CN103952460B - 一种鉴别天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法，是以天然蜂蜜在一定浓度下对大肠杆菌DH5α有杀菌作用，而人造蜂蜜对大肠杆菌DH5α没有杀菌作用为原理，该方法是将待测蜂蜜配成的检测样品加入大肠杆菌DH5α培养基中培养菌落，然后观察菌落生长情况；若检测样品的蜂蜜浓度为100％时，仍有菌落存活，则该待测蜂蜜是人造蜂蜜，若在某一蜂蜜浓度(＜100％)下菌落全部被杀灭，则该待测蜂蜜不是人造蜂蜜。本发明方法简单、易于操作、效率高、成本低，本发明对人造蜂蜜的鉴别具有较大的实际意义，应用前景广阔。

Description

一种鉴别天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及一种对天然蜂蜜和人造蜂蜜进行鉴别的方法。

背景技术

蜂蜜是一种成分复杂、营养丰富的过饱和糖溶液，具有极高的渗透压和较低的pH值，含有过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)及丙酮醛类(Methylglyoxal,MGO)等杀菌成分，具有广谱的抗菌活性，且其抗菌活性不会产生耐药性。

一般微生物适宜生长在渗透压相当于3-6个大气压的溶液中，仅少数真菌和酵母菌能在渗透压相当于40-90个大气压中生长，而在常温下天然成熟的蜂蜜的渗透压相当于105个大气压，足以使细胞脱水而死亡。同时，蜂蜜呈现出强烈的酸度，pH介于3.2-4.5之间，而细菌生长的最佳pH值位于7.2-7.4左右，故蜂蜜在未稀释时能够抑制大多数细菌生长。另外，当细菌持续暴露在H2O2气雾中，细菌生长受抑制的H2O2浓度只需0.02mM-0.05mM。虽然蜂蜜中H2O2浓度很低，但它仍然是蜂蜜中一种有效的抗微生物成分。研究发现MGO也是蜂蜜中的一种重要的抗菌成分，MGO对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌等都具有很高的抗菌活性。基于蜂蜜以上的抗菌特性，蜂蜜对许多致病菌具有杀菌活性，包括沙门氏菌、志贺菌属及肠道内的致病菌如埃希氏菌属、霍乱弧菌和大肠杆菌等革兰氏阴性及阳性菌。

由于蜂蜜的主要成分是果糖和葡萄糖，两者都是很容易得到的工业产品，因此在利益的驱动下，有不少不法厂家及商贩用葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉等原料，再添加色素、蜂蜜香精等制作出人造蜂蜜来谋取暴利，因为人造蜂蜜根本不含有天然蜂蜜中的多种营养成分，仅是感官指标和部分理化指标与天然蜂蜜极为相似，并且难以辨别其真假，于是人造蜂蜜也叫做假蜂蜜。还有一些商家为了迷惑消费者，为了通过产品的质量检测，在天然蜂蜜里混入不同比例的人造蜂蜜。本发明中只将不含有天然蜂蜜成分的蜂蜜叫做人造蜂蜜。目前，鉴别天然蜂蜜和人造蜂蜜的手段主要是检测蜂蜜中人为加入的一些糖浆成分，而到现在为止还没有一种方法能对任何种类糖浆进行确证，若要得出可靠结论，需要结合一整套的方法，复杂的检测程序，不仅费时、效率低，而且成本高，不利于应用到大批量样品。因此急需建立一种鉴别方法来评价蜂蜜的真假。

发明内容

为了克服上述现有鉴别蜂蜜方法的缺陷，本发明的主要目的是提供一种效率高、成本低的鉴别天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法，具体操作为：将由待测蜂蜜配成的蜂蜜浓度不同的检测样品分别与相同量的大肠杆菌DH5α菌液混合后加入固体培养基中培养菌落，观察菌落是否能够在所述检测样品达到某一蜂蜜浓度后全部被杀灭；若检测样品达到该蜂蜜浓度后，菌落全部被杀灭，则该待测蜂蜜不是人造蜂蜜；当检测样品的蜂蜜浓度达到100％菌落仍然存活，则该待测蜂蜜是人造蜂蜜。

所述检测样品是将所述待测蜂蜜用无菌液稀释成不同蜂蜜浓度得到的。

所述无菌液为无菌的LB液体培养基。

所述固体培养基为LB固体培养基，所述培养为在37℃恒温培养16-29h。

所述方法，包括以下步骤：

(1)配制LB液体培养基：含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，用水配制，混合均匀后高压灭菌，即得；

配制LB固体培养基：含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉15g/L，用水配制，混合均匀后高压灭菌，60℃时倒板即得；

(2)将大肠杆菌DH5α加入到按步骤(1)方法配制好的LB液体培养基中，37℃200rpm摇菌10-12h，即得大肠杆菌DH5α菌液，其中所述大肠杆菌DH5α与所述LB液体培养基的体积比为1:100；

(3)用步骤(1)中配制好的LB液体培养基稀释待测蜂蜜得到蜂蜜浓度(体积百分含量)分布在100％-0％之间(不含端值)的多个检测样品，另取待测蜂蜜和LB液体培养基分别作为蜂蜜浓度(体积百分含量)为100％和0％的检测样品，即得多个不同蜂蜜浓度的检测样品；

(4)将步骤(2)得到的大肠杆菌DH5α菌液分别加入到按步骤(3)方法配制好的检测样品中，37℃200rpm摇菌16-20h混合均匀后，即得培养液样品，其中所述大肠杆菌DH5α菌液与所述检测样品的体积比为1:100；

(5)将步骤(4)得到的培养液样品接种在步骤(1)方法配制的LB固体培养基上37℃恒温培养16-29h；优选37℃恒温培养16-20h；

(6)观察步骤(5)方法培养的菌落生长情况，菌落全部被杀灭的检测样品对应的最小蜂蜜浓度记为最低杀菌浓度，若该蜂蜜浓度数值小于100％，则该待测蜂蜜不是人造蜂蜜；若检测样品的蜂蜜浓度达到100％菌落仍然存活，则该待测蜂蜜是人造蜂蜜。

所述检测样品的蜂蜜浓度(体积百分含量)依次为100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、0％。

步骤(5)中是将步骤(4)得到的培养液样品接种在步骤(1)方法配制的LB固体培养基上划线培养。

步骤(5)中的恒温培养时间为16-20h。

本发明的另一目的在于提供一种鉴别人造蜂蜜的方法，具体操作为：将待测蜂蜜与大肠杆菌DH5α菌液混合后加入固体培养基中培养菌落，然后观察菌落生长情况；若有存活菌落，则该待测蜂蜜是人造蜂蜜，否则，该待测蜂蜜不是人造蜂蜜。

所述固体培养基为LB固体培养基，在37℃恒温培养16-29h。

本发明的方法不是通过检测蜂蜜中糖类、酶类等成分，而是利用天然蜂蜜和人造蜂蜜对大肠杆菌DH5α具有截然不同的灭菌效果，即天然蜂蜜对此菌有杀灭作用，而人造蜂蜜则没有的原理，以此数据对蜂蜜进行鉴别，本发明方法简单、易于操作、效率高、成本低，本发明对人造蜂蜜的鉴别具有较大的实际意义，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1：天然蜂蜜HH培养大肠杆菌DH5α培养板菌落生长情况；

图2：人造蜂蜜AH培养大肠杆菌DH5α培养板菌落生长情况；

图3：商品蜂蜜A培养大肠杆菌DH5α培养板菌落生长情况；

图4：商品蜂蜜B培养大肠杆菌DH5α培养板菌落生长情况；

图5：商品蜂蜜C培养大肠杆菌DH5α培养板菌落生长情况；

图6：商品蜂蜜D培养大肠杆菌DH5α培养板菌落生长情况。

具体实施方式

本发明利用天然蜂蜜对大肠杆菌具有杀菌作用，而人造蜂蜜则没有的原理，实现对天然蜂蜜和人造蜂蜜的鉴别。本发明中，大肠杆菌确定为DH5α，由于实验中发现人造蜂蜜也能够杀死其他大肠杆菌，唯独不能杀死这种大肠杆菌，因此用其它种类的大肠杆菌不能直观鉴别蜂蜜的真假。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂粉均为现有试剂。

实施例1、天然蜂蜜(homemade honey,HH)培养大肠杆菌DH5α

天然蜂蜜来自养蜂厂，为中华蜜蜂采集多种花源酿制的天然成熟蜂蜜，并经60Co-γ射线照射灭菌，照射剂量为25kGy，剂量率为2000cGy/min。

(1)配制LB液体培养基：含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，用水配制，混合均匀后高压灭菌，即得；

配制LB固体培养基：含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉15g/L，用水配制，混合均匀后高压灭菌，60℃时倒板即得；

(2)将液体大肠杆菌DH5α100μL加入到10mL按步骤(1)方法配制好的LB液体培养基中，37℃200rpm摇菌12h，即得大肠杆菌DH5α菌液；

(3)用步骤(1)中配制好的LB液体培养基稀释待测蜂蜜得到蜂蜜浓度(体积百分含量)分布在100％-0％之间的多个检测样品，体积至2mL，再另取2mL蜂蜜和LB液体培养基分别作为蜂蜜浓度(体积百分含量)为100％和0％的检测样品，即得蜂蜜浓度为100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、0％的11个检测样品；

(4)将步骤(2)得到的大肠杆菌DH5α菌液20μL分别加入到2mL按步骤(3)方法配制好的检测样品中，37℃200rpm摇菌16h混合均匀后，即得培养液样品；

(5)用接种环分别挑取少许步骤(4)得到的培养液样品，分别接种在11个步骤(1)方法配制的同样的LB固体培养基上，37℃恒温划线培养16h；

(6)观察步骤(5)方法培养的各LB固体培养基上的菌落生长情况。

结果示于图1，蜂蜜浓度在0％-40％的检测样品均出现菌落，蜂蜜浓度在50％-100％的检测样品均未出现菌落，表明该待测蜂蜜(HH)具有杀菌作用，不是人造蜂蜜。

另外，数据还显示无菌落生长的最低蜂蜜浓度为50％，将无菌落生长的最低蜂蜜浓度定义为该蜂蜜的最低杀菌浓度(体积百分含量)(minimum bactericidalconcentration，MBC)，则表明HH对大肠杆菌DH5α的MBC为50％，该数据可作为鉴定该天然蜂蜜掺假程度的指标：已知本实施例的待测蜂蜜为天然蜂蜜，没有混入人造蜂蜜成分，得到的MBC值为50％，分别取等量的该天然蜂蜜，向其中分别加入不同量的人造蜂蜜(AH，人造蜂蜜是用果糖40.5g、葡萄糖33.5g、麦芽糖7.5g和蔗糖1.5g溶于17g去离子水中再经灭菌得到)，按照上述步骤(1)-(6)的方法找出各比例的混合蜂蜜的最低杀菌浓度(体积百分含量)(MBC)，结果如表1所示，可以看出天然蜂蜜和人造蜂蜜混合得到的混合蜂蜜的MBC均高于该天然蜂蜜本身的MBC值，因此可以利用这个原理来判断此种天然蜂蜜中掺入人造蜂蜜的程度，并以此数据作为评价蜂蜜真假的指标之一，MBC值越高，表明人造蜂蜜的掺入比例越高，MBC值越低，表明人造蜂蜜的掺入比例越低；在表1的情形下，当人造蜂蜜的掺入比例高于天然蜂蜜时，检测不出该混合蜂蜜的MBC值(即MBC值超过100％)。

表1混合蜂蜜的杀菌效果

实施例2、人造蜂蜜(artificial honey,AH)培养大肠杆菌DH5α

本实施例中人造蜂蜜(AH)为实验室配制，是将果糖40.5g、葡萄糖33.5g、麦芽糖7.5g和蔗糖1.5g溶于17g去离子水配制好后，再经60Co-γ射线照射灭菌(照射剂量为25kGy，剂量率为2000cGy/min)得到。

步骤(1)至(6)操作同实施例1。

步骤(6)菌落生长情况见图2，显示AH所有蜂蜜浓度的检测样品均有菌落生长，表明未检出AH对大肠杆菌DH5α的MBC，即检测样品的蜂蜜浓度为100％时对大肠杆菌DH5α仍无杀灭作用，则该蜂蜜为人造蜂蜜。

实施例3、商品蜂蜜A培养大肠杆菌DH5α

步骤(1)至(6)操作同实施例1，其中：

步骤(2)37℃200rpm摇菌10h；

步骤(4)37℃200rpm摇菌18h；

步骤(5)37℃恒温划线培养20h。

步骤(6)菌落生长情况见图3，显示商品蜂蜜A所有蜂蜜浓度的检测样品均有菌落生长，表明未检出商品蜂蜜A对大肠杆菌DH5α的MBC，即检测样品的蜂蜜浓度为100％时对大肠杆菌DH5α仍无杀灭作用，则该商品蜂蜜A为人造蜂蜜。

实施例4、商品蜂蜜B培养大肠杆菌DH5α

步骤(1)至(6)操作同实施例1，其中：

步骤(2)37℃200rpm摇菌10h；

步骤(4)37℃200rpm摇菌17h；

步骤(5)37℃恒温划线培养25h。

步骤(6)菌落生长情况见图4，显示商品蜂蜜B所有蜂蜜浓度的检测样品均有菌落生长，表明未检出商品蜂蜜B对大肠杆菌DH5α的MBC，即检测样品的蜂蜜浓度为100％时对大肠杆菌DH5α仍无杀灭作用，则该商品蜂蜜B为人造蜂蜜。

实施例5、商品蜂蜜C培养大肠杆菌DH5α

步骤(1)至(6)操作同实施例1，其中：

步骤(2)37℃200rpm摇菌11h；

步骤(4)37℃200rpm摇菌20h；

步骤(5)37℃恒温划线培养29h。

步骤(6)菌落生长情况见图5，显示商品蜂蜜C所有蜂蜜浓度的检测样品均有菌落生长，表明未检出商品蜂蜜C对大肠杆菌DH5α的MBC，即检测样品的蜂蜜浓度为100％时对大肠杆菌DH5α仍无杀灭作用，则该商品蜂蜜C为人造蜂蜜。

实施例6、商品蜂蜜D培养大肠杆菌DH5α

步骤(1)至(6)操作同实施例1，其中：

步骤(2)37℃200rpm摇菌12h；

步骤(3)因为商品蜂蜜D粘稠度极高，且高浓度时不容易操作，误差较大，即得多个蜂蜜浓度为40％、30％、20％、10％、0％的5个检测样品；

步骤(4)37℃200rpm摇菌18h；

步骤(5)37℃恒温划线培养23h。

步骤(6)菌落生长情况见图6，显示无菌落生长的最低蜂蜜浓度为20％，表明商品蜂蜜D对大肠杆菌DH5α的MBC为20％，即当检测样品的蜂蜜浓度在20％以上(包括20％)时对大肠杆菌就有杀灭作用，则该商品蜂蜜D不是人造蜂蜜。

就本发明方法而言，步骤(6)中能检测出待测蜂蜜对大肠杆菌DH5α的MBC，即说明此待测蜂蜜配制出的检测样品在此蜂蜜浓度及以上能够杀灭大肠杆菌DH5α，从而说明此待测蜂蜜不是人造蜂蜜；未检测出待测蜂蜜对大肠杆菌DH5α的MBC，说明该蜂蜜检测样品的蜂蜜浓度为100％时对大肠杆菌DH5α仍无杀灭作用，则该待测蜂蜜为人造蜂蜜。

虽然本发明方法步骤(6)中能检测出待测蜂蜜对大肠杆菌DH5α的MBC，一般100％含量的天然蜂蜜对大肠杆菌DH5α的MBC≦70％，MBC超过70％通常认为是在天然蜂蜜中掺杂了人造蜂蜜；而在≦70％范围内MBC的大小与蜂蜜的质量优劣无关，因为每种蜂蜜中主要的抗菌成分和含量不同，抗菌机理也可能不同，因此抗菌能力也就不同。如实施例1中HH对大肠杆菌DH5α的MBC为50％，实施例6中商品蜂蜜D对大肠杆菌DH5α的MBC为20％，并不能说明商品蜂蜜D质量好于HH。但是对于同一种蜂蜜(不包括人造蜂蜜)，可以通过MBC值来评价其中的掺假程度，也就是在天然蜂蜜中混入人造蜂蜜或糖类、淀粉等造假成分后，比较它们的MBC值，混入造假成分的比没混入的要高，而且混入的造假成分越多，MBC越大。因此也可以根据此原理得出掺假程度不同的多种蜂蜜的MBC值，并将此数值作为数据库，将待测蜂蜜的蜂蜜种类与数据库匹配后，即可得出检测样品中人造成分的添加含量。

以上说明可以看出，相比目前蜂蜜的鉴别需要结合一整套的方法对各种糖浆进行鉴定，才能得出可靠结论，检测程序复杂、费时、效率低、成本高，本发明的方法简单、易于操作、效率高、成本低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种鉴别天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法，其特征在于，所述人造蜂蜜为不含有天然蜂蜜成分的蜂蜜，将由待测蜂蜜配成的蜂蜜浓度不同的检测样品分别与相同量的大肠杆菌DH5α菌液混合后加入固体培养基中培养菌落，观察菌落是否能够在所述检测样品达到某一蜂蜜浓度后全部被杀灭；若检测样品达到该蜂蜜浓度后，菌落全部被杀灭，则该待测蜂蜜不是人造蜂蜜；当检测样品的蜂蜜浓度达到100％菌落仍然存活，则该待测蜂蜜是人造蜂蜜；所述检测样品是将所述待测蜂蜜用无菌液稀释成不同蜂蜜浓度得到的，所述无菌液为无菌的LB液体培养基，所述固体培养基为LB固体培养基；

所述方法，包括以下步骤：

(1)配制LB液体培养基：含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，用水配制，混合均匀后高压灭菌，即得；

配制LB固体培养基：含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L，用水配制，混合均匀后高压灭菌，60℃时倒板即得；

(2)将大肠杆菌DH5α加入到按步骤(1)方法配制好的LB液体培养基中，37℃200rpm摇菌10-12h，即得大肠杆菌DH5α菌液，其中所述大肠杆菌DH5α与所述LB液体培养基的体积比为1:100；

(3)用步骤(1)中配制好的LB液体培养基稀释待测蜂蜜得到蜂蜜体积百分浓度分布在100％-0％之间且不含端值的多个检测样品，另取待测蜂蜜和LB液体培养基分别作为蜂蜜体积百分浓度为100％和0％的检测样品，即得多个不同蜂蜜浓度的检测样品；

(4)将步骤(2)得到的大肠杆菌DH5α菌液分别加入到按步骤(3)方法配制好的检测样品中，37℃200rpm摇菌16-20h混合均匀后，即得培养液样品，其中所述大肠杆菌DH5α菌液与所述检测样品的体积比为1:100；

(5)将步骤(4)得到的培养液样品接种在步骤(1)方法配制的LB固体培养基上37℃恒温培养16-29h；

(6)观察步骤(5)方法培养的菌落生长情况，菌落全部被杀灭的检测样品对应的最小蜂蜜浓度记为最低杀菌浓度，若该蜂蜜浓度数值小于100％，则该待测蜂蜜不是人造蜂蜜；若检测样品的蜂蜜浓度达到100％菌落仍然存活，则该待测蜂蜜是人造蜂蜜。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(5)中的恒温培养时间为16-20h。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于：所述检测样品的蜂蜜体积百分浓度依次为100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、0％。

4.根据权利要求1或2所述方法：其特征在于：步骤(5)中是将步骤(4)得到的培养液样品接种在步骤(1)方法配制的LB固体培养基上划线培养。

5.根据权利要求3所述方法：其特征在于：步骤(5)中是将步骤(4)得到的培养液样品接种在步骤(1)方法配制的LB固体培养基上划线培养。