGTGCAC-3′

下游引物P3：5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′

试剂盒反应体系：

松材线虫检测试剂盒，包括以下成分：1.25ml溶液I，内含1mlWLB(WormLysis Buffer，500mM KCl，100mM Tris-Cl pH8.0，15mM MgCl₂，10mM DTT，4.5％Tween 20，0.1％gelatin，)和0.25ml 1ug/ul蛋白酶K，1ml溶液II(2×PCR反应Buffer，4.0mM MgCl₂，0.2mM dNTP，0.8μM P₁、P₂、P₃)，100U taq酶，松材线虫和拟松材线虫对照DNA各50ul。该试剂盒存放于-20℃，保质期1年。

对松材线虫和拟松材线虫样本进行分子检测

上述松材线虫和拟松材线虫检测试剂盒用于检测的方法，包括：

1)单条线虫DNA提取

★在洗液浸泡过的凹玻片的凹孔中加入双蒸水6μl；

★将一条线虫挑入双蒸水中，用解剖刀(11号刀片)将线虫切成3段以上；

★用取液器迅速吸取带有尽量多线虫片段的线虫液5μl加入到已装有5μl溶液I的0.2ml薄壁管中；

★将0.2ml薄壁管置于-20℃至少冷冻3h或-80℃至少10min；

★冷冻后再将薄壁管在65℃下温育至少2h，最后94℃下保温10min；

★12000g离心4min即得到单条线虫的DNA；

2)双倍PCR扩增：

取5ul单条线虫DNA溶液，加入7.5ul溶液II，2.4ul双蒸水，0.1ultaq酶，总体积15ul，同时进行松材线虫和拟松材线虫对照DNA的扩增反应，此时加入模板体积为1ul，而双蒸水的体积为6.4ul。

PCR扩增程序为94℃变性10分钟；进入循环，94℃变性45秒，52℃退火45秒，72℃延伸1分钟，40个循环；最后72℃延伸10分钟。

3)扩增产物的电泳检测：

取5-10μL PCR扩增产物，在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果；其中分子量约为850bp的特异性条带证明所检测的病原线虫为松材线虫，分子量约为350bp的DNA条带证明所检测病原为拟松材线虫(图1，图2)，上述方法可在8小时内完成对松材线虫和拟松材线虫的检测，准确、灵敏。

Claims (2)

1、松材线虫检测试剂盒，包括以下成分：

1)松材线虫与拟松材线虫特异性引物序列：

上游引物P1：5′-GATGATGCGATTGGTGACT-3′

上游引物P2：5′-TGTTTGAGGAGTGCGTGCAC-3′

下游引物P3：5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′

其中P1/P3构成松材线虫特异性引物对，P2/P3构成拟松材线虫特异性引物对；

2)1.25ml溶液I，内含1mlWLB和0.25ml1ug/ul蛋白酶K，其中1mlWLB(Worm Lysis Buffer)含有500mM KCl，100mM Tris-Cl pH 8.0，15mM MgCl₂，10mM DTT，4.5％(质量比，下文同)Tween 20，0.1％明胶和水；

3)1ml溶液II，内含

2×PCR reaction Buffer，4.0mM MgCl₂，0.2mM dNTP，0.8μM P₁，0.8μMP₂，0.8μM P₃，100U taq酶，松材线虫和拟松材线虫对照DNA各50ul和水。

2、权利要求1所述松材线虫检测试剂盒用于检测松材线虫的方法，包括：

1)线虫DNA的提取将线虫挑入双蒸水中，用解剖刀将线虫切成3段以上；用取液器吸取带有线虫片段的线虫液5μl加入到已装有5μl权利要求1所述溶液I的0.2ml薄壁管中；将0.2ml薄壁管置于-20℃～-80℃冷冻3h～10min；冷冻后再将薄壁管在65℃下温育至少2h，最后94℃下保温10min；12000g离心4min即得到单条线虫DNA；

2)松材线虫PCR检测吸取所得的单条线虫的DNA 5μl作为PCR反应的模板进行PCR反应；按下列组成在PCR反应管中调制反应液，15μl反应体积包括：

溶液II      7.5μl

ddH₂O     2.4μl

Taq酶       0.1μl

DNA         5μl

3)在进行单条线虫扩增的同时还应进行松材线虫和拟松材线虫对照DNA的扩增反应，此时加入的模板体积为1μl，而ddH₂O体积为6.4μl；

4)PCR反应程序

94℃变性10分钟；进入循环，94℃变性45秒，52℃退火45秒，72℃延伸1分钟，40个循环；最后72℃延伸10分钟；

5)反应结束后，取反应液5-10μl在1.5％的琼脂糖中电泳，与对照DNA的扩增片段比较，松材线虫扩增片段约为850bp，拟松材线虫扩增片段约为350bp，故当发现样本的扩增片段为850bp时则样本为松材线虫，如样本的扩增片段为350bp时则为拟松材线虫。