CN106086124A - 一种酱油用天然防腐剂抗菌肽及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
一种酱油用天然防腐剂抗菌肽及其制备和使用方法，属于食品防腐剂技术领域。其制备方法是将副干酪乳杆菌坚韧亚种FX‑6‑1菌株接种于MRS液体培养基中培养，活化菌株，将活化菌株用MRS培养基稀释，再将脱脂豆浆接种稀释后的活化菌株，添加葡萄糖和酵母粉，在30～35℃下发酵70～75 h，发酵液离心分离，去上清液，过滤，将滤液真空冷冻干燥成粉末状后冷冻保存，即得一种酱油用天然防腐剂‑抗菌肽。本发明用于酱油防腐剂，可有效延长酱油的货架期，不仅能保证酱油的营养及口感，而且安全卫生，天然无毒。
Description
技术领域
本发明涉及食品防腐剂技术领域，具体涉及一种以副干酪乳杆菌发酵脱脂大豆分离纯化的天然防腐剂抗菌肽及其制备和使用方法。
技术背景
随着现代科技的进步和人们生活水平的提高，自然与健康在饮食中占有着越来越重要的地位。传统的化学防腐剂，不仅会产生不良味道，影响食物的味道和口感，还会残留一些对人体有害的成分，因此近年来，安全、无毒、天然、高效的食品防腐剂的开发与利用备受重视。
酱油是中国独特、常用、居家必备的传统调味品，具有两千多年的历史，受到广大消费者的喜爱。目前市面上所销售的绝大多数酱油依然采用化学防腐剂或加热灭菌的方法，其中主要使用的化学防腐剂是苯甲酸钠或苯甲酸及其盐类。苯甲酸钠虽然是目前国际上公认的比较安全的化学合成防腐剂之一，但是也曾有案例报道食用过量苯甲酸钠而造成荨麻疹和假过敏症状；而加热灭菌不仅需要消耗大量的能源，同时也导致酱油中氨基酸等重要的营养成分损失，香气成分含量降低，甚至还会引起酱油总酸上升和色泽加深等问题,严重影响了酱油的品质。因此，安全无毒、高效的酱油防腐剂成为食品领域的研究热点之一。
在酱油的加工、运输和贮藏过程中，微生物的污染和繁殖是导致其腐败变质的主要原因，由于酱油本身作为发酵产品的特殊性，微生物种类和功能十分复杂，对所使用防腐剂的质量要求很高。因此，现在需要一种天然的防腐剂，同时具有高效性、广谱性、稳定性等特点，能够在保持酱油原有风味的同时，延长酱油的货架期。中国专利申请公开的“一种酱油防腐保鲜剂”（ CN101238910），由鱼精蛋白75％～90％，蔗糖脂肪酸酯2％～10％，乙二胺四乙酸2％～10％和谷氨酸钠2％～5％组成。这种酱油防腐保鲜剂的效果已经达到或超过苯甲酸钠和山梨酸钾的防腐保鲜效果。但其含有乙二胺四乙酸等化学成分，不属于天然防护剂，而且其中的乙二胺四乙酸容易与食品中的金属离子形成乙二胺四乙酸盐，对人体有一定危害。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酱油用天然防腐剂，其利用副干酪乳杆菌发酵脱脂大豆分离纯化得到一种抗菌肽，该抗菌肽用于酱油防腐剂，可有效延长酱油的货架期，不仅能保证酱油的营养及口感，而且安全卫生，天然无毒。本发明还提供一种酱油用天然防腐剂的制备和使用方法。
为实现上述目的，本发明的实施方案为：一种酱油用天然防腐剂抗菌肽，由包括以下步骤的方法制成：
（1）将生长对数期的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1菌株按照体积比1～3:20接种于MRS液体培养基中，在35～40 ℃下摇床培养10～16 h ，活化菌株，所述副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2014043，保藏日期为2014年02月23日；
（2） 将活化菌株用MRS培养基以体积比为1:10~14的比例稀释至OD600=0.15~0.3；
（3）取脱脂大豆加入水中，混匀、磨碎并煮沸，用四层纱布将粗豆渣过滤并除去，将过滤后的脱脂豆浆用巴氏消毒法处理；
（4）将脱脂豆浆置于发酵罐中，接种步骤（2）稀释后的活化菌株，添加葡萄糖和酵母粉，将发酵罐内各种物质彻底摇匀溶解，放置在30～35 ℃发酵70～75 h；
（5）发酵完成后，将发酵液离心分离，去上清液，过滤；
（6）将滤液真空冷冻干燥成粉末状后冷冻保存，即得一种酱油用天然防腐剂-抗菌肽。
作为优化，步骤（1）中，所述FX-6-1菌株在MRS液体培养基的接种量为8～10%。
作为优化，步骤（3）中，所述脱脂大豆和水的质量体积配比为1～3:6。
作为优化，步骤（4）中，所述稀释后的活化菌株和脱脂豆浆的质量体积配比为5～15：100。进一步优化的是，所述稀释后的活化菌株和脱脂豆浆的质量体积配比为9：100。
作为优化，步骤（4）中，所述葡萄糖与脱脂豆浆的质量体积比为3～4：100，进一步优化的是，所述葡萄糖与脱脂豆浆的质量体积比为3.44：100。
作为优化，步骤（4）中，所述酵母粉与脱脂豆浆的质量体积比为1～3：100。
作为优化，步骤（4）中，发酵温度32 ℃，发酵时间72 h。
作为优化，步骤（5）中，所述离心分离转速4000 r/min，时间10 min。
作为优化，步骤（6）中，所述冷冻干燥温度为-40 ℃，冷冻保存温度为-20 ℃。
本发明还提供一种酱油用天然防腐剂抗菌肽的使用方法，包括：取上述制备好的酱油用天然防腐剂，在酱油原液（淋油后灭菌，不添加任何防腐剂）中加入抗菌肽，其中抗菌肽与酱油原液的质量比为0.1～0.5：:100。
本发明确认所获得的抗菌肽活性经牛津杯扩散法实验检测分析，发现其对大肠杆菌(Escherlchia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）等细菌，及鲁氏酵母（Phylum Sarcomastigophora）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑根霉（Rhizopus nigricans）等易引起酱油腐败的真菌具有显著抑制作用，
本发明的优点在于：（1）所用生产菌菌株副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1是从西藏开菲尔发酵乳中分离得到的，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2014043，保存日期为2014年02月23日；（2）本发明发酵培基成本比较低，发酵培基主要成分是价格相对廉价的脱脂大豆，无需大豆蛋白栋、牛肉膏、酵母提取物、Na2SO3、NaAc等试剂型培养基，这在实际生产应用中将大大节约成本，简单方便；（3）本发明制备天然防腐剂抗菌肽的过程简单，无需脱盐处理；（4）本发明所得天然防腐剂抗菌肽抗菌谱广，对大肠杆菌(Escherlchia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）等细菌，及鲁氏酵母（Phylum Sarcomastigophora）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑根霉（Rhizopus nigricans）等易引起酱油腐败的真菌具有显著抑制作用；（5）本发明制备天然防腐剂抗菌肽来源于脱脂大豆，与酱油具有同源性，能够最大限度的保存酱油的营养成分及口感，并延长的货架期，安全卫生，天然无毒。
附图说明
图1是酱油用天然防腐剂HPLC色谱图。
图2是酱油用天然防腐剂在高盐条件下对鲁氏酵母生长曲线的影响。
图3是酱油用天然防腐剂在高盐条件下对产膜酵母生长曲线的影响。
图4是酱油添加不同浓度天然防腐剂抗菌肽后再37 ℃贮藏过程中感官评分的变化。
图5是酱油在37 ℃贮藏过程中pH的变化。
图6是酱油在37 ℃贮藏过程中氨基酸态氮的变化。
图7是酱油在37 ℃贮藏过程中的光密度变化。
图8是酱油在37 ℃贮藏过程中细菌菌落总数的变化。
具体实施方法
下面给出本发明的实施例，具体阐述本发明。
实施例1：
一种酱油用天然防腐剂抗菌肽的制备方法：
将100 μL副干酪乳杆菌FX-6-1菌液加至1 mLMRS液体培养基中，于摇床37 ℃，150 r/min培养10～18 h。取1 mL活化菌液，用MRS培养基以1:14的比例稀释，OD600=0.2。按脱脂大豆与水按质量比为1:3制备脱脂豆浆，用滤布过滤并将弃除的粗豆渣，将过滤脱脂豆浆在85℃下灭菌30 min，将4 L处理好的脱脂豆浆置于发酵瓶中，按9%（m/v）的比例接种活化后的FX-6-1菌，按照3.44%（m/v）的比例添加葡萄糖, 按照2%（m/v）的比例酵母粉。将发酵罐内各种物质彻底摇匀溶解，放置在32 °C发酵72 h。发酵完毕后取出，将发酵液置于4000 r/min下离心10 min，取上清液。将上清液用0.2 nm孔径的滤纸过膜，取滤液备用。收集多次滤液于-40 ℃真空冷冻干燥成粉末状后- 20 ℃低温保存，即得一种酱油用天然防腐剂-抗菌肽。
实施例2：
一种天然防腐剂抗菌肽的制备方法：
将120 μL 副干酪乳杆菌FX-6-1菌液加至1 mL MRS液体培养基，于摇床38 °C，150 r/min培养10～18 h。取1 mL活化菌液，用MRS培养基以1:14的比例稀释，OD600=0.2。按脱脂大豆与水按质量比为1:4制备脱脂豆浆，用滤布过滤并将弃除的粗豆渣，将过滤后的脱脂豆浆在90 ℃下灭菌20 min，将4 L处理好的脱脂豆浆置于发酵瓶中，按15%（m/v）的比例接种活化后的FX-6-1菌，按照3.2%（m/v）的比例添加葡萄糖, 按照2%（m/v）的比例酵母粉。将发酵罐内各种物质彻底摇匀溶解，放置在35 °C发酵70 h。发酵完毕后取出，将发酵液置于4000r/min下离心10 min，取上清液。将上清液用0.2 nm孔径的滤纸过膜，取滤液备用。收集多次滤液于-40 ℃真空冷冻干燥成粉末状后- 20 ℃低温保存，即得一种酱油用天然防腐剂-抗菌肽。
实施例3：
一种天然防腐剂抗菌肽的制备方法：
将150 μL 副干酪乳杆菌FX-6-1菌液加至1 mL MRS液体培养基，于摇床40 ℃，150 r/min培养10～18 h。取1 mL活化菌液，用MRS培养基以1:14的比例稀释，OD600=0.2。按脱脂大豆与水按质量比为1:3.5制备脱脂豆浆，将脱脂豆浆与豆渣搅拌混合均匀在85 ℃下灭菌30min，将4 L处理好的脱脂豆浆置于发酵瓶中，按10%（m/v）的比例接种活化后的FX-6-1菌，按照3.44%（m/v）的比例添加葡萄糖, 按照2.5%（m/v）的比例酵母粉。将发酵罐内各种物质彻底摇匀溶解，放置在30 °C发酵75 h。发酵完毕后取出，将发酵液置于4000 r/min下离心10min，取上清液。将上清液用0.2 nm孔径的滤纸过膜，取滤液备用。收集多次滤液于-40 ℃真空冷冻干燥成粉末状后- 20 ℃低温保存，即得一种酱油用天然防腐剂-抗菌肽。
实施例1为优选方案。上述实施例中，所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1菌株已经保藏于于2014年02月23日保藏于位于武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014043。
实施例4：
一种天然防腐剂抗菌肽的使用方法:
用去离子水将上述制备好的酱油用天然防腐剂抗菌肽稀释成10%的溶液，在酱油原液中按照1%的比例添加抗菌肽溶液，并混合均匀。
实施例5：
本发明提供的天然防腐剂抗菌肽的抗菌谱分析：
采用琼脂牛津杯扩散法对天然防腐剂抗菌肽进行抗菌谱分析，具体方法是：
5.1指示菌活化
在超净工作台中挑取4 ℃保存的试管斜面指示菌单菌于8 mL LB肉汤培养基，放置于恒温摇床，37 ℃下150 r/min过夜培养。将过夜活化的指示菌液稀释至菌浓度为1×108CFU/mL，备用。
5.2检测平板制备
将灭菌处理的LB琼脂冷却至40 ～50 °C，在无菌条件下向水平放置的培养皿（9 cm）中转移12-20 mL培养基。琼脂平板凝固后，将指示菌液按照1:10～14的比例混入琼脂培养基中并摇晃均匀，稀释至菌浓度为1×108 CFU/mL。随后用移液枪吸取0.2 mL稀释后的菌液，均匀滴加在凝固的琼脂平板表面，用无菌涂布器将菌液涂布均匀。
5.3抑菌活性测定
用镊子将灭菌后的牛津杯（内径6±0.1 mm，外径7±0.1 mm）平稳置于检测平板表面，可以适当按压以固定。将天然防腐剂抗菌肽加入蒸馏水溶解，最终浓度为100 mg/mL，用移液枪准确吸取0.2 mL天然防腐剂抗菌肽溶液至牛津杯，在37 ℃下恒温静置培养12 h，游标卡尺测抑菌圈直径。天然防腐剂抗菌肽抗菌谱的结果见表1。
从表1可以知，天然防腐剂抗菌肽的抑菌谱广泛，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有显著抑制作用，对鲁氏酵母、黑曲霉、黄曲霉和黑根酶等真菌也具有不同程度的抑制作用。
实施例6
本发明提供天然防腐剂抗菌肽在高盐条件下对酱油中常见耐盐菌的抑制作用分析：
6.1指示菌活化
在PDA液体培养基中添加9%的NaCl，充分溶解后灭菌处理。在超净工作台中挑取4 ℃保存的试管斜面指示菌鲁氏酵母单菌于8 mL 加盐PDA培养基，放置于恒温摇床，30 ℃下150r/min过夜培养。将过夜活化的指示菌液稀释至菌浓度为1×108 CFU/mL，备用。另挑取4 ℃保存的试管斜面混合产膜酵母菌于8 mL加盐PDA培养基，其他操作步骤同鲁氏酵母。
6.2 样品添加
使用96孔板法，每组添加样品如表2，每组3个平行，其中苯甲酸钠溶液和天然防腐剂抗菌肽溶液均用9%的NaCl溶液作为溶剂配置。
6.3抑菌活性测定
用酶标仪在600 nm下测量样品添加后0～14 h的OD 值，每2 h测量一次，天然防腐剂抗菌肽在高盐条件下对酱油鲁氏酵母的抑菌效果的结果见表3，对产膜酵母的抑制效果见表4。
从表3和表4可以知，天然防腐剂抗菌肽在高盐条件下，对酱油中常见的耐盐酵母菌具有显著的抑制作用。
实施例7：
本发明提供不同浓度的天然防腐剂抗菌肽在酱油中的应用效果：
此实施例是用于说明本发明，具体试验方法如下：
3.1 酱油原液样品的处理
向酱油原液中添加1%的混合菌液（大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、鲁氏酵母等量混合后稀释至OD600=0.2）。混匀后在自然状态下将样品进行5种处理，处理方法见表5。将处理后的样品摇匀并分装至无菌酱油瓶中，每种处理方式的酱油样品分别分装为10 mL/瓶。将分装好的酱油样品用四层纱布封口后，贮藏于37 ℃恒温箱。请10名接受过严格的感官评定训练的人，分别于处理后0d (贮存3 h 后开始测定）、3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d酱油样品的色泽、香气、 滋味、体态等感官指标进行分析评定，方法参照GB/T 5009.39-2003《酱油卫生标准的分析方法》。以上各项感官指标的评定结果均采用记分制，样品总体评分为各指标评价结果总和的平均值。感官评分表如表6所示。
酱油在37 ℃贮藏过程中感官评价分数的变化如图4所示，在第一天的时候，各组的感官评价的分数基本保持一致，其中添加0.5%抗菌肽的酱油样品带有略微的香甜味，说明添加不同浓度的天然防腐剂抗菌肽都不会对酱油品质产生负面影响，而高浓度的抗菌肽会赋予酱油一种特殊的香甜风味。随着贮藏时间的增长感官评价的分数越来越低，但是无论是在色泽、气味、滋味、透明度方面，0.5%的天然防腐剂抗菌肽组和0.3%的天然防腐剂抗菌肽组都要优于其他实验组的。在贮藏的第15天，添加0%抗菌肽组的酱油的品质已经严重恶化，色泽灰暗，有苦涩滋味。紧接着的是0.1%天然防腐剂抗菌肽组，最后是0.3%和0.5%的抗菌肽组。由此可知随着抗菌肽添加量的增加，有利于酱油在贮藏过程中的品质保持，但是添加高浓度抗菌肽的酱油样品所具有的微微香甜味，可能不被所有人接受，因此选择0.3%为天然防腐剂抗菌肽在酱油中的最佳添加量。
实施例8：
本发明提供天然防腐剂抗菌肽在酱油中的应用
此实施例是用于说明本发明，具体试验方法如下：
3.1 酱油原液样品的处理
向酱油原液中添加1%的混合菌液（大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、鲁氏酵母等量混合后稀释至OD600=0.2）。混匀后在自然状态下将样品进行5种处理，处理方法见表7。然后将处理后的酱油原液摇匀并分装至无菌酱油瓶中，每种处理方式的酱油样分别分装为10 mL/瓶和25mL/瓶。实验分为A、B类型，A类型实验所用酱油样品为10 mL/瓶，用于酱油样品的理化指标的分析测定；B类型实验所用酱油样品为25 mL/瓶，用于酱油样品的微生物指标的分析测定，用于感官指标、理化指标分析测定的每组3个平行，用于微生物指标分析测定的每组2个平行。将分装好的酱油样品，用四层纱布封口后贴上标签，放入37 ℃恒温箱，分别用于0d(贮存3 h后开始测定）、3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d对腐败指标测定。
6.2不同时间段酱油样品理化指标测定
6.2.1 pH值指标的测定
取10 mL酱油样品摇匀后用pH计测定pH值。
6.2.2 氨基酸态氮测定
氨基酸是酱油中重要营养成分，酱油在贮藏过程中，随着微生物的繁殖，氨基酸态氮的含量会随之发生变化。因此可通过测试不同贮藏时间酱油样品中的氨基酸态氮含量，作为评价酱油腐败程度的一个指标。在参照GB/T 5009.39-2003中酱油卫生标准的分析方法中的测定方法，即甲醛值法来测定不同时间段酱油样的氨基酸态氮含量。吸取5.0 mL酱油样品，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0 mL,置于200 mL烧杯中，加60 mL水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=0.050 mol/L]滴定至酸度计只是pH8.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，可计算总算含量。再加入10.0 mL甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准滴定溶液继续弟弟乖至pH9.2，几下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。同时吸取80 mL水，先用氢氧化钠溶液调节至pH为8.2,再加入10.0 mL甲醛溶液，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH9.2，同时做试剂空白试验。
氨基酸态氮的含量可按式（1）进行计算：
式中：
X——试样中氨基酸态氮的含量，单位为克每百毫升（g/100 mL）
V1——测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）
V2——试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升(mL)
V3——试样稀释液取用量，单位为毫升（mL）
C——氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)
0.014——与1.00 mL氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH)=1.000 mol/L]相当的氮的质量，单位为克（g）
计算结果保留两位有效数字。
6.2.3不同时间段酱油透光度测定
用无菌胶头滴管从一瓶酱油样品中吸取适量样品放入比色皿中，同时吸取适量酱油原液作为空白对照，在波长600 nm下用紫外可见光分光光度计测定酱油样品的OD值。
6.3不同时间段酱油样品微生物指标测定
参照GB 4789.2-2010 方法测定酱油样品中的细菌总数。量取25 mL酱油样于盛有225mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中，振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。按此操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿中，倒入15~20 mL冷却至46℃的PCA并转动平皿混匀。同时作空白对照，待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h。平皿计数，结果以对数log CFU/mL表示。参照GB/T 2717-2003，菌落总数值≥3×104 CFU/mL为酱油腐败变质的标准。
酱油在37 ℃贮藏过程中pH的变化如图5所示。在酱油贮藏的过程中，随着微生物的繁殖会产生酸败，导致pH降低。贮藏初期，各组酱油pH基本相同，说明天然防腐剂抗菌肽对酱油的pH无显著影响。贮藏过程中，添加天然防腐剂抗菌肽的酱油pH比对照组要高，说明抗菌肽已有效地抑制微生物的生长。随着贮藏时间的延长，添加天然防腐剂抗菌肽的效果已经和苯甲酸钠组相当。
酱油在37 ℃贮藏过程中氨基酸态氮的变化如图6所示，在贮藏的第一天各个组的氨基酸态氮值都约为0.8 g/100 mL。空白对照组量随着贮藏时间延长而快速下降，而其他添加了防腐剂的实验组，氨基酸态氮值有下降率较低，说明天然防腐剂抗菌肽能够较好的抑制氨基酸态氮的分解。并且从第13天起添加了天然防腐剂抗菌肽的酱油样品中氨基酸态氮的含量超过了添加苯甲酸钠的酱油样品。
酱油在37 ℃贮藏过程中的光密度变化如图7所示。在贮藏过程中，对照组由于微生物的生长繁殖，导致酱油样品变浑浊，光密度明显增加。添加防腐剂的样品中微生物生长收到抑制，样品的浑浊度变化较慢，其中苯甲酸钠组和天然防腐剂抗菌肽组的变化趋势基本相同，贮藏7d后添加苯甲酸钠的酱油样品透光度开始超过天然防腐剂抗菌肽组。
酱油在37 ℃贮藏过程中细菌总数的变化如图8所示，与对照组相比，微生物在添加防腐剂的酱油中的生长是受到显著抑制的。GB2717-2003规定酱油中的细菌总数≤3×104 CFU/mL，空白对照组在第9天的时候细菌总数就超过了3×104 CFU/mL，即酱油已经不新鲜。0.3%的天然防腐剂抗菌肽能够明显抑制酱油中微生物的生长繁殖，并且随着贮藏时间的延长，添加天然防腐剂抗菌肽的样品菌落总数增长量小于苯甲酸钠组，因此天然防腐剂抗菌肽的作用效果更持久。
Claims (9)
1.一种酱油用天然防腐剂抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将生长对数期的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1菌株按照体积比1～3:20接种于MRS液体培养基中，在35～40 ℃下摇床培养10～16 h ，活化菌株，所述副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2014043，保藏日期为2014年02月23日；
（2） 将活化菌株用MRS培养基以体积比为1:10~14的比例稀释至OD600=0.15~0.3；
（3）取脱脂大豆加入水中，混匀、磨碎并煮沸，用四层纱布将粗豆渣过滤并除去，将过滤后的脱脂豆浆用巴氏消毒法处理；
（4）将脱脂豆浆置于发酵罐中，接种步骤（2）稀释后的活化菌株，添加葡萄糖和酵母粉，将发酵罐内各种物质彻底摇匀溶解，放置在30～35 ℃发酵70～75 h；
（5）发酵完成后，将发酵液离心分离，去上清液，过滤；
（6）将滤液真空冷冻干燥成粉末状后冷冻保存，即得一种酱油用天然防腐剂-抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的酱油用天然防腐剂抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述FX-6-1菌株在MRS液体培养基的接种量为8~10%。
3.根据权利要求1所述的酱油用天然防腐剂抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述脱脂大豆和水的质量体积配比为1～3:6。
4.根据权利要求1所述的酱油用天然防腐剂抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述稀释后的活化菌株和脱脂豆浆的质量体积配比为5～15：100，所述葡萄糖与脱脂豆浆的质量体积比为3～4：100，所述酵母粉与脱脂豆浆的质量体积比为1～3：100，所述发酵温度30~35 ℃，发酵时间70~75 h。
5.根据权利要求1或4所说的酱油用天然防腐剂抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述稀释后的活化菌株和脱脂豆浆的质量体积配比为9：100，所述葡萄糖与脱脂豆浆的质量体积比为3.44：100，所述酵母粉与脱脂豆浆的质量体积比为2：100，所述发酵温度32 ℃，发酵时间72 h。
6.根据权利要求1所述的酱油用天然防腐剂抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述离心分离转速4000 r/min，时间10 min。
7.根据权利要求1所述的酱油用天然防腐剂抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤（6）中，所述冷冻干燥温度为-40 ℃，冷冻保存温度为-20 ℃。
8.一种如权利要求1～7任意一项所述的方法制备的酱油用天然防腐剂抗菌肽。
9.一种如权利要求8所述的酱油用天然防腐剂抗菌肽的使用方法，其特征在于，包括：取上述制备好的酱油用天然防腐剂，在酱油原液中加入抗菌肽，其中抗菌肽与酱油原液的质量比为0.1～0.5:100。
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| CN201610692125.4A CN106086124A (zh) | 2016-08-21 | 2016-08-21 | 一种酱油用天然防腐剂抗菌肽及其制备和使用方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN109913521A (zh) * | 2019-04-24 | 2019-06-21 | 仲恺农业工程学院 | 从柚子核中提取多肽的方法、应用、提取得到的多肽及响应面分析法的应用 |
| CN110604284A (zh) * | 2019-10-23 | 2019-12-24 | 四川天味食品集团股份有限公司 | 一种辣味酱油及其制备方法 |
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| CN104855492A (zh) * | 2015-04-02 | 2015-08-26 | 曹庸 | 一种肉制品用天然防腐剂及其制备和使用方法 |
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Patent Citations (1)
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