CN102459567A - 分离细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于从样品中分离细胞的方法和试剂盒。用包含至少MgCl₂和/或离子液体的提取液处理样品，这导致分离优选活细胞。

Description

分离细胞的方法

本发明涉及用于从样品中分离细胞的方法和试剂盒。用包含至少MgCl₂和/或离子液体的提取液处理样品，这导致分离优选活细胞。

发明背景

从复杂样品中分离细胞用于其鉴定或表征或简单地进一步用于处理变得越来越重要，尤其是鉴定样品中的病原体，所述样品如食品样品或临床样品，如血液、组织或粪便。然而，为了明确鉴定并任选定量测定包含在样品中的细胞，必须提供用于分离细胞的方法。

一般而言，实时PCR大大地提高了PCR作为分子生物学中的定量工具和用于定量测定及鉴定微生物(尤其病原体)的实际应用范围。实时PCR使得每个PCR反应可可靠地检测和定量到一个单核苷酸靶标，但要求高度纯化的模板DNA。特别是当将其用于如食品等复杂环境中细菌的常规诊断和定量检测时，这些要求起到重要作用，因为这些环境成分引起的抑制作用可影响或甚至抑止PCR反应。此外，用于从如食品等复杂样品中分离目标生物体，使用可靠和有效回收方法是至关重要的。由于如食品等样品通常涉及大样品容量，因此通常用微生物学方法来分离和富集微生物。这些方法代表″金标准″方法，新备选技术必须与它们比较进行评估。

为了建立用于从食品分离微生物(例如细菌)的满足实时PCR及用于微生物下游分析的其它分子方法的高要求的方法，已作出大量努力。

亦尝试使用常用于分子生物学的DNA分离方法直接从食品中分离DNA。其它方法利用生物分子对微生物表面结构的亲和力，其中所述生物分子可以是例如任选与磁珠、硅烷化载玻片或直接集菌落印迹结合的抗体、来自噬菌体的细菌结合蛋白和抗菌肽(AMP)。例如，为了直接检测单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)，可以使用水性两相分离系统(Lantz等，Appl Environ Microbiol.(1994)60：3416-3418)。

据报道浮力密度梯度离心为用于从食品基质中分离细菌的工具(Wolffs P.等，Appl Environ Microbiol.(2005)71：5759-5764)。其它方法基于物理分离，如简单的离心和过滤。亦阐述了以下方法：使用蛋白酶K和链霉蛋白酶进行食品基质的酶消化方法，和/或使用硫氰酸胍/苯酚/氯仿、二乙基醚/氯仿和柠檬酸钠/聚乙二醇从食品中化学提取细菌的方法。目前用于从复杂样品中分离细胞尤其是微生物的方法阐述于例如Stevens KA和Jaykus L-A(Crit Rev Microbiol(2004)30：7-24)中。

这些方法中大多数有缺点，如处理的样品体积不够大、高检测限、低回收率、不能定量分离活细胞、程序耗时和高费用。另外，在大部分情况下这些方法的应用限制于仅仅一种或有限数量的不同食品基质。基于直接定量食品中细菌的以下要求必须提供用于分离细胞和微生物(如食品病原体单核细胞增生李斯特菌)的新方案：(i)大样品体积；(ii)大范围靶标浓度内的可再现回收率；和(iii)除去抑制剂以助于用于下游分析的备选分子方法。

WO 2008/017097揭示用于从复杂基质如食品分离细胞的方法。该方法使用包含与去污剂组合的离液剂的提取缓冲液。

食品分析中的另一个关键问题是确定污染细菌的生存力。迄今为止，大部分方法不能区分活的和死的细菌细胞。另外，为裂解食品样品通常复杂的基质，需要对从所述样品中分离的生存力有负面影响的裂解条件。该问题减少了使用例如用于食品分析的常规监测的PCR方法的益处。一方面，某些细胞在提取过程中被杀死，另一方面，在提取前存在于样品中的代谢损伤的细胞或不能存活细胞也被提取和鉴定，但是它们对于样品质量没有任何其他影响。

O.F.D′Urso等，Food Microbiology 26(2009)311-316开发了基于过滤的分离活细胞的方法。该方法中使用的缓冲液包含大量离液剂硫氰酸胍，硫氰酸胍经常干扰下游处理，并因此不得不用复杂的洗涤程序除去。

因此，明显需要用于从如食品和血液等复杂基质中分离细胞且可能是分离活细胞的定量和可重复的方法。

发明简述

业已发现可用包含至少氯化镁(MgCl₂)和/或离子液体的缓冲液，容易地并极为有效地从复杂基质中分离如细菌等细胞污染物。另外，由于极为温和但有效的提取条件，该方法允许分离活细胞。

因此，本发明涉及用于从复杂样品中分离细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供复杂样品；

b)将所述样品与包含至少MgCl₂和/或离子液体的提取液一起孵育；

c)优选通过离心、亲和结合和/或过滤从步骤b)的混合物分离所述细胞。

本发明还涉及用于从复杂样品中分离细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：

-包含至少MgCl₂和/或离子液体的提取液；和

-至少一种生物降解酶。

发明说明

出乎意料的结果是，复杂样品与包含至少MgCl₂和/或离子液体的提取液一起孵育，导致样品溶解而不影响在所述样品中包含的含有细胞壁或细胞壁围绕的细胞。因此，本发明方法能够合适地用于分离所述细胞。

根据本发明，可优选将所述方法用于分离细胞壁围绕的细胞，此处术语″细胞壁围绕的细胞″，指所有已知具有或包含细胞壁作为对环境的屏障的细胞。具有细胞壁的生物体或细胞的实例是细菌、古生菌、真菌、植物和藻类。与其相反，动物和大部分其它原生生物具有细胞膜而没有围绕的细胞壁。

术语″复杂样品″指包含或多或少数目的不同主要有机来源的化合物的样品或样品基质，其中某些是液体，其它是固体。本发明的复杂样品可包括包含肽、多肽、蛋白质(也包括酶)、碳水化合物(复杂的和简单的碳水化合物)、脂质、脂肪酸、脂肪、核酸等的基质。本发明样品优选包含少量纤维/淀粉。

本文所用术语″含少量纤维/淀粉的样品″以广义使用，旨在包括含有或可能含有细胞的各种样品。

优选样品包含少于20％(w/w)、更优选少于10％、更优选少于5％、特别优选少于1％、尤其是没有(低于或在检测限周围)纤维/淀粉。本文所用″纤维″包含植物以及动物(如胶原纤维)来源的纤维。

例示性样品包括但不限于：食品，例如奶牛、母绵羊、雌山羊、母马、驴、骆驼、牦牛、水牛和驯鹿等的奶，乳制品，牛肉、山羊、羔羊、成羊肉、猪肉、田鸡腿、小牛肉、啮齿动物、马、袋鼠、禽类(包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鸽(pigeon or dove)、鸵鸟、鸸鹋)、海鲜包括长须鲸例如鲑鱼和罗非鱼以及贝类如软体动物和甲壳类动物和蜗牛的肉，肉产品，植物产品；种子；禾本科谷物，包括玉米、小麦、大米、大麦、高粱和小米；非禾本科谷物，包括荞麦、苋菜和昆诺阿藜；豆类，包括扁豆、花生、豌豆和小扁豆；坚果，包括杏仁、核桃和松仁；含油种子，包括向日葵、油菜和芝麻；蔬菜如，根菜，包括马铃薯、木薯和芜菁；叶菜，包括苋菜、菠菜和羽衣甘蓝；海洋蔬菜，包括红皮藻、昆布和翅菜(dabberlocks)；茎菜，包括竹笋、胭脂仙人掌(nopales)和芦笋；花序蔬菜，包括洋蓟、花椰菜和金针；以及果菜，包括南瓜、黄秋葵和茄子；水果；草本植物和香料；全血、尿、痰、唾液、羊水、血浆、血清、肺灌洗液；和组织，包括但不限于肝、脾、肾、肺、肠、脑、心脏、肌肉、胰腺等等。技术人员应明白，自上述任何例示性样品或所述例示性样品混合物获得的裂解物、提取物或(匀浆的)材料或包含一种或多种例示性样品的组合物，亦为本发明范围内的样品。

本文所用术语″缓冲液″，指当将酸或碱加入到溶液或组合物中时抵抗pH变化的水溶液或组合物。这种对pH变化的抗性是由于这种溶液的缓冲性质。因此，表现缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般没有保持溶液或组合物pH的无限能力。相反，它们通常能够将pH值保持在一定范围内，例如保持在pH 7-pH 9之间。通常缓冲液能够保持pH在其pKa上下一个log范围内(参见例如，C.Mohan，Buffers，A guide for the preparation and use of buffers inbiological systems，CALBIOCHEM，1999)。通常自缓冲盐或优选自非-离子缓冲组分如TRIS和HEPES制备缓冲液和缓冲溶液。加入到提取液中的缓冲液保证基质溶解过程中的pH值稳定。稳定的pH值有助于可重复结果、有效裂解和分离细胞的保存。

根据本发明的优选实施方案，分离细胞为活细胞。

令人惊讶地发现，用本发明方法分离的细胞为活细胞(占分离的全部完整细胞的至少10％、优选至少30％、更优选至少50％、甚至更优选至少70％、最优选至少90％)，并可在适当的培养基中培育。

本文所用″活细胞″包括具有活性新陈代谢的细胞，优选可增殖，特别是能够繁殖的细胞。

用本发明方法分离的细胞是细菌细胞(优选革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌细胞)、真菌细胞、古生菌细胞、藻类细胞或植物细胞。特别优选选自以下的细胞：李斯特氏菌属(Listeria spp.)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、P.paratuberculosis、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)和娄地青霉(Penicillum roquefortii)。

本发明方法允许分离具有或包含细胞壁的细胞。

本发明特别允许分离一般的微生物细胞，优选食品和病原微生物，特别是与人相关的微生物，例如可能存在于人食品中的微生物或与临床相关的病原体。因此，本发明方法允许从高度复杂的样品(如食品)中分离细菌细胞、真菌细胞、古生菌细胞、藻类细胞和植物细胞。

根据本发明的优选实施方案，所述样品为食品样品、体液，尤其是血液、血浆或血清、水或组织样品。

特别优选的样品是具有复杂基质(即尤其包含蛋白质、脂类、碳水化合物等)和/或高粘度的样品。

食品样品优选为：乳制品，优选奶，尤其鲜奶、奶粉、酸奶、干酪或冰淇淋；鱼产品，优选生鱼；肉产品，优选生肉、肉酱(meat rinse)或香肠；沙拉酱(salad rinse)、巧克力；蛋或蛋产品，如蛋黄酱。

特别优选用于本发明方法的食品样品是通常已知包含可能的病原生物体(如单核细胞增生李斯特菌)的样品，以及由于复杂的基质用本领域已知方法从中几乎不能提取细胞的样品。尤其干酪是已知有复杂基质和高粘度的食品。

根据本发明，作为基质溶解系统使用的提取液包含MgCl₂和/或离子液体。如果存在，那么MgCl₂通常以0.5-3M、优选0.5-2M、更优选1-2M的浓度存在。

如果存在，那么离子液体通常以基于混合物重量的0.5-20％重量、优选1-10％重量的浓度存在。离子液体可以是一种离子液体或两种以上离子液体的混合物。

MgCl₂和/或离子液体的最佳浓度主要视待溶解的样品和待分离的细胞种类而定。这些参数易于由本领域技术人员测试。

在优选实施方案中，提取液包含MgCl₂或离子液体。

本发明提取液为水溶液或缓冲溶液。其通常具有大于5和小于9的pH值，优选大于6和小于8，更优选6.5-7.5之间。提取液可另外包含可达20％的一种或多种水混溶性有机溶剂。

可用于本发明方法的缓冲液优选选自以下：磷酸缓冲液、磷酸缓冲盐缓冲液(PBS)、2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐缓冲液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。

与已知方法相反，本发明方法优选无去污剂，意即不将离子去污剂、两性离子去污剂或非离子去污剂(如十二烷基硫酸钠、CHAPS、Lutensol AO-7)加入到提取液中。

当然将一种或多种添加物加入到提取液中是可能的，添加物如去稳定剂或有助于降解存在于特定样品中的物质的生物聚合物降解酶。如以下所论述，一个实施例是将淀粉降解酶加到包含大量胶原和/或淀粉的食品样品中。

通常在18℃-50℃、优选25℃-45℃、更优选30℃-42℃的温度实施孵育。

样品通常与提取液孵育10分钟-6小时、优选20分钟-1小时的时间。

为了更加有效并以缩短时间溶解样品，在升高的温度下实施孵育有利。然而，应注意视需要，升高的温度不可以影响待分离细胞的生存力。

样品与提取液孵育并由此溶解和裂解样品基质后，可通过任何已知方法分离细胞，所述方法例如离心、过滤、介电电泳和超声或亲和结合，亲和结合例如用优选固定在珠粒上的抗体、凝集素、病毒结合蛋白、适配体或抗菌肽(AMP)。优选通过过滤或离心来分离细胞，最优选通过离心。

离心通常在500-10000g、更优选在1500-6000g、甚至更优选在2000-5000g进行。离心步骤后，可在沉淀中发现细胞，并可弃掉上清液。

如果过滤样品/提取液混合物，那么在过滤器的孔径与待分离的细胞大小相适应时，细胞留在所述过滤器表面。当然，也可以使用有不同孔径的不同过滤器进行不止一次过滤步骤。过滤步骤后，可从过滤器表面洗涤细胞(参见例如Stevens KA和Jaykus L-A，Crit RevMicrobiol(2004)30：7-24)。当复杂样品包含几乎不能或不能用本发明方法裂解的材料时，尤其需要过滤裂解的样品。通常这些材料包含淀粉和/或纤维。

然而，用于从裂解混合物分离细胞的优选方法是离心。

当然，也可能从在离心步骤后形成的溶解的沉淀分离细胞，其通过用涉及抗体的免疫学方法，尤其是固定在珠粒(优选磁珠)上的抗体，所述抗体针对待分离细胞上存在的表位。因为使用分离细胞的抗体珠粒在某些情况下造成回收率降低，所以所述方法可优选主要用于定性分离。

为有助于溶解样品，所述样品可在例如与提取液孵育前用stomacher匀浆。当在孵育过程中搅动样品/提取液混合物时，进一步支持和/或加速溶解。

视样品基质而定，孵育步骤可以重复一次或几次，例如两次、三次、四次、五次或十次。在这些孵育步骤之间，细胞和残余样品基质可通过例如离心与上清液分离。

可将用本发明方法分离的细胞用于定量或定性测定样品中的细胞。这可通过例如以下方法来实现：细胞计数；PCR方法，尤其是实时PCR；用凝集素；或用涉及针对所述细胞表面结构的抗体、病毒结合蛋白、适配体或抗菌肽(AMP)的方法(如细胞特异性ELISA或RIA)。

分离步骤后优选用水、缓冲溶液和/或包含去污剂的溶液洗涤细胞。然而，在洗涤缓冲液中加入一种或多种添加物当然是可能的。洗涤步骤可以重复若干次(例如2、3、4、5或10次)或仅仅一次。在洗涤步骤过程中，通常将细胞重新悬浮在缓冲液中并随后过滤或离心。如果在溶解样品中存在不溶颗粒(例如干酪中的磷酸钙颗粒)，那么可通过低转速离心或通过颗粒随时间沉降来去掉所述颗粒(在两种情况下细胞都保留在上清液中)。

也可用包含去污剂的溶液洗涤细胞。这将允许进一步除去可能包含在细胞悬液中的脂肪残余物。在该方法步骤中使用的优选去污剂是那些常规用于脂肪除去的去污剂。

本发明方法的一个优势是提取液只包含中等浓度的MgCl₂和/或离子液体而不包含去污剂。结果，相比于提取缓冲液通常包含去污剂和大量离液剂的已知方法，如果样品基质允许，意即如果所述基质不包含例如需要用包含去污剂的洗涤缓冲液除去的脂肪残余物，则可省去或显著减少洗涤步骤。本方法的这一特征使可能缩短提取时间，并使可能在仅仅一次或两次洗洗涤步骤后就可直接或至少近乎直接用在其它情况下会受离液物质或去污剂的存在干扰的方法(如ELISA)来分析细胞。

由于优选提取液中不存在去污剂的事实，直接用与优选固相支持体(如珠粒，尤其磁珠)结合的抗体分离细胞也是可能的。细胞与抗体的结合允许特异性分离特定类型的细胞。当样品包含多于一个细胞种类时，这尤其令人关注。

根据本发明优选实施方案，测定样品中的细胞数量。

可通过本领域已知的任何方法来测定样品中的细胞数量，尤其是通过微生物学方法(如系列稀释)、细胞计数、FACS分析、实时PCR等。

根据本发明另一优选实施方案，分离细胞DNA或RNA。

视细胞而定，可采取各种方法用于提取DNA(如基因组DNA、质粒)或RNA(如mRNA)。本领域已知所有这些方法，单个方案主要取决于待裂解的细胞。分离可能进一步要求加入例如溶菌酶等酶。

为了增加样品的裂解，尤其高粘度样品(如干酪)，在与提取液孵育前用stomacher或混合器处理所述样品。

为了测定或监测分离程序的效率，样品可掺入规定量的对照细胞。对照细胞通常为细菌细胞(优选革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌细胞)、真菌细胞、古生菌细胞、藻类细胞或植物细胞。优选其与假设存在于样品中的细胞相似，但优选其与假设存在于样品中的细胞不相同。回收的掺入的对照细胞的数量使得可测定本发明方法的效率，并还可以表明初始样品中存在的待分离及待测定的细胞数量。

亦可将样品与对细胞表现渗透胁迫保护特性的化合物预孵育。

为了提高细胞对渗透胁迫的抗性，包含(可能的)待分离细胞的样品可以与至少一种能够在所述细胞中诱导渗透保护反应的化合物一起孵育。

表现所述特性并优选用于本发明方法的化合物是甜菜碱和/或β-赖氨酸。

根据本发明的一个实施方案，样品进一步与至少一种生物聚合物降解酶一起孵育。

从其中分离出细胞的某些样品包含生物聚合物结构，通过加入提取液不可或仅以低效率方式裂解生物聚合物。如果样品尤其食品样品，例如包含例如超过10％的胶原和/或淀粉的量，则所述样品在与本发明的基质裂解系统孵育前可用能够至少部分降解胶原和淀粉成分的物质处理。

因此，样品优选进一步与至少一种生物聚合物降解酶一起孵育。优选与生物聚合物降解酶孵育的样品为例如肉、鱼等。冰淇淋、蛋、血、奶、乳制品等通常不需要加入生物聚合物降解酶。令人惊讶的结果是，单独使用酶不能使得分离细胞。

本文所用术语″生物聚合物″，指蛋白质、多肽、核酸、诸如纤维素、淀粉和糖原等多糖。因此，″生物聚合物降解酶″是能将可能不溶于水性缓冲液的生物聚合物(如淀粉、纤维素)降解为低分子物质或甚至单体的酶。因为生物聚合物降解酶可在特定pH和温度条件下有活性(使用特定缓冲液也可以起作用)，所以在任选条件下与所述酶孵育是有利的。这些条件视所用的酶而定，且在本领域为已知。孵育时间也视外在因素如pH和温度而定。因此孵育时间可以在10秒-6小时之间变化，优选30秒-2小时。

生物聚合物降解酶优选选自蛋白酶、纤维酶和淀粉酶。这些酶的实例是Savinase 24 GTT(枯草菌素)、Carenzyme 900T、Stainzyme GT。淀粉降解酶为例如环糊精葡聚糖转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶和异淀粉酶，特别是α-淀粉酶。

在使用包含离液剂和去污剂的缓冲液的已知方法中，不能在基质裂解步骤期间加入生物聚合物降解酶，因为离液剂和去污剂可以负面影响酶活性，使得生物聚合物不能有效降解为片段或单体。

与此相反，在本发明方法中，可在步骤b)之前和/或步骤b)期间和/或步骤c)之后将生物聚合物降解酶与样品一起孵育(步骤b)为其中样品与提取液一起孵育的裂解步骤，而步骤c)为分离步骤)。

可在几个小时内通常是1-6小时内实施本发明方法。

本发明中所用的离子液体或液体盐是由有机阳离子和通常无机阴离子构成的离子物类。它们不含有任何中性分子，并通常具有低于373K的熔点。

离子液体领域目前正加紧研究，因为其可能的应用是多方面的。关于离子液体的综述论文为例如：R.Sheldon″Catalytic reactions inionic liquids(离子液体中的催化反应)″，Chem.Commun.，2001，2399-2407；M.J.Earle，K.R.Seddon″Ionic liquids.Green solvent for thefuture(离子液体，未来的绿色溶剂)″，Pure Appl.Chem.，72(2000)，1391-1398；P.Wasserscheid，W.Keim″Ionische Flüssigkeiten-neue

für die

[Ionic Liquids-NovelSolutions for Transition-Metal Catalysis(离子液体-用于过渡金属催化的新型溶液)]，Angew.Chem.，112(2000)，3926-3945；T.Welton″Roomtemperature ionic liquids.Solvents for synthesis and catalysis(室温离子液体，用于合成及催化的溶剂)″，Chem.Rev.，92(1999)，2071-2083；或R.Hagiwara，Ya.lto  ″Room temperature ionic liquids ofalkylimidazolium cations and fluoroanions (烷基咪唑阳离子及氟代阴离子的室温离子液体)″，J.Fluorine Chem.，105(2000)，221-227)。

一般情况下，本领域技术人员已知的所有通式K⁺A^-离子液体，尤其是与水混溶的离子液体，适于本发明方法。

离子液体的阴离子A^-优选选自：卤化物、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐、氰胺、硫氰酸盐或通式[N(R_f)₂]^-或通式[N(XR_f)₂]^-的酰亚胺，其中R_f代表具有1至8个C原子的部分地或完全被氟-取代的烷基，X代表SO₂或CO。本文卤化物阴离子可选自氯化物、溴化物和碘化物阴离子，优选氯化物和溴化物阴离子。离子液体的阴离子A^-优选为卤化物阴离子，尤其溴化物和碘化物阴离子，或四氟硼酸盐或氰胺或硫氰酸盐。

有关离子液体的阳离子K⁺的选择本身没有限制。然而，优选有机阳离子，尤其优选的是铵、鏻、脲硫脲

胍

或杂环阳离子。

铵阳离子可例如通过式(1)来描述：

[NR₄]⁺    (1)，

其中

在所有情况下R都彼此独立，其代表：

H，其中不能所有取代基R同时为H；

OR′、NR′₂，前提为式(1)中至多一个取代基R为OR′、NR′₂；

具有1-20个C原子的直链或支链烷基；

具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或支链烯基；

具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或支链炔基；

具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以被具有1-6个C原子的烷基取代，其中一个或多个R可部分或完全被卤素取代，尤其-F和/或-Cl，或部分被-OH、-OR′、-CN、-C(O)OH、-C(O)NR′₂、-SO₂NR′₂、-C(O)X、-SO₂OH、-SO₂X、-NO₂取代，且R中不是在α-位置的一个或两个非相邻碳原子可被选自以下的原子和/或原子基团置换：-O-、-S-、-S(O)-、-SO₂-、-SO₂O-、-C(O)-、-C(O)O-、-N⁺R′₂-、-P(O)R′O-、-C(O)NR′-、-SO₂NR′-、-OP(O)R′O-、-P(O)(NR′₂)NR′-、-PR′₂＝N-或-P(O)R′-，其中R′可＝H、未氟化、部分氟化或全氟化的C₁-至C₆-烷基、C₃-至C₇-环烷基、未取代或取代的苯基，且X可＝卤素。

鏻阳离子可例如通过式(2)阐述：

[PR² ₄]⁺  (2)，

其中

在所有情况下R²彼此独立，其表示：

H、OR’或NR′₂；

具有1-20个C原子的直链或支链烷基；

具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或支链烯基；

具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或支链炔基；

具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以被具有1-6个C原子的烷基取代，其中一个或多个R²可部分或完全被卤素取代，尤其-F和/或-Cl，或部分被-OH、-OR′、-CN、-C(O)OH、-C(O)NR′₂、-SO₂NR′₂、-C(O)X、-SO₂OH、-SO₂X、-NO₂取代，且R²中不在α-位置的一个或两个非相邻碳原子可被选自以下的原子和/或原子基团置换：-O-、-S-、-S(O)-、-SO₂-、-SO₂O-、-C(O)-、C(O)O-、-N⁺R′₂-、-P(O)R′O-、-C(O)NR′-、-SO₂NR′-、-OP(O)R′O-、-P(O)(NR′₂)NR′-、-PR′₂＝N-或-P(O)R′-，其中R′为H、未氟化、部分氟化或全氟化的C₁-至C₆-烷基、C₃-至C₇-环烷基、未取代或取代的苯基，且X＝卤素。

然而，排除其中所有四个或三个取代基R和R²完全被卤素取代的式(1)和(2)中的阳离子，所述情况例如三(三氟甲基)甲基铵阳离子、四(三氟甲基)铵阳离子或四(九氟丁基)铵阳离子。

脲

阳离子可例如通过式(3)阐述：

[(R³R⁴N)-C(＝OR⁵)(NR⁶R⁷)]⁺    (3)，

而硫脲

阳离子通过式(4)阐述：

[(R³R⁴N)-C(＝SR⁵)(NR⁶R⁷)]⁺    (4)，

其中

R³至R⁷各自彼此独立地表示

氢，其中对于R⁵排除氢；

具有1-20个C原子的直链或支链烷基；

具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或支链烯基；

具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或支链炔基；

具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以被具有1-6个C原子的烷基取代，其中取代基R³至R⁷中的一个或多个可部分或完全被卤素取代，尤其-F和/或-Cl，或部分被-OH、-OR′、-CN、-C(O)OH、-C(O)NR′₂、-SO₂NR′₂、-C(O)X、-SO₂OH、-SO₂X、-NO₂取代，且R³至R⁷中不在α-位置的一个或两个非相邻碳原子可被选自以下的原子和/或原子基团置换：-O-、-S-、-S(O)-、-SO₂-、-SO₂O-、-C(O)-、C(O)O-、-N⁺R′₂-、-P(O)R′O-、-C(O)NR′-、-SO₂NR′-、-OP(O)R′O-、-P(O)(NR′₂)NR′-、-PR′₂＝N-或-P(O)R′-，其中R′＝H、未氟化、部分氟化或全氟化的C₁-至C₆-烷基、C₃-至C₇-环烷基、未取代或取代的苯基，且X＝卤素。

胍

阳离子可例如通过式(5)来阐述：

[C(NR⁸R⁹)(NR¹⁰R¹¹)(NR¹²R¹³)]⁺    (5)，

其中

R⁸至R¹³各自彼此独立地表示：

氢、-CN、NR′₂、-OR′；

具有1-20个C原子的直链或支链烷基；

具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或支链烯基；

具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或支链炔基；

具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以被具有1-6个C原子的烷基取代，其中取代基R⁸至R¹³中的一个或多个可部分或完全被卤素取代，尤其-F和/或-Cl，或部分被-OH、-OR′、-CN、-C(O)OH、-C(O)NR′₂、-SO₂NR′₂、-C(O)X、-SO₂OH、-SO₂X、-NO₂取代，且R⁸至R¹³中不在α-位置的的一个或两个非相邻碳原子可被选自以下的原子和/或原子基团置换：-O-、-S-、-S(O)-、-SO₂-、-SO₂O-、-C(O)-、C(O)O-、-N⁺R′₂-、-P(O)R′O-、-C(O)NR′-、-SO₂NR′-、-OP(O)R′O-、-P(O)(NR′₂)NR′-、-PR′₂＝N-或-P(O)R′-，其中R′＝H、未氟化、部分氟化或全氟化的C₁-至C₆-烷基、C₃-至C₇-环烷基、未取代或取代的苯基，且X＝卤素。

此外，可利用通式(6)的阳离子

[HetN]⁺    (6)，

其中

HetN⁺表示选自以下基团的杂环阳离子：

其中取代基R¹′至R⁴′各彼此独立地表示：

氢、-CN、-OR′、-NR′₂、-P(O)R′₂、-P(O)(OR′)₂、-P(O)(NR′₂)₂、-C(O)R′、-C(O)OR′；

具有1-20个C原子的直链或支链烷基；

具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或支链烯基；

具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或支链炔基；

具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以被具有1-6个C原子的烷基取代；

饱和、部分或完全不饱和的杂芳基、杂芳基-C₁-C₆-烷基或芳基-C₁-C₆-烷基；

其中取代基R^1′、R^2′、R^3′和/或R^4′一起也可形成环状系统；

其中一个或多个取代基R^1′至R^4′可部分或完全被卤素取代，尤其-F和/或-Cl，或部分或完全被-OH、-OR′、-CN、-C(O)OH、-C(O)NR′₂、-SO₂NR′₂、-C(O)X、-SO₂OH、-SO₂X、-NO₂取代，但R^1′和R^4′不能同时被卤素完全取代，且在取代基R^1′至R^4′中，未与杂原子键合的一个或两个非相邻碳原子可被选自以下的原子和/或原子基团置换：-O-、-S-、-S(O)-、-SO₂-、-SO₂O-、-C(O)-、C(O)O-、-N⁺R′₂-、-P(O)R′O-、-C(O)NR′-、-SO₂NR′-、-OP(O)R′O-、-P(O)(NR′₂)NR′-、-PR′₂＝N-或-P(O)R′-，其中R′＝H、未氟化、部分氟化或全氟化的C₁-至C₆-烷基、C₃-至C₇-环烷基、未取代或取代的苯基，且X＝卤素。

为本发明目的，亦用完全不饱和取代基来意指芳香取代基。

根据本发明，式(1)至(5)化合物的适当的取代基R和R²至R¹³，除氢以外优选为：C₁-至C₂₀-，尤其C₁-至C₁₄-烷基；饱和或不饱和(即含芳香的)C₃-至C₇-环烷基，其可被C₁-至C₆-烷基尤其是苯基取代。

式(1)或(2)化合物中的取代基R和R²在本文中可相同或不同。取代基R和R²优选不同。

取代基R和R²特别优选甲基、乙基、异丙基、丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、癸基或十四烷基。

胍

阳离子[C(NR⁸R⁹)(NR¹⁰R¹¹)(NR¹²R¹³)]⁺的至多四个取代基也可以以形成单、双或多环阳离子的方式成对键合。

不限制其通用性，所述胍

阳离子的实例为：

其中取代基R⁸至R¹⁰和R¹³可具有上述含义或特别优选的含义。

视需要，上述胍

阳离子的碳环或杂环也可以被以下基团取代：C₁-至C₆-烷基、C₁-至C₆-烯基、NO₂、F、Cl、Br、I、OH、C₁-C₆-烷氧基、SCF₃、SO₂CF₃、COOH、SO₂NR′₂、SO₂X′或SO₃H(其中X和R′具有上述含义)、取代或未取代的苯基或者未取代或取代的杂环。

脲

阳离子[(R³R⁴N)-C(＝OR⁵)(NR⁶R⁷)]⁺或硫脲

阳离子[(R³R⁴N)-C(＝SR⁵)(NR⁶R⁷)]⁺的至多四个取代基也可以以形成单、双或多环阳离子的方式成对键合。

不限制通用性，所述阳离子的实例如下所述，其中Y＝O或S：

其中取代基R³、R⁵和R⁶可具有上述含义或特别优选含义。

视需要，上述阳离子的碳环或杂环也可以被以下基团取代：C₁-至C₆-烷基、C₁-至C₆-烯基、NO₂、F、Cl、Br、I、OH、C₁-C₆-烷氧基、SCF₃、SO₂CF₃、COOH、SO₂NR′₂、SO₂X′或SO₃H或取代或未取代的苯基或者未取代或取代的杂环，其中X和R′具有上述含义。

取代基R³至R¹³各彼此独立优选为具有1至10个C原子的直链或支链烷基。式(3)至(5)化合物中的取代基R³和R⁴、R⁶和R⁷、R⁸和R⁹、R¹⁰和R¹¹及R¹²和R¹³可以相同或不同。R³至R¹³尤其优选各彼此独立为：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、苯基或环己基，非常特别优选甲基、乙基、正丙基、异丙基或正丁基。

根据本发明，式(6)化合物的适当取代基R^1’至R^4’，除氢以外优选为：C₁-至C₂₀，尤其C₁-至C₁₂-烷基；和饱和或不饱和(即亦含芳香的)C₃-至C₇-环烷基，其可以被C₁-至C₆-烷基尤其是苯基取代。

取代基R^1′和R^4′尤其优选各彼此独立为甲基、乙基、异丙基、丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、癸基、环己基、苯基或苯甲基。其极特别优选为甲基、乙基、正丁基或己基。在吡咯烷

哌啶

或吲哚烷

化合物中，两个取代基R^1’和R^4’优选不同。

取代基R^2’或R^3’在所有情况下彼此独立地尤其为氢、甲基、乙基、异丙基、丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、环己基、苯基或苯甲基。R²特别优选为氢、甲基、乙基、异丙基、丙基、丁基或仲丁基。R²和R³极特别优选氢。

C₁-C₁₂-烷基为例如：甲基、乙基、异丙基、丙基、丁基、仲丁基或叔丁基，此外也为戊基、1-、2-或3-甲基丁基、1，1-、1，2-或2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基或十二烷基。任选为二氟甲基、三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基或九氟丁基。

其中还可存在多个双键的具有2-20个C原子的直链或支链烯基为例如：烯丙基、2-或3-丁烯基、异丁烯基、仲丁烯基，此外，4-戊烯基、异戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、-C₉H₁₇、-C₁₀H₁₉至-C₂₀H₃₉；优选烯丙基、2-或3-丁烯基、异丁烯基、仲-丁烯基，此外优选4-戊烯基、异戊烯基或己烯基。

其中还可存在多个三键的具有2-20个C原子的直链或支链炔基为例如：乙炔基、1-或2-丙炔基、2-或3-丁炔基，此外，4-戊炔基、3-戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、-C₉H₁₅、-C₁₀H₁₇至-C₂₀H₃₇，优选乙炔基、1-或2-丙炔基、2-或3-丁炔基、4-戊炔基、3-戊炔基或己炔基。

芳基-C₁-C₆-烷基代表例如苯甲基、苯基乙基、苯基丙基、苯基丁基、苯基戊基或苯基己基，其中苯环也和烯链二者可以部分地或完全如上所述被卤素取代，尤其-F和/或-Cl，或部分被以下基团取代：-OH、-OR′、-CN、-C(O)OH、-C(O)NR′₂、-SO₂NR′₂、-C(O)X、-SO₂OH、-SO₂X、-NO₂。

因此，具有3-7个C原子的不被取代的饱和或部分或完全不饱和的环烷基为：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环戊烯基、环戊-1，3-二烯基、环己烯基、环己-1，3-二烯基、环己-1，4-二烯基、苯基、环庚烯基、环-庚-1，3-二烯基、环庚-1，4-二烯基或环庚-1，5-二烯基，其各可被C₁-至C₆-烷基取代，其中环烷基或被C₁-至C₆-烷基取代的环烷基也可进而被卤素原子取代，例如F、Cl、Br或I，特别是F或Cl，或被-OH、-OR′、-CN、-C(O)OH、-C(O)NR′₂、-SO₂NR′₂、-C(O)X、-SO₂OH、-SO₂X、-NO₂取代。

在取代基R、R²至R¹³或R^1’至R^4’中，没有在α-位与杂原子键合的一个或两个非相邻碳原子亦可被以下原子和/或原子基团置换：-O-、-S-、-S(O)-、-SO₂-、-SO₂O-、-C(O)-、-C(O)O-、-N⁺R′₂-、-P(O)R′O-、-C(O)NR′-、-SO₂NR′-、-OP(O)R′O-、-P(O)(NR′₂)NR′-、-PR′₂＝N-或-P(O)R′-，其中R′＝未氟化、部分氟化或全氟化的C₁-至C₆-烷基、C₃-至C₇-环烷基、未取代或取代的苯基。

不限制通用性，以该方式修饰的取代基R、R²至R¹³和R^1’至R^4’的实例为：

-OCH₃、-OCH(CH₃)₂、-CH₂OCH₃、-CH₂-CH₂-O-CH₃、-C₂H₄OCH(CH₃)₂、-C₂H₄SC₂H₅、-C₂H₄SCH(CH₃)₂、-S(O)CH₃、-SO₂CH₃、-SO₂C₆H₅、-SO₂C₃H₇、-SO₂CH(CH₃)₂、-SO₂CH₂CF₃、-CH₂SO₂CH₃、-O-C₄H₈-O-C₄H₉、-CF₃、-C₂F₅、-C₃F₇、-C₄F₉、-C(CF₃)₃、-CF₂SO₂CF₃、-C₂F₄N(C₂F₅)C₂F₅、-CHF₂、-CH₂CF₃、-C₂F₂H₃、-C₃FH₆、-CH₂C₃F₇、-C(CFH₂)₃、-CH₂C(O)OH、-CH₂C₆H₅、-C(O)C₆H₅或P(O)(C₂H₅)₂。

在R′中，C₃-至C₇-环烷基为例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。

在R′中，取代的苯基代表被以下基团取代的苯基：C₁-至C₆-烷基、C₁-至C₆-烯基、NO₂、F、Cl、Br、I、OH、C₁-C₆-烷氧基、SCF₃、SO₂CF₃、COOH、SO₂X′、SO₂NR″₂或SO₃H，其中X′代表F、Cl或Br，R″代表对于R′所定义的未氟化、部分氟化或全氟化的C₁-至C₆-烷基或C₃-至C₇-环烷基，例如为：邻-、间-或对-甲基苯基、邻-、间-或对-乙基苯基、邻-、间-或对-丙基苯基、邻-、间-或对-异丙基苯基、邻-、间-或对-叔丁基苯基、邻-、间-或对-硝基苯基、邻-、间-或对-羟基苯基、邻-、间-或对-甲氧基苯基、邻-、间-或对-乙氧基苯基、邻-、间-、对-(三氟甲基)-苯基、邻-、间-、对-(三氟甲氧基)苯基、邻-、间-、对-(三氟甲基磺酰基)苯基、邻-、间-或对-氟苯基、邻-、间-或对-氯苯基、邻-、间-或对-溴苯基、邻-、间-或对-碘苯基，进一步优选为2，3-、2，4-、2，5-、2，6-、3，4-或3，5-二甲基苯基、2，3-、2，4-、2，5-、2，6-、3，4-或3，5-二羟基-苯基、2，3-、2，4-、2，5-、2，6-、3，4-或3，5-二氟苯基、2，3-、2，4-、2，5-、2，6-、3，4-或3，5-二氯苯基、2，3-、2，4-、2，5-、2，6-、3，4-或3，5-二溴苯基、2，3-、2，4-、2，5-、2，6-、3，4-或3，5-二甲氧基苯基、5-氟-2-甲基苯基、3，4，5-三甲氧基苯基或2，4，5-三甲基苯基。

在R^1’至R^4’中，用杂芳基意指具有5-13个环成员的饱和或不饱和的单环或双环的杂环基，其中可存在1、2或3个N和/或1或2个S或O原子，且杂环基可被以下基团单取代或多取代：C₁-至C₆-烷基、C₁-至C₆-烯基、NO₂、F、Cl、Br、I、OH、C₁-C₆-烷氧基、SCF₃、SO₂CF₃、COOH、SO₂X′、SO₂NR″₂或SO₃H，其中X′和R″具有上述含义。杂环基优选为取代或未取代的以下基团：2-或3-呋喃基、2-或3-噻吩基、1-、2-或3-吡咯基、1-、2-、4-或5-咪唑基、3-、4-或5-吡唑基、2-、4-或5-唑基、3-、4-或5-异唑基、2-、4-或5-噻唑基、3-、4-或5-异噻唑基、2-、3-或4-吡啶基、2-、4-、5-或6-嘧啶基，进一步优选1，2，3-三唑-1-、-4-或-5-基、1，2，4-三唑-1-、-4-或-5-基、1-或5-四唑基、1，2，3-二唑-4-或-5-基、1，2，4-二唑-3-或-5-基、1，3，4-噻二唑-2-或-5-基、1，2，4-噻二唑-3-或-5-基、1，2，3-噻二唑-4-或-5-基、2-、3-、4-、5-或6-2H-硫代吡喃基、2-、3-或4-4H-硫代吡喃基、3-或4-哒嗪基、吡嗪基、2-、3-、4-、5-、6-或7-苯并呋喃基、2-、3-、4-、5-、6-或7-苯并噻吩基、1-、2-、3-、4-、5-、6-或7-1H-吲哚基、1-、2-、4-或5-苯并咪唑基、1-、3-、4-、5-、6-或7-苯并吡唑基、2-、4-、5-、6-或7-苯并唑基、3-、4-、5-、6-或7-苯并异唑基、2-、4-、5-、6-或7-苯并噻唑基、2-、4-、5-、6-或7-苯并异噻唑基、4-、5-、6-或7-苯并-2，1，3-二唑基、1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-或8-喹啉基、1-、3-、4-、5-、6-、7-或8-异喹啉基、1-、2-、3-、4-或9-咔唑基、1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-或9-吖啶基、3-、4-、5-、6-、7-或8-噌啉基、2-、4-、5-、6-、7-或8-喹唑啉基或1-、2-或3-吡咯烷基。

与芳基-C₁-C₆-烷基类似地，采用杂芳基-C₁-C₆-烷基意指例如，吡啶基甲基、吡啶基乙基、吡啶基丙基、吡啶基丁基、吡啶基戊基、吡啶基己基，其中可进一步以该方式将上述杂环基与烯链连接。

HetN⁺优选为：

其中取代基R¹至R⁴各彼此独立具有上述含义。在本发明中特别优选吗啉

和咪唑

阳离子，其中在所述阳离子中的R¹’至R⁴’在所有情况下尤其彼此独立地代表氢、有1-20个C原子的直链或支链烷基，其中一个或多个取代基R¹′至R⁴′可以被-OH或-OR′部分地取代，其中R¹′＝未氟化、部分氟化或全氟化的C₁-到C₆-烷基、C₃-至C₇-环烷基、未取代或取代的苯基。

本发明离子液体的阳离子优选铵、鏻、咪唑

或吗啉阳离子，最优选咪唑

阳离子。

优选的铵、鏻、咪唑

或吗啉阳离子的极特别优选的取代基R、R²、R¹′至R⁴′选自：甲基、乙基、丙基、丁基、己基、癸基、十二烷基、十八烷基、乙氧基乙基、甲氧基乙基、羟基乙基或羟基丙基。

优选咪唑

阳离子被烷基、烯基、芳基和/或芳烷基取代，上述基团本身可以被官能团取代，例如被含有氮、硫和/或磷的基团取代，其中可能存在不同的氧化状态。本发明这些官能团的优选实例为：胺、羧基、羰基、醛基、羟基、硫酸酯基、磺酸酯基和/或磷酸酯基。

咪唑

环的一个或两个N原子都可以被相同或不同的取代基取代。优选咪唑

环的两个氮原子都被相同或不同的取代基取代。

根据本发明，咪唑

盐在咪唑

环的一个或多个碳原子处被额外或专有地取代也是可能的或为优选。

优选作为取代基的是C₁-C₄烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和/或异丁基。亦优选取代基为C₂-C₄烯基，例如乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基和/或异丁烯基，亦包括具有多于4个C原子的烷基和烯基取代基，其中还更优选例如C₅-C₁₀烷基或烯基取代基。由于离子液体的溶解性，这些C₅-C₁₀烷基或烯基在其烷基和/或烯基处具有一个或多个其它取代基可能有利，所述其它取代基例如磷酸酯基、磺酸酯基、氨基和/或磷酸酯基。

本发明芳基取代基优选为：单环和/或双环芳基、苯基、联苯基和/或萘基及这些化合物携带羟基、磺酸酯基、硫酸酯基、氨基、醛基、羰基和/或羧基的衍生物。优选芳基取代基实例为苯酚、联苯基、双苯酚、萘、萘羧酸、萘磺酸、羟基联苯、联苯基羧酸、苯酚、苯基磺酸和/或苯酚磺酸。

咪唑

硫氰酸盐、咪唑

二氰胺、咪唑

四氟硼酸盐、碘化咪唑

氯化咪唑

溴化咪唑

或咪唑

六氟磷酸盐极特别地优选用于本发明方法中，其中以下物质为在本发明方法中尤其优选：溴化1-癸基-3-甲基咪唑碘化1-癸基-3-甲基咪唑

1-癸基-3-甲基咪唑

六氟磷酸盐、1-癸基-3-甲基咪唑

四氟硼酸盐、1-癸基-3-甲基咪唑

硫氰酸盐、1-癸基-3-甲基咪唑

二氰胺、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑

溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑

碘化1-十二烷基-3-甲基咪唑

1-十二烷基-3-甲基咪唑

六氟磷酸盐、1-十二烷基-3-甲基咪唑

四氟硼酸盐、1-十二烷基-3-甲基咪唑

硫氰酸盐、1-十二烷基-3-甲基咪唑

二氰胺、溴化1-己基-3-甲基咪唑

氯化1-己基-3-甲基咪唑

碘化1-己基-3-甲基咪唑

1-己基-3-甲基咪唑

六氟磷酸盐、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-己基-3-甲基咪唑

硫氰酸盐、1-己基-3-甲基咪唑

二氰胺、溴化1-辛基-3-甲基咪唑碘化1-辛基-3-甲基咪唑

1-辛基-3-甲基咪唑

六氟磷酸盐、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-辛基-3-甲基咪唑

硫氰酸盐、1-辛基-3-甲基咪唑

二氰胺、溴化1-丁基-3-甲基咪唑

碘化1-丁基-3-甲基咪唑

1-丁基-3-甲基咪唑

六氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑

四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑

硫氰酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑二氰胺、溴化1-乙基-3-甲基咪唑

碘化1-乙基-3-甲基咪唑

1-乙基-3-甲基咪唑

六氟磷酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑

四氟硼酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑

硫氰酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑

二氰胺。最优选的是1-丁基-3-甲基咪唑

四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑

硫氰酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑二氰胺、1-乙基-3-甲基咪唑

四氟硼酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑

硫氰酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑

二氰胺、1-己基-3-甲基咪唑

四氟硼酸盐、1-己基-3-甲基咪唑

硫氰酸盐、1-己基-3-甲基咪唑

二氰胺。

本发明使用的离子液体优选为液体，即优选它们为在室温(约25℃)是离子型的液体。然而，亦可使用以下离子液体：尽管室温下不是液体，但随后在本发明方法实施时的温度下应该以液体形式存在或应该在提取液中可溶。

本发明另一方面涉及用于从复杂的基质中分离细胞的提取液，所述提取液至少包括通常在水或水性缓冲液中的MgCl₂和/或离子液体。

如果存在，那么MgCl₂通常以0.5-3M.优选0.5-2M、更优选1-2M的浓度存在于提取液中。

如果存在，那么离子液体通常以基于混合物的0.5-20％重量、优选1-10％重量的浓度存在。

根据本发明的优选实施方案，提取液具有大于5和低于9、优选大于6和低于8、更优选6.5-7.5之间的pH值。

本发明的缓冲液选自磷酸缓冲液、磷酸缓冲盐缓冲液(PBS)、2-氨基-2-羟基甲基-1，3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐缓冲液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。

此外，本发明的另一方面涉及用于从复杂的基质分离细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：

-本发明的提取液，和

-至少一种生物聚合物降解酶(参见上文)。

根据本发明的优选实施方案，至少一种生物聚合物降解酶选自蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶，优选α-淀粉酶。

本发明的方法和试剂盒提供非常温和及有效的基质裂解系统。提取液有效裂解大多数复杂样品的基质，同时靶细胞保持不受影响并因此是活细胞，所述复杂样品例如通常是在食品分析中。由于非常温和的基质裂解条件，甚至细胞表面结构通常保留完整不受影响。视需要，可在检测细胞之前除去存在于基质裂解前的样品中的死细胞。因此，本发明的方法和试剂盒提供了从复杂样品中分离细胞(优选活细胞)的简单和快速方式，并且，将其与灵敏检测方法如实时PCR组合，使得可快速和灵敏地检测食品和其它复杂样品中的病原体。

本发明进一步通过以下附图和实施例阐明，然而，不受其限制。

图1给出用本发明方法检测(定性和/或定量)复杂样品如食品样品中病原细菌细胞时必须实施的程序步骤的一个例示性流程方案。

图2显示应用实施例5中研究的单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)平板计数定量结果。

上文和下文以及于2009年6月18日提交的相应EP申请EP09007959.1中引用的所有申请、专利和出版物的全部公开内容通过引用结合到本文中。

实施例

以下实施例代表本发明的实际应用。

1.细菌菌株及培养条件。

将单核细胞增生李斯特菌EGDe(1/2a，内部编号2964)用做革兰氏阳性细菌的模型生物体，并作为实时PCR的DNA定量标准品。将鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)(NCTC12023)用作革兰氏阴性细菌的模型生物体，并作为实时PCR的DNA定量标准品。用MicroBank^TM技术(Pro-Lab Diagnostics，Richmont Hill，Canada)将细菌保存在-80℃，它们为奥地利维也纳兽医大学的牛奶卫生、牛奶技术及食品科学研究所(Institute of Milk Hygiene，MilkTechnology and Food Science，University of Veterinary Medicine，Vienna，Austria)保藏的细菌菌株的一部分。将所有细菌菌株都在含0.6％(w/v)酵母提取物(TSB-Y；Oxoid，Hampshire，United Kingdom)的胰胨豆胨肉汤中在各自的最适生长温度(单核细胞增生李斯特菌为37℃，鼠伤寒沙门氏菌为42℃)下培养过夜。

2.显微镜研究。

通过将Live/Dead

BacLight^TM细菌生存力试剂盒(MolecularProbes，Willow Creek，OR，USA)的1μl组分A和1μl组分B，加到1ml在无菌过滤的林格液(Merck，Darmstadt，Germany)中的细菌培养物的适当稀释液中，来进行生存力染色。将样品在黑暗中孵育15分钟，用5ml注射器和Swinnex过滤器架(Millipore)将400μl过滤到0.22-μm孔径的13-mm黑色聚碳酸酯过滤器(Millipore，Billerica，MA，USA)上。将检测抗生素的12.7mm过滤盘(Schleicher & Schuell GmbH，Dassel，Germany)放在用于支撑的过滤器架中的聚碳酸酯过滤器的下面。分析每个样品的每个过滤器的十五个视野。将以下公式用于计算每毫升样品的染色细胞数目：N＝每视野细胞均数×(有效过滤面积/视野面积)×(1/稀释因子)×(1/以ml计的过滤体积)。将带有470nm过滤器的LeitzLaborlux 8荧光显微镜(Leitz，Germany，Wetzlar)在一千倍放大倍数下用于显微镜分析。

3.食品接种。

为了人为污染食品，将一毫升过夜培养物转移到一毫升新鲜培养基中，并分别在各自最适生长温度下孵育三小时。随后将100μl适当的在PBS(磷酸缓冲盐水)中的稀释液加到样品中。将平板计数方法和补充0.6％(w/v)酵母提取物(TSA-Y；Oxoid，Hampshire，UnitedKingdom)的胰胨豆胨琼脂平板，用于定量测定所用的所有细菌菌株。将琼脂平板在各自最适生长温度下孵育24小时。所有样品基质购自当地超市。用下述基质裂解方案和各自的实时PCR测定，检测用于人为污染的所有样品为单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌阴性。所有接种试验一式二份进行。

4A.用包含离子液体的提取液进行基质裂解。

将1-乙基-3-甲基咪唑

硫氰酸盐([emim]SCN；Merck KGaA₁Darmstadt，Germany)的5％(v/v)水溶液用于冰淇淋和蛋。将[emim]SCN的7.5％(v/v)水溶液用于超高温(UHT)奶。如果没有另外指出，则基质裂解如下进行：将12.5g液体或6.25g固体食品与10ml裂解缓冲液混合，并在Stomacher 400(Seward，London，UK)实验室搅拌器中各匀浆化2次，每次3分钟。将匀浆化物转移到50ml聚丙烯管中(Corning，NY，USA)。加入裂解缓冲液直至体积为45ml。将样品在水浴中水平孵育(分别为单核细胞增生李斯特菌37℃或鼠伤寒沙门氏菌42℃)，并以200rpm振荡30分钟。然后将样品在室温以3,220 xg离心30分钟。将沉淀重悬于40ml洗涤缓冲液(1％Lutensol AO-07和PBS)中，并在水浴中水平孵育，在裂解步骤期间使用的温度下以200rpm振荡30分钟。然后，将样品在室温以3,220×g离心30分钟，并轻轻地弃掉上清液。将沉淀重悬于500μl PBS中，转移到1.5ml塑料管(Eppendorf，Hamburg，Germany)中，并以5,000×g再离心5分钟，在1ml PBS中洗涤两次。

4B.用包含MgCl₂的提取液进行基质裂解。

裂解缓冲液(＝提取液)含有0.5-3M MgCl₂、1 x Tris缓冲液，pH 5-7。

将12g液体或6g固体食品与10ml裂解缓冲液混合，并在Stomacher 400(Seward，London，UK)实验室搅拌器中各匀浆化2次，每次3分钟。将匀浆化物转移到50ml聚丙烯管中(Corning，NY，USA)。加入裂解缓冲液直至体积为45ml。将样品在水浴中水平孵育(分别为单核细胞增生李斯特菌37或鼠伤寒沙门氏菌42)，并以200rpm振荡30分钟。然后将样品在室温以3,220 x g离心30分钟。仔细除去上清液，留下约500μl样品在管中。将剩余样品及沉淀重悬于40ml洗涤缓冲液(1％Lutensol AO-07和1 x PBS)中，并在水浴中水平孵育，在裂解步骤期间使用的温度下以200rpm振荡30分钟。然后，将样品在室温以3,220×g离心30分钟，并轻轻地弃掉上清液，以留下约250μl样品在管中。将剩余样品及沉淀重悬于500μl 1 x PBS中，转移到1.5ml塑料管(Eppendorf，Hamburg，Germany)中。此后，在室温以5,000×g将样品离心5分钟，并轻轻地弃掉上清液。以5,000×g再离心5分钟，在1ml PBS中洗涤剩余沉淀两次。

5.DNA分离。

用NucleoSpin

组织试剂盒(Machery-Nagel，Düren，Germany)和用于革兰氏阳性细菌的支持方案，从基质裂解后的剩余细菌沉淀中进行DNA分离。对该方案的最后步骤进行改良，因此用50μl的双蒸水从柱中洗脱DNA两次。

6.活细胞定量。

用平板计数法(PCM)在两种补充0.6％(w/v)酵母提取物(TSA-Y；Oxoid，Hampshire，United Kingdom)的非选择性胰胨豆胨琼脂平板上，从基质裂解后的剩余细菌沉淀中进行活细胞定量。将选择性木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂(XLD；Oxoid，Hampshire，United Kingdom)用于鼠伤寒沙门氏菌，将Oxoid Chromogenic Listeria Agar(OCLA；Oxoid，Hampshire，United Kingdom)用于单核细胞增生李斯特菌。

7.用于实时PCR定量的DNA标准品。

通过用NucleoSpin组织试剂盒(Macherey-Nagel)和用于革兰氏阳性细菌的支持方案，提取单核细胞增生李斯特菌1毫升过夜培养物的基因组DNA。通过用Hoefer DyNA Quant200仪器(Pharmacia Biotech，San Francisco，CA，USA)和8452A二极管阵列分光光度计(HewlettPackard，Palo Alto，CA，USA)的荧光测量，来分析测定DNA浓度。通过假定基于单核细胞增生李斯特菌基因组的分子量，1ng DNA等于3.1 x 10⁵个全基因组拷贝，且prfA基因为单拷贝基因，来确定prfA基因的拷贝数。通过假定每1ng DNA有1.9 x 10⁵个拷贝的鼠伤寒沙门氏菌全基因组，来相似地确定沙门氏菌的拷贝数。

8.实时PCR。

按照先前公开的形式(P.Rossmanith等，Research in Microbiology，157(2006)763-771))，来通过靶向prfA基因的274bp片段进行单核细胞增生李斯特菌的实时PCR检测。用SureFood

试剂盒(R-Biofarm，Darmstadt，Germany)按照使用手册来检测鼠伤寒沙门氏菌。在Mx3000p实时PCR热循环仪(Stratagene，La JoIIa，CA，USA)中进行实时PCR。25μl的体积含有5μl DNA模板。实时PCR结果表示为细菌细胞当量(BCE)。所有实时PCR反应一式两份进行。

应用实施例

1.来自基质裂解后的冰淇淋和蛋中的鼠伤寒沙门氏菌的实时PCR

将每6.25g样品含有以6.67×10⁵CFU(标准差(SD)：±2.54 x 10⁵)开始进行4步10倍系列稀释的鼠伤寒沙门氏菌的人为污染的冰淇淋和蛋，在基质裂解后进行DNA分离和实时PCR。通过实时PCR获得的每份样品的BCE均数如下：对于6.67 x 10⁵CFU接种细胞，冰淇淋为3.31 x 10⁶(SD：±4.00 x 10⁵)，蛋为5.02 x 10⁵(SD：±2.87 x 10⁵)；对于6.67 x 10⁴CFU接种细胞，冰淇淋为3.34 x 10⁵(SD：±4.57 x 10⁴)，蛋为9.23 x 10⁵(SD：±6.26 x 10⁴)；对于6.67 x 10³CFU接种细胞，冰淇淋为2.68 x 10⁴(SD：±4.73 x 10³)，蛋为1.30 x 10⁴(SD：±2.73 x10³)；及对于6.67 x 10²CFU接种细胞，冰淇淋为2.74 x 10³(SD：±1.46x 10³)，蛋为8.11 x 10²(SD：±4.82 x 10²)(表1)。在基质裂解前达到DNA分离效率的对照样品的BCE均数是，对于6.67 x 10³CFU接种为3.06 x 10⁴(SD：±3.06 x 10³)。借助显微镜细胞计数法计数的接种细菌细胞的各自均数是1.84 x 10⁴(SD：±4.97 x 10³)(表4)。

2.来自基质裂解后的UHT奶中的单核细胞增生李斯特菌的实时PCR

将每12.5ml样品含有以1.14×10⁶CFU(SD：±2.28×10⁵)开始进行4步10倍系列稀释的单核细胞增生李斯特菌的人为污染的UHT奶，在基质裂解后进行DNA分离和实时PCR。通过实时PCR获得的每份UHT奶样品的BCE均数，对于1.14×10⁶CFU接种细胞为1.70×10⁶(SD：±1.90×10⁵)，对于1.14 x 10⁵CFU接种细胞为1.49 x 10⁵(SD：±2.22 x 10⁴)，对于1.14 x 10⁴CFU接种细胞为1.60 x 10⁴(SD：±3.27 x10³)，及对于1.14 x 10³CFU接种细胞为1.97 x 10³(SD：±7.09 x 10²)(表1)。在基质裂解前达到DNA分离效率的对照样品的BCE均数是，对于1.14×10⁴CFU接种细胞为1.48×10⁴(SD：±1.93×10³)。借助显微镜细胞计数法计数的接种细菌细胞的各自均数是2.94×10⁴(SD：±7.64×10³)(表4)。

按照应用实施例1和2给出的方案，将使用包含至少一种离子液体的提取液的基质裂解方案与实时PCR组合来检测，以证明从UHT奶直接定量单核细胞增生李斯特菌以及从冰淇淋和蛋中直接定量鼠伤寒沙门氏菌的能力。与基质裂解前接种物的CFU相比较，在基质裂解后获得的细菌细胞当量(BCE)回收率，对于来自12.5ml UHT奶的单核细胞增生李斯特菌为190％，对于来自6.25g冰淇淋和蛋的鼠伤寒沙门氏菌细菌为298％(表4)。这些回收率是通过应用PCM对每份样品实际细胞计数的低估结果。这个结论由以下事实来确证：基质裂解后BCE计数与进行用以对基质裂解前接种物计数的显微镜研究的细胞计数和实时PCR对照结果更好地相关(表4)。与通过显微镜研究基质裂解前接种物的细胞计数相比较，从奶中回收的单核细胞增生李斯特菌为75％，鼠伤寒沙门氏菌为108％。与基质裂解前实时PCR对照相比较，从奶中回收的单核细胞增生李斯特菌为114％，而鼠伤寒沙门氏菌为65％(表4)。单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的回收率对所有接种水平和所有检验的食品是一致的(表1)。这证明用包含至少一种离子液体的提取液的基质裂解方案使得能以log级单位恰当地区别污染。

表1基质裂解后不同食品的单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的实时PCR定量

a CFU：通过平板计数获得的菌落形成单位

b SD：标准差

c BCE：细菌细胞当量(就实时PCR计数而言)

d从初始接种水平浓度开始的稀释系列

3.来自基质裂解后的食品中的单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的平板计数定量

将含有4步10倍系列稀释的单核细胞增生李斯特菌或鼠伤寒沙门氏菌的人为污染的食品，在基质裂解后进行平板计数定量。来自12.5ml样品的单核细胞增生李斯特菌平均回收率，与对照样品比较在TSA-Y琼脂平板上为108％。来自蛋的6.25g样品的鼠伤寒沙门氏菌的回收率为在TSA-Y琼脂平板上为平均60％。因为食品的微生物背景群落在TSA-Y琼脂上不可能定量测定来自冰淇淋的鼠伤寒沙门氏菌。当使用选择性XLD琼脂时达到36％的平均回收率(表2)。

与非选择性琼脂平板相比在选择性琼脂平板上回收率降低。分别地，来自12.5ml UHT奶中的单核细胞增生李斯特菌在OCLA琼脂上定量的平均回收率为68％，而来自6.25g蛋的鼠伤寒沙门氏菌在XLD琼脂上的平均回收率为34％(表3)。这些结果与以下已知事实关联，即在选择性琼脂平板上的细菌生长与在非选择性琼脂平板上的生长比较可能减少。

两种生物体的回收率对于所有接种水平一致，这表明基质裂解方案能以log级单位适当地区别污染。然而，考虑高标准差和实际细胞计数的观察低估(表4)，PCM与实时PCR相比似乎更不适合用于定量目的。

表2基质裂解后不同食品的单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的活细胞定量

a结果基于胰胨豆胨琼脂+0.6％(W/V)酵母提取物的值

b结果基于木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂的值

c基质裂解前的食品接种水平

d RSD.：相对标准差

e基于基质裂解前后CFU计数计算回收率

4.在基质裂解后来自UHT奶的单核细胞增生李斯特菌和来自蛋的鼠伤寒沙门氏菌在非选择性和选择性琼脂平板上的平板计数定量的比较

将6.25g含有以6.85×10⁸CFU/ml(相对标准差(RSD)：18.5％)开始4步10倍系列稀释的鼠伤寒沙门氏菌的人为污染的蛋，在基质裂解后在TSA-Y和XLD琼脂平板上进行平板计数定量。通过PCM从蛋中获得的每样品的CFU的平均数目在TSA-Y琼脂平板上是4.14×10⁸(RSD：37.4％)，在XLD琼脂平板上为2.33×10⁸(RSD：12.5％)。来自蛋中的鼠伤寒沙门氏菌回收率在选择性琼脂上为34％，在非选择性琼脂上为60％(表3)。

将12.5ml含有以4.30×10⁸CFU/ml(RSD：26.4％)开始4步10倍系列稀释的单核细胞增生李斯特菌的人为污染的UHT奶，在基质裂解后在TSA-Y和OCLA琼脂平板上进行平板计数定量。通过PCM从UHT奶中获得的每样品的CFU平均数目在TSA-Y琼脂平板上是4.65×10⁸(RSD：36.8％)，在OCLA琼脂平板上为2.90 x 10⁸(RSD：37.9％)。来自UHT奶中的单核细胞增生李斯特菌的回收率在选择性琼脂上是67％，在非选择性琼脂上为108％(表3)。

表3.UHT奶和蛋中单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌在基质裂解后在选择性(XLD，OCLA)和非选择性(TSA-Y)琼脂平板上活细胞计数的比较

a施用于基质裂解的食品：蛋

b施用于基质裂解的食品：UHT奶

c TSA-Y：胰胨豆胨琼脂+06％(vv/v)酵母提取物；XLD：木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂；OCLA：Oxoid chromogenic Listeria agar

d基质裂解前食品的接种水平

e RSD.：相对标准差

f基于基质裂解前后CFU计数计算回收率

表4.由实时PCR测定的基质裂解后不同食品(e，f)中单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌回收率的测定

a基质裂解前食品的接种水平

b用NucleoSpm

组织试剂盒直接处理的细菌培养物，没有进行基质裂解的作为DNA分离效率的对照

c BCE.：细菌细胞当量(就实时PCR计数而言)

d SD.：标准差

e施用于基质裂解的食品：UHT奶

f施用于基质裂解的食品：冰淇淋和蛋

g基于各垂直列显示的计数和值计算回收率，并与代表100％的相应值比较

5.单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的平板计数定量

研究了不同的MgCl₂浓度对单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌生存力的影响。用3种不同浓度的MgCl₂(1M、2M和3M)和在3种不同温度(35℃、38℃和45℃)将靶生物体孵育30分钟，在处理后将TSA-Y琼脂平板上的CFU与对照样品作比较。

使2.78 x 10⁹CFU/ml(相对标准差(RSD)：23％)的单核细胞增生李斯特菌细胞遭受不同浓度MgCl₂和不同温度。对于35℃的孵育温度，单核细胞增生李斯特菌的CFU/ml在1M MgCl₂时为3.86 x 10⁹CFU/ml(RSD：22％)，在2M MgCl₂时为3.10 x 10⁹CFU/ml(RSD：23％)，在3M MgCl₂时为1.76 x 10⁹CFU/ml(RSD：21％)。对于38℃的孵育温度，单核细胞增生李斯特菌的CFU/ml在1M MgCl₂时为4.06 x 10⁹CFU/ml(RSD：31％)，在2M MgCl₂时为3.64 x 10⁹CFU/ml(RSD：21％)，在3M MgCl₂时为8.5 x 10⁸CFU/ml(RSD：34％)。对于45℃的孵育温度，单核细胞增生李斯特菌的CFU/ml在1M MgCl₂时为4.39×10⁹CFU/ml(RSD：23％)，在2M MgCl₂时为1.68×10⁹CFU/ml(RSD：14％)，在3M MgCl₂时为1.5×10⁸CFU/ml(RSD：15％)。

使2.22 x 10⁹CFU/ml (RSD：18％)的鼠伤寒沙门氏菌细胞遭受不同浓度MgCl₂和不同温度。对于35℃的孵育温度，鼠伤寒沙门氏菌的CFU/ml在1M MgCl₂时为1.15 x 10⁹CFU/ml(RSD：37％)，在2M MgCl₂时为2.3 x 10⁸CFU/ml(RSD：41％)，在3M MgCl₂时为5.75 x 10⁷CFU/ml (RSD：36％)。对于38℃的孵育温度，鼠伤寒沙门氏菌的CFU/ml在1M MgCl₂时为8.33 x 10⁸CFU/ml(RSD：22％)，在2M MgCl₂时为1.35 x 10⁸CFU/ml(RSD：69％)，在3M MgCl₂时为2.0 x 10⁷CFU/ml(RSD：50％)。对于45℃的孵育温度，鼠伤寒沙门氏菌的CFU/ml在1M MgCl₂时为4.1 x 10⁸CFU/ml(RSD：23％)。结果见图2。

6.基质裂解后人为污染的冰淇淋的鼠伤寒沙门氏菌活细胞计数

将含有4步10倍系列稀释的鼠伤寒沙门氏菌的人为污染的食品，在基质裂解后进行平板计数定量。在木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂上试验0.5M MgCl₂的基质裂解方案，以证明来自冰淇淋的鼠伤寒沙门氏菌的有效直接定量。以平均38％从6.5g冰淇淋中回收鼠伤寒沙门氏菌。

Claims (12)

1.用于从复杂样品中分离细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供复杂样品；

b)将所述样品与包含至少MgCl₂和/或离子液体的提取液孵育；

c)从步骤b)的混合物中分离所述细胞。

2.权利要求1的方法，其特征在于，步骤c)中分离的所述细胞至少30％是活细胞。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述复杂样品为食品或临床样品。

4.权利要求1-3中一项或多项的方法，其特征在于，所述提取液包含浓度为0.5-3M的MgCl₂。

5.权利要求1-4中一项或多项的方法，其特征在于，所述细胞为细菌细胞。

6.权利要求1-5中一项或多项的方法，其特征在于，所述提取液不包含去污剂。

7.权利要求1-6中一项或多项的方法，其特征在于，在步骤b)之前向所述样品中掺入规定量的对照细胞。

8.权利要求1-7中一项或多项的方法，其特征在于，将所述样品与表现出对细胞的渗透胁迫保护特性的化合物预孵育。

9.权利要求1-8中一项或多项的方法，其特征在于，将所述样品进一步与至少一种生物聚合物降解酶孵育。

10.权利要求1-9中一项或多项的方法，其特征在于，在另外的步骤d)中，通过细胞计数、PCR方法、通过使用凝集素或通过涉及针对所述细胞表面结构的抗体、抗菌肽(AMP)、适配体或病毒结合结构域的方法，来分析细胞。

11.用于从复杂样品中分离细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：

-包含至少MgCl₂和/或离子液体的提取液，和

-至少一种生物降解酶。

12.权利要求11的试剂盒，其特征在于，所述生物降解酶选自蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶。

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