CN104561233A - 一种喹诺酮类药物残留检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种喹诺酮类药物残留检测试剂盒，所述试剂盒由增菌培养液、菌种瓶、提取液试剂、测试培养基、阳性对照液、补充剂组成，主要用于水产品、畜、禽产品的喹诺酮类药物残留的检测，其他产品可参照使用。将该标准中使用到的菌种、培养基、标准品等实验材料进行制备并组装成试剂盒，提高了灵敏度，同时增加了一种显示剂，使得试剂盒方法使用简便，且更易于观察结果。

Description

一种喹诺酮类药物残留检测试剂盒

技术领域

本发明属于食品安全快速检测技术领域，主要涉及一种喹诺酮类药物残留检测试剂盒。

背景技术

喹诺酮类药物（quinolones,QNs）药物是近30年来迅速发展起来的一类十分重要的广谱喹诺酮，是继磺胺类药物之后人类在合成喹诺酮方面最重要的突破。在化学结构上，本类药物属吡酮酸衍生物，俗称“喹诺酮类”。QNs抑制细菌DNA螺旋酶，抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，抗菌作用是磺胺类药的近千倍，可与第三代头孢类喹诺酮相媲美。因QNs系化学合成药物，价格低廉，故在医学和兽医学中很快取得广泛应用。QNs的临床应用和新衍生物开发研究仍在快速发展中。目前，QNs已成为兽医临诊和水产养殖中最重要的抗感染药物之一，被大量用于治疗、预防和促生长。由于致病菌产生耐药性和某些QNs的潜在致癌性质，其残留问题已引起广泛关注。

目前的研究结果中喹诺酮类药物确切的作用机制尚不清楚，但被认为与抑制Ⅱ型交连异构酶中的DNA螺旋酶有关，对人类的毒性作用可能与这个过程或涉及DNA的其他作用有关。许多喹诺酮类药物对人类的毒性作用尚未评价，然而，萘啶酸已特别显示出其致癌、致突变、干扰生死系统、诱发光过敏等毒性。QNs残留最受关注的危害就是动物的耐药菌株特别是肠道细菌通过食物链向人类传播。许多调查或试验材料已证实细菌对QNs耐药性的这种传播途径。

目前，随着喹诺酮残留毒理学的发展和风险分析手段的进步，各国将对QNs在动物源性食品中的残留量做出了越来越严格的规定。2003年初，日本在我国出口烤鳗中检出恩诺沙星，并利用其食品卫生法中“动物源性食品中不得含有合成喹诺酮”的规定，使我国出口烤鳗受阻，近年美国、欧盟和我国均制定了喹诺酮类药物的残留限量要求。因此，加强针对药物残留的食品监测，是一项重要的具有挑战性的分析工作。目前用来检测此类药物残留的方法，主要是高效液相色谱、液质联用等方法，该方法设备投资高、前处理方法较繁琐，为了尽可能地保证供应不含残留药物的食品，需要有可以在各种复杂基质中对残留进行分析的方法。需要一种灵敏及方便易行的检测方法来应对当前的急迫形势，微生物抑制试验法就是其中一种被广泛采用的方法。

微生物筛选法快速、简便，传统上，一直被用于对大批量的样品进行喹诺酮过筛，时至今日仍然被广泛使用。微生物法可进行喹诺酮大类的筛选，可检测不同基质的多种样品，样品前处理方便，检测时间短，而且不需要昂贵的检测仪器和试剂，能适应国际贸易交货时间短、规格多的商品检验特点。因此研究和制定喹诺酮的微生物筛选法，是适应外贸出口的需要，保障出口样品的快速检测的需要。本研究主要是针对喹诺酮类抗菌物质的快速筛选微生物抑制方法。目前，已制订发布了出入境检验检疫行业标准《动物源性食品中喹诺酮类药物残留检测方法 微生物抑制法》(标准号：SN/T 1751.1-2006，本试剂盒方法就是在此标准的基础上研发，将该标准中使用到的菌种、培养基、标准品等实验材料进行制备并组装成试剂盒，提高了灵敏度，同时增加了一种显示剂，使得试剂盒方法使用简便，且更易于观察结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种喹诺酮类药物残留检测试剂盒，将该标准中使用到的菌种、培养基、标准品等实验材料进行制备并组装成试剂盒，提高了灵敏度，同时增加了一种显示剂，使得试剂盒方法使用简便，且更易于观察结果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种喹诺酮类药物残留MIA检测试剂盒由增菌培养液、菌种瓶、提取液试剂干粉、测试培养基、阳性对照液、补充剂组成。

所述增菌培养液组成成分为：蛋白胨 10.0g、牛肉膏 3.0g、氯化钠 5.0g、蒸馏水 1000mL、pH7.3±0.1；将各成分加热溶解， 121℃高压灭菌15min，分装到灭菌过的安瓿瓶中，每管5mL，压盖密封，4℃保存。

所述菌种瓶制备方法为：(1) 大肠杆菌Escherichia coli ATCC8739，接种于营养琼脂肉汤，36℃±1℃培养18h左右；

本试剂盒所用ATCC菌株可通过国内外商业渠道买到，国内已有多家代理商提供ＡＴＣＣ菌株订购服务，如：上海汉尼生物技术有限公司，地址：上海市闵行区都会路2338号91幢，邮编：201108，电话：021-54175805，传真：021-54175815，网址：www.shharmony.com；北京中原公司，地址：北京市朝阳区东方东路11号，邮编：100125，总机：400-810-0881 010-8441 5678，传真：86-10-8441 5679，邮箱：officesinozhongyuan.com

(2)　将直径10mm、厚1.1mm圆形滤纸片高压灭菌后，取1片分装于灭菌过的安瓿瓶中，吸取大肠杆菌培养物0.5mL滴加到滤纸片上，然后压盖密封，4℃保存。

所述提取液试剂为干粉，其组成成分及含量为磷酸二氢钾0.523g、磷酸氢二钾16.73g；将各成分混匀，分装到20mL的塑料瓶中，密封，4℃保存。使用时用1000mL蒸馏水溶解定容。

所述测试培养基为干粉，其组成成分及含量为牛肉膏1.5g、酵母膏1.5g、蛋白胨 5.0g、葡萄糖1.0g、氯化钠3.5g、磷酸二氢钾1.32g、磷酸氢二钾3.68g、琼脂15.0g；将上述各成分完全混合均匀，准确称取混合物3.25克，分装到5mL的塑料瓶中，密封，4℃保存。使用时加入100mL蒸馏水煮沸3分钟完全溶解。

所述阳性对照液制备方法为称取10mg恩诺沙星标准品，用0.1mol/L NaOH溶液溶解并定容至1000μg/mL，取4mL分装到10mL的灭菌棕色玻璃瓶中，密封，4℃保存。

所述补充剂制备方法为称取4g 2,3,5-氯化三苯四氮唑，溶于100mL灭菌蒸馏水中，分装1.5mL于5 mL的棕色瓶中，密封，4℃保存。

所述的喹诺酮类药物残留MIA检测试剂盒在水产品、畜、禽产品的喹诺酮类药物残留检测上的应用。

本发明的优点在于：

1.试剂盒的的灵敏度高，环丙沙星达到20ppb（μg/kg）;恩诺沙星达到40ppb（μg/kg），而SN/T 1750.1-2006中则为环丙沙星达到40ppb（μg/kg）;恩诺沙星达到50ppb（μg/kg）.

2.在培养基中增加使用补充剂，当细菌生长时培养基将变红色，而抑菌圈内的培养基不变色，观察结果更容易。

3.将菌种保存于滤纸片，直接将增菌培养基加入进行培养，易于使用。

4.将增菌培养基、提取液试剂、测试培养基按一定配比分装后，直接配套使用，避免配制过程中的浪费。

具体实施方式

实施例 1

喹诺酮类药物残留MIA检测试剂盒由增菌培养液、菌种瓶、提取液试剂干粉、测试培养基、阳性对照液、补充剂组成。

所述增菌培养液组成成分为：蛋白胨 10.0g、牛肉膏 3.0g、氯化钠 5.0g、蒸馏水 1000mL、pH7.3；将各成分加热溶解， 121℃高压灭菌15min，分装到灭菌过的安瓿瓶中，每管5mL，压盖密封，4℃保存。

所述菌种瓶制备方法为：(1) 大肠杆菌Escherichia coli ATCC8739，接种于营养琼脂肉汤，36℃±1℃培养18h左右；本试剂盒所用ATCC菌株由上海汉尼生物技术有限公司购买获得；

(2)　将直径10mm、厚1.1mm圆形滤纸片高压灭菌后，取1片分装于灭菌过的安瓿瓶中，吸取大肠杆菌培养物0.5mL滴加到滤纸片上，然后压盖密封，4℃保存。

所述提取液试剂为干粉，其组成成分及含量为磷酸二氢钾0.523g、磷酸氢二钾16.73g；将各成分混匀，分装到20mL的塑料瓶中，密封，4℃保存。使用时用1000mL蒸馏水溶解定容。

所述测试培养基为干粉，其组成成分及含量为牛肉膏1.5g、酵母膏1.5g、蛋白胨 5.0g、葡萄糖1.0g、氯化钠3.5g、磷酸二氢钾1.32g、磷酸氢二钾3.68g、琼脂15.0g；将上述各成分完全混合均匀，准确称取混合物3.25克，分装到5mL的塑料瓶中，密封，4℃保存。使用时加入100mL蒸馏水煮沸3分钟完全溶解。

所述阳性对照液制备方法为称取10mg恩诺沙星标准品，用0.1mol/L NaOH溶液溶解并定容至1000μg/mL，取4mL分装到10mL的灭菌棕色玻璃瓶中，密封，4℃保存。

所述补充剂制备方法为称取4g 2,3,5-氯化三苯四氮唑，溶于100mL灭菌蒸馏水中，分装1.5mL于5mL的棕色瓶中，密封，4℃保存。

实施例2

1试验用菌的制备：将增菌培养液倾入菌种瓶内36℃±1℃培养8小时，临用时摇匀。

2试验用平板的制备：将测试培养基倒入三角烧瓶内，加入100mL蒸馏水煮沸3分钟完全溶解，冷却到50℃，加入1mL补充剂和0.5 mL培养好的菌液，充分混匀后，每块平皿加入4mL，保持水平待其凝固。制备好的平板置4℃冰箱可保存3天。（测试培养基也可于121℃高压灭菌15分钟后储存备用，临用时加热溶解。

平板内的琼脂层厚度一定要均匀，否则抑菌圈的大小会有差异。）

3提取液的制备：将提取液试剂(干粉)用1000mL蒸馏水或去离子水溶解后备用，如需长期保存则于121℃高压灭菌15分钟后备用。

增强型提取液：如果将上述提取液与乙腈以7：3比例混合作为样品的提取液，可增强提取效果。尤其对成分比较复杂的样品（加工过或有调味成分等的样品）效果更佳。

4 样品的提取和制备：

称取10g 均质后的肉泥，加入10mL提取液充分混匀（用振荡器上下振荡3分钟），置80℃水浴保温20分钟后，4000rpm离心15分钟，取上层液备用（避开油脂层）。

5检测方法：

在检测用的平板底部作好标记，用灭菌镊子将灭过菌的牛津杯轻放于平板的琼脂表面，每块平板放置5个牛津杯，在每个杯内加入280μL提取液或标准液（阳性对照）。通常每份样品需用两个牛津杯作平行试验。将加好样液的平板置36℃±1℃培养，12小时内观察，用提取液做阴性对照。

．结果判定

1） 阳性对照的（50ppb恩诺沙星）抑菌圈直径必须＞10mm，抑菌圈内的琼脂不变色，抑菌圈以外的琼脂显现红色；阴性对照不产生抑菌圈，试验才有效。

2） 检测样品的抑菌圈直径在10mm以上者为阳性，抑菌圈直径不到10mm者为可疑阳性。

3） 用组织切片直接测试的样品，其外围出现抑菌圈，即为阳性。

实施例 3

1试验用菌的制备：将增菌培养液倾入菌种瓶内36℃±1℃培养10小时，临用时摇匀。

2试验用平板的制备：将测试培养基倒入三角烧瓶内，加入100mL蒸馏水煮沸3分钟完全溶解，冷却到50℃，加入1mL补充剂和0.5 mL培养好的菌液，充分混匀后，每块平皿加入5mL，保持水平待其凝固。制备好的平板置4℃冰箱可保存3天。

3提取液的制备：将提取液试剂(干粉)用1000mL蒸馏水或去离子水溶解后备用，如需长期保存则于121℃高压灭菌15分钟后备用。将上述提取液与乙腈以7：3比例混合作为样品的提取液，可增强提取效果。尤其对成分比较复杂的样品（加工过或有调味成分等的样品）效果更佳。

4 样品的提取和制备：

新鲜组织样品用灭菌工具切成直径10mm，厚度2mm的圆片置无菌器皿内备用。

5检测方法：

方法二：在检测用的平板底部作好标记，用灭菌镊子将组织切片直接放置于琼脂表面，与琼脂层贴紧，同时做阳性对照，平板置36℃±1℃培养，12小时内观察。

6．结果判定

4） 阳性对照的（50ppb恩诺沙星）抑菌圈直径必须＞10mm，抑菌圈内的琼脂不变色，抑菌圈以外的琼脂显现红色；阴性对照不产生抑菌圈，试验才有效。

5） 检测样品的抑菌圈直径在10mm以上者为阳性，抑菌圈直径不到10mm者为可疑阳性。

6） 用组织切片直接测试的样品，其外围出现抑菌圈，即为阳性。

以上实施例中检测限为：环丙沙星为20ppb（μg/kg）;恩诺沙星为40ppb（μg/kg）。其它喹诺酮类药物为50－250ppb（μg/kg）。

实施例4

1.试剂盒测试喹诺酮类部分药物的灵敏度测试数据

不同喹诺酮类药物的灵敏度测试结果

注：以上数据为6次测试的平均值；NT：未测试；－：无抑菌圈

2.提取液的选择和效果

表5不同提取液测试结果

　试验结果表明：pH8.0磷酸盐缓冲液和pH8.0磷酸盐－乙腈缓冲液（2：3）提取效果都可达到检测要求，且用pH8.0磷酸盐－乙腈缓冲液（2：3）提取的样液更清澈，干扰更少。

3.培养温度和时间的确定

菌种培养时间的确定：大肠杆菌的生长繁殖速度较快，通常仅需几个小时就可使透明的液体繁殖培养基变混浊，在36℃条件下培养，大肠杆菌的迟缓期通常为1个小时左右。其后的6～10个小时为对数生长期，大肠杆菌在此期间对外界因素的作用较为敏感，因此选择处在对数生长期的菌种，对药物的敏感性较强，研究表明培养时间在6小时左右的菌种，抑菌圈更清除可见，细菌生长分布更均匀。此时延长菌种的培养时间，细菌处于停滞生长期，变化不大，对结果影响不显著，但当菌种培养时间超过24小时，则因菌种的老化影响检测结果的观察和判断。因此，我们认为菌种培养时间在为6个小时以上，不超过24小时即可,最终确定为18h±2h。

平板培养观察时间的确定：从培养2个小时后开始观察,通常4个小时后，阳性对照的抑菌圈就可显现，但阳性样品的抑菌圈不明显。6个小时后阳性样品的抑菌圈趋于明显，8～12小时为最佳观察时间，此时，阳性对照和阳性样品的抑菌圈边界清晰，容易观察。延长培养时间到24小时，抑菌圈结果变化不明显，因此我们将菌种培养时间定为8个小时以上，不超过24小时。

检定平板培养温度的确定：通过在样品中添加一定浓度的标准，选择25℃、30℃和36℃三个培养温度进行测试，试验结果表明，平板25℃培养，其抑菌圈更大一些，36℃培养偏小，但25℃培养需要较长的时间才能见到清晰的抑菌圈。我们分析，虽然大肠杆菌的最适培养温度在36℃左右，但因为是进行抑菌试验，有必要适当延迟其生长速度，以便样品中的药物更好地渗透到培养基中形成明显的抑菌圈，这样可以一定程度上提高检测的灵敏度。但因考虑到25℃培养时间相对偏长，综合上述的因素，本方法将平板的培养温度定为30℃。

5.检测平板条件的确定

培养基的选择：采用普通营养琼脂、喹诺酮培养基5号、喹诺酮培养基3号及喹诺酮培养基11号，用已知阳性样品和标准溶液测试抑菌圈，比较抑菌圈直径和细菌生长情况：包括生长速度、生长密度和抑菌圈的清晰度等。经试验后确定采用喹诺酮培养基3号，并对3号培养基的成份进行了部分调整。

菌液添加量的选择：经试验后确定培养时间在4－6小时的菌种，每100mL培养基添加1mL菌液；培养时间在18小时左右的菌种，每100mL培养基添加0.5mL菌液。

平板培养基添加量的确定：用恩诺沙星标准液对不同培养基添加量的平板进行测试，结果表明,培养基添加量在4－5mL时抑菌圈显现的最大，最易于观察。

6.鳗鱼检测限确定

以鳗鱼组织作为检测限确定的基质，对7种喹诺酮类药物进行添加试验，以抑菌圈≥10mm作为判断值确定检测限，环丙沙星检测限为40μg/kg，恩诺沙星检测限为50μg/kg，诺氟沙星氧氟沙星、左氧氟沙星和达氟沙星检测限为100μg/kg，依诺沙星检测限为200μg/kg。结果见下表。

鳗鱼中不同喹诺酮类药物的检测限测试结果

注：以上数据为6次测试的平均值；NT：未测试；－：无抑菌圈

实施例5

1.不同方法的比较验证

采用不同基质样品的添加试验和同份样品不同检测方法验证的方式，对本方法与液相色谱法两种检测结果进行比较，结果表明，本方法检测与液相色谱法检测结果一致，且筛选灵敏度能达到50μg/Kg。

　不同基质样品的添加验证结果

a/b: a, 阳性结果数；b，总测试数；NT，未测试。

　　测试结果表明本方法以恩诺沙星添加水平在50μg/Kg以上的的假阴性率为0，添加水平在40μg/Kg-30μg/Kg时假阴性率为3%，添加水平降低假阴性率会升高。

2.其它实验室验证结果

试剂盒经广东出入境检验局、深圳出入境检验检疫局、莆田出入境检验检疫局、福清华日食品检测有限公司、莆田三峰冷冻食品有限公司、莆田兴和食品工业有限公司和福清弘晟食品有限公司七家实验室的验证，表明试剂盒方法结果稳定、使用方便，结果见下表。

　其它实验室验证结果

注：a/b: a, 阳性结果数；b，总测试数。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (8)

1.一种喹诺酮类药物残留检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由增菌培养液、菌种瓶、提取液试剂干粉、测试培养基、阳性对照液、补充剂组成。

2.根据权利要求1所述的一种喹诺酮类药物残留检测试剂盒，其特征在于：所述增菌培养液组成成分为：蛋白胨 10.0g、牛肉膏 3.0g、氯化钠 5.0g、蒸馏水 1000mL、pH7.3±0.1；将各成分加热溶解， 121℃高压灭菌15min，分装到灭菌过的安瓿瓶中，每管5mL，压盖密封，4℃保存。

3.根据权利要求1所述的一种喹诺酮类药物残留检测试剂盒，其特征在于：所述菌种瓶制备方法为：(1) 大肠杆菌Escherichia coli ATCC8739，接种于营养琼脂肉汤，36℃±1℃培养18h；

(2)　将直径10mm、厚1.1mm圆形滤纸片高压灭菌后，取1片分装于灭菌过的安瓿瓶中，吸取大肠杆菌培养物0.5mL滴加到滤纸片上，然后压盖密封，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种喹诺酮类药物残留检测试剂盒，其特征在于：所述提取液试剂干粉，其组成成分及含量为磷酸二氢钾0.523g、磷酸氢二钾16.73g；将各成分混匀，分装到20mL的塑料瓶中，密封，4℃保存，使用时用1000mL蒸馏水溶解定容。

5.根据权利要求1所述的一种喹诺酮类药物残留检测试剂盒，其特征在于：所述测试培养基其组成成分及含量为牛肉膏1.5g、酵母膏1.5g、蛋白胨 5.0g、葡萄糖1.0g、氯化钠 3.5g、磷酸二氢钾1.32g、磷酸氢二钾3.68g、琼脂15.0g；将上述各成分完全混合均匀，准确称取混合物3.25克，分装到5mL的塑料瓶中，密封，4℃保存，使用时加入100mL蒸馏水煮沸3分钟完全溶解。

6.根据权利要求1所述的一种喹诺酮类药物残留检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照液制备方法为称取10mg恩诺沙星标准品，用0.1mol/L NaOH溶液溶解并定容至1000μg/mL，取4mL分装到10mL的灭菌棕色玻璃瓶中，密封，4℃保存。

7.根据权利要求1所述的一种喹诺酮类药物残留检测试剂盒，其特征在于：所述补充剂制备方法为称取4g 2,3,5-氯化三苯四氮唑，溶于100mL灭菌蒸馏水中，分装1.5mL于５mL的棕色瓶中，密封，4℃保存。

8.一种如权利要求1所述的喹诺酮类药物残留检测试剂盒在水产品、畜、禽产品的喹诺酮类药物残留检测上的应用。