CN109913521A - 从柚子核中提取多肽的方法、应用、提取得到的多肽及响应面分析法的应用 - Google Patents
从柚子核中提取多肽的方法、应用、提取得到的多肽及响应面分析法的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种从柚子核中提取多肽的方法、应用、提取得到的多肽及响应面分析法的应用，涉及天然物提取技术领域，本发明提供的从柚子核中提取多肽的方法，包括将益生菌接种于柚子核粉末溶液中，发酵培养后进行多肽的提取，并对发酵温度、发酵时间、发酵料液比和益生菌的接种量进行了限定，得到柚子核中的多肽。通过使用益生菌对柚子核进行发酵，安全环保，避免了化学提取方式易导致的溶剂残留等问题。并且，在本发明提供的特定的条件下进行发酵，提取率高，提取得到的活性多肽更接近天然分子构象，活性较高。同时，该方法工艺稳定，方法简单，操作容易，能耗低，提取得到的活性多肽纯度高，具有较好的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及天然物提取技术领域，尤其是涉及一种从柚子核中提取多肽的方法、应用、提取得到的多肽及响应面分析法的应用。
背景技术
柚子，是常见的水果之一，营养丰富，其在100克中含有水分84.8克，热量57千卡，磷43毫克等，而且柚子可以起到美容养颜的食疗效果，另外还具有减肥美体的作用，对于多种疾病也有防治作用。
而柚子核，为芸香科植物柚Citrus maxima(Burin.)Merr.的种子，其中含有丰富的柠檬苦素、粗脂肪、黄酮柏、黄柏内酯、脂肪油、灰分及活性多肽等物质。大多数人将在使用柚子的果肉后，往往把柚子核一丢了之，不仅造成资源的浪费，也对环境造成巨大的压力。我国柚子资源丰富，利用柚子核提取其中的活性多肽并加以开发利用，可获得可观的经济利益，具有广阔的工业前景。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种从柚子核中提取多肽的方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供响应面分析法在优化从柚子核中提取多肽的方法中的应用。
本发明提供了一种从柚子核中提取多肽的方法，包括将益生菌接种于柚子核粉末溶液中，发酵培养后进行多肽的提取，得到柚子核中的多肽；
其中，所述柚子核粉末溶液的料液比为1:7-15g/mL；
所述益生菌的接种量为30％-50％；
所述发酵培养的温度为10-26℃，所述发酵培养的时间为20-80小时。
进一步地，所述益生菌包括酪酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌或酵母菌中的一种或多种，优选为乳杆菌。
进一步地，将干燥的柚子核粉碎至20-40目，得到柚子核粉末；
优选地，接种前还包括将所述柚子核粉末溶液进行灭菌的步骤。
进一步地，所述发酵培养的温度为10-20℃；
优选地，所述发酵培养的时间为35-55小时。
进一步地，对发酵培养的产物进行干燥处理后再进行多肽的提取。
进一步地，将预处理后的发酵培养的产物在温度30-40℃，转速100-200 rpm条件下进行提取；
优选地，所述预处理为调整所述发酵培养的产物的浓度为30-70g/L；
优选地，提取的时间为0.8-1.2h。
进一步地，提取后进行固液分离，取液体得到柚子核中的多肽；
优选地，4500-5500r/min离心15-25min进行固液分离。
进一步地，还包括对得到的柚子核中的多肽进行除杂的步骤；
优选地，所述除杂为沉淀蛋白质。
本发明还提供了应用上述的从柚子核中提取多肽的方法提取得到的多肽。
本发明还提供了上述多肽在制备抗菌产品中的应用。
另外，发明还提供了响应面分析法在优化上述的从柚子核中提取多肽的方法中的应用。
本发明提供的从柚子核中提取多肽的方法，包括将益生菌接种于湿润的柚子核粉末，发酵培养后进行多肽的提取，并对发酵温度、发酵时间、发酵料液比和益生菌的接种量进行了限定，得到柚子核中的多肽。通过使用益生菌对柚子核进行发酵，安全环保，避免了化学提取方式易导致的溶剂残留等问题。同时，通过益生菌发酵提取得到的多肽具有抗菌功能，能够有效抑制大肠杆菌等有害菌种的活性。并且，在本发明提供的特定的条件下进行发酵，提取率高，提取得到的活性多肽更接近天然分子构象，在具有抗菌功能的基础上活性较高。此外，该方法工艺稳定，方法简单，操作容易，能耗低，提取得到的活性多肽纯度高，具有较好的经济效益和社会效益。
通过本发明提的从柚子核中提取多肽的方法提取得到的多肽为功能性多肽，其具有较强的抗菌作用，能够有效抑制和杀灭大肠杆菌等有害菌。因此，应用本发明提供的多肽能够制备抗菌产品，且制备得到的抗菌产品安全环保，无毒无害。
本发明采用响应面分析法对上述从柚子核中提取多肽的方法进行优化，仅设置少量的实验组即可得出优化结果，获得最佳产率，在提高了提取效率的同时降低了能耗和污染物排放，具有工业化生产的实际意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A为本发明实验例2提供的空白对照对大肠杆菌MIC＝12.50ug/ml 结果图；
图1B为本发明实验例2提供的阴性对照对大肠杆菌MIC＝12.50ug/ml 结果图；
图1C为本发明实验例2提供的使用对比例6提供的多肽对大肠杆菌 MIC＝12.50ug/ml结果图；
图1D为本发明实验例2提供的使用实施例4提供的多肽对大肠杆菌 MIC＝12.50ug/ml结果图；
图2为本发明实施例6提供的发酵温度、发酵时间、发酵料液比、接种量的交互作用图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是：
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份指的是相对于组合物的重量百分数或重量份。
本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“3～30”表示本文中已经全部列出了“3～30”之间的全部实数，“3～30”只是这些数值组合的缩略表示。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。
本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明提供了一种从柚子核中提取多肽的方法，包括将益生菌接种于柚子核粉末溶液中，发酵培养后进行多肽的提取，得到柚子核中的多肽；
其中，所述柚子核粉末溶液的料液比为1:7-15；
所述益生菌的接种量为30％-50％；
所述发酵培养的温度为10-26℃，所述发酵培养的时间为20-80小时。
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。通过使用益生菌对柚子核进行发酵，安全环保，避免了化学提取方式易导致的溶剂残留等问题。同时，通过益生菌发酵提取得到的多肽具有抗菌功能，能够有效抑制大肠杆菌等有害菌种的活性。并且，在本发明提供的特定的条件下进行发酵，提取率高，提取得到的活性多肽更接近天然分子构象，在具有抗菌功能的基础上活性较高。此外，该方法工艺稳定，方法简单，操作容易，能耗低，提取得到的活性多肽纯度高，具有较好的经济效益和社会效益。
其中，所述湿润的柚子核粉末的料液比例如可以为，但不限于1:7g/mL、 1:8g/mL、1:9g/mL、1:10g/mL、1:11g/mL、1:12g/mL、1:13g/mL、1:14g/mL 或1:15g/mL；在上述湿润度范围内的柚子核粉末更适于益生菌的生长繁殖，从而保证发酵效率。
所述乳杆菌的接种量例如可以为，但不限于30％、32％、34％、36％、 38％、40％、42％、44％、46％、48％或50％；当乳杆菌的接种量在30％-50％时，能够保证益生菌良好的增长率，从而保证发酵效率，提高活性多肽的提取率。
所述发酵培养的温度例如可以为，但不限于10℃、12℃、15℃、18℃、 20℃、22℃、24℃或26℃，优选为10-20℃；所述发酵培养的时间例如可以为，但不限于20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50 小时、55小时、60小时、65小时、70小时、75小时或80小时，优选为 35-55小时。采用上述发酵条件对柚子核进行发酵，活性多肽的提取率更高。
在一些优选的实施方式中，所述益生菌包括酪酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌或酵母菌中的一种或多种，优选为乳杆菌。
乳杆菌广泛分布于含有碳水化合物的动植物发酵产品中，也见于温血动物的口腔、阴道和肠道内。乳杆菌分解糖的能力强，但利用肽类物质的能力较低，因此在对柚子核的分解过程中能够极大程度的保留活性多肽，保证提取率高。
在一些优选的实施方式中，将干燥的柚子核粉碎至20-40目，得到柚子核粉末。
将柚子核粉碎至20-40目，能够使益生菌与柚子核的接触更全面，发酵更彻底，从而保证活性多肽的高提取率。粉碎的细度例如可以为，但不限于20目、22目、24目、26目、28目、30目、32目、34目、36目、38目或40目。
优选地，接种前还包括将所述柚子核粉末溶液进行灭菌的步骤。
接种前先进行灭菌操作能够避免杂菌的干扰，一方面提高发酵效率，另一方面使发酵得到的活性多肽质量得到保证。
对灭菌的方式不做限定，典型的灭菌可以为物理灭菌，例如高温蒸汽灭菌或紫外灭菌，具体地，可以在121℃下灭菌20min。
在一些优选的实施方式中，对发酵培养的产物进行干燥处理后再进行多肽的提取。
对发酵培养的产物进行干燥处理，便于发酵产物的贮存，优选地，在4℃条件下对发酵培养的产物进行短期贮存。
对干燥的方式不做限定，典型的干燥方式可以为风干干燥或高温干燥，具体地，可以在60℃烘箱中干燥48小时。
在一些优选的实施方式中，将预处理后的发酵培养的产物在温度 30-40℃，转速100-200rpm条件下进行提取；
其中温度例如可以为，但不限于30℃、32℃、34℃、36℃、38℃或40℃；转速例如可以为，但不限于100rpm、120rpm、140rpm、160rpm、180rpm 或200rpm。
优选地，所述预处理为调整所述发酵培养的产物的浓度为30-70g/L，例如可以为，但不限于30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、 60g/L、65g/L或70g/L；
优选地，提取的时间为0.8-1.2小时，例如可以为，但不限于0.8小时、 0.9小时、1小时、1.1小时或1.2小时。
在本发明提供的优选提取条件下进行活性多肽的提取，提取率更高。
在一些优选的实施方式中，提取后进行固液分离，取液体得到柚子核中的多肽；
优选地，4500-5500r/min离心15-25min进行固液分离，其中离心速度例如可以为，但不限于4500r/min、4800r/min、5000r/min、5200r/min或5500r/min，离心时间例如可以为，但不限于15min、18min、20min、22min 或25min。
在一些优选的实施方式中，还包括对得到的柚子核中的多肽进行除杂的步骤；
优选地，所述除杂为沉淀蛋白质。
蛋白质会对活性多肽的检测产生影响，对提取产物进行除蛋白质处理能够保证提取得到的活性多肽的纯度更高。
在一个具体的实施方式中，沉淀蛋白质的方法可以为：每1ml样品，加入1ml的10％(w/v)的三氯乙酸(TCA)水溶液混合均匀，静置10min, 于4200r/min下离心30min，取上清液，得到活性多肽。
本发明还提供了上述的从柚子核中提取多肽的方法在制备抗菌产品中的应用。
通过本发明提的从柚子核中提取多肽的方法提取得到的多肽为功能性多肽，其具有较强的抗菌作用，能够有效抑制和杀灭大肠杆菌等有害菌。因此，应用本发明提供的多肽能够制备抗菌产品，且制备得到的抗菌产品安全环保，无毒无害。
典型的抗菌产品可以为抗菌保鲜膜、抗生素、保健品等。
另外，本发明还提供了响应面分析法在优化上述的从柚子核中提取多肽的方法中的应用。
响应面分析法，即响应曲面设计方法(Response Surface Methodology， RSM)，是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。
本发明采用响应面分析法对上述从柚子核中提取多肽的方法进行优化，仅设置少量的实验组即可得出优化结果，获得最佳产率，在提高了提取效率的同时降低了能耗和污染物排放，具有工业化生产的实际意义。
下面结合具体实施例和对比例，对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例提供了一种从柚子核中提取多肽的方法，包括如下步骤：
(1)原料：梅州金柚柚子核。
(2)捣碎：称取一定量已风干的柚子核，经组织捣碎机粉碎后，用20 目筛子过筛，得柚子核粉末。
(3)接种：将已进行预处理的柚子核粉末精密称取1g于锥形瓶中，按1:15的料液比用超纯水将其浸湿，于121℃灭菌20min后，以30％的接种量将乳杆菌接种于柚子核粉末表面。
(4)发酵：将锥形瓶放置于26℃的培养箱中培养20小时。发酵完成后立即将样品放置在60℃烘箱中干燥48h，并立即储存在4℃以备用。
(5)提取多肽：用超纯水调整锥形瓶中发酵培养的产物的浓度为70 g/L，在30℃温度，200rpm转速下用恒温摇床提取0.8h。提取后倒入离心管以5500r/min的转速离心15min，取上清液定容至50ml，并立即储存在 4℃以备用。
(6)沉淀蛋白质：为避免蛋白质对多肽含量检测的影响，取1ml样品，加入1ml的10％(w/v)的三氯乙酸(TCA)水溶液混合均匀，静置10min, 于4200r/min下离心30min，取上清液，得到活性多肽。
实施例2
本实施例提供了一种从柚子核中提取多肽的方法，包括如下步骤：
(1)原料：梅州金柚柚子核。
(2)捣碎：称取一定量已风干的柚子核，经组织捣碎机粉碎后，用40 目筛子过筛，得柚子核粉末。
(3)接种：将已进行预处理的柚子核粉末精密称取1g于锥形瓶中，按1:7的料液比用超纯水将其浸湿，于121℃灭菌20min后，以50％的接种量将乳杆菌接种于柚子核粉末表面。
(4)发酵：将锥形瓶放置于10℃的培养箱中培养80小时。发酵完成后立即将样品放置在60℃烘箱中干燥48h，并立即储存在4℃以备用。
(5)提取多肽：用超纯水调整锥形瓶中发酵培养的产物的浓度为30 g/L，在40℃温度，100rpm转速下用恒温摇床提取1.2h。提取后倒入离心管以4500r/min的转速离心25min，取上清液定容至50ml，并立即储存在 4℃以备用。
(6)沉淀蛋白质：为避免蛋白质对多肽含量检测的影响，取1ml样品，加入1ml的10％(w/v)的三氯乙酸(TCA)水溶液混合均匀，静置10min, 于4200r/min下离心30min，取上清液，得到活性多肽。
实施例3
本实施例提供了一种从柚子核中提取多肽的方法，包括如下步骤：
(1)原料：梅州金柚柚子核。
(2)捣碎：称取一定量已风干的柚子核，经组织捣碎机粉碎后，用30 目筛子过筛，得柚子核粉末。
(3)接种：将已进行预处理的柚子核粉末精密称取1g于锥形瓶中，按1:11的料液比用超纯水将其浸湿，于121℃灭菌20min后，以40％的接种量将乳杆菌接种于柚子核粉末表面。
(4)发酵：将锥形瓶放置于18℃的培养箱中培养50小时。发酵完成后立即将样品放置在60℃烘箱中干燥48h，并立即储存在4℃以备用。
(5)提取多肽：用超纯水调整锥形瓶中发酵培养的产物的浓度为50 g/L，在35℃温度，150rpm转速下用恒温摇床提取1h。提取后倒入离心管以5000r/min的转速离心20min，取上清液定容至50ml，并立即储存在4℃以备用。
(6)沉淀蛋白质：为避免蛋白质对多肽含量检测的影响，取1ml样品，加入1ml的10％(w/v)的三氯乙酸(TCA)水溶液混合均匀，静置10min, 于4200r/min下离心30min，取上清液，得到活性多肽。
实施例4
本实施例提供了一种从柚子核中提取多肽的方法，包括如下步骤：
(1)原料：梅州金柚柚子核。
(2)捣碎：称取一定量已风干的柚子核，经组织捣碎机粉碎后，用30 目筛子过筛，得柚子核粉末。
(3)接种：将已进行预处理的柚子核粉末精密称取1g于锥形瓶中，按1:15的料液比用超纯水将其浸湿，于121℃灭菌20min后，以50％的接种量将乳杆菌接种于柚子核粉末表面。
(4)发酵：将锥形瓶放置于10℃的培养箱中培养40小时。发酵完成后立即将样品放置在60℃烘箱中干燥48h，并立即储存在4℃以备用。
(5)提取多肽：用超纯水调整锥形瓶中发酵培养的产物的浓度为50 g/L，在37℃温度，150rpm转速下用恒温摇床提取1h。提取后倒入离心管以5000r/min的转速离心20min，取上清液定容至50ml，并立即储存在4℃以备用。
(6)沉淀蛋白质：为避免蛋白质对多肽含量检测的影响，取1ml样品，加入1ml的10％(w/v)的三氯乙酸(TCA)水溶液混合均匀，静置10min, 于4200r/min下离心30min，取上清液，得到活性多肽。
实施例5
本实施例提供了一种从柚子核中提取多肽的方法，包括如下步骤：
(1)原料：梅州金柚柚子核。
(2)捣碎：称取一定量已风干的柚子核，经组织捣碎机粉碎后，用50 目筛子过筛，得柚子核粉末。
(3)接种：将已进行预处理的柚子核粉末精密称取1g于锥形瓶中，按1:15的料液比用超纯水将其浸湿，以50％的接种量将乳杆菌接种于柚子核粉末表面。
(4)发酵：将锥形瓶放置于10℃的培养箱中培养40小时。发酵完成后立即将样品放置在80℃烘箱中干燥24h，并立即储存在4℃以备用。
(5)提取多肽：用超纯水调整锥形瓶中发酵培养的产物的浓度为80 g/L，在45℃温度，220rpm转速下用恒温摇床提取0.5h。提取后倒入离心管以6000r/min的转速离心10min，取上清液定容至50ml，并立即储存在 4℃以备用。
(6)沉淀蛋白质：为避免蛋白质对多肽含量检测的影响，取1ml样品，加入1ml的10％(w/v)的三氯乙酸(TCA)水溶液混合均匀，静置10min, 于4200r/min下离心30min，取上清液，得到活性多肽。
对比例1
本对比例提供了一种从柚子核中提取多肽的方法，与实施例4的不同之处在于使用巨大芽孢杆菌。
对比例2
本对比例提供了一种从柚子核中提取多肽的方法，与实施例4的不同之处在于湿润的柚子核粉末的料液比为1:5。
对比例3
本对比例提供了一种从柚子核中提取多肽的方法，与实施例4的不同之处在于乳杆菌的接种量为25％。
对比例4
本对比例提供了一种从柚子核中提取多肽的方法，与实施例4的不同之处在于发酵培养的温度为30℃。
对比例5
本对比例提供了一种从柚子核中提取多肽的方法，与实施例4的不同之处在于发酵培养的时间为15小时。
对比例6
本对比例提供了一种从柚子核中提取多肽的方法，包括如下步骤：
(1)原料：梅州金柚柚子核。
(2)捣碎：称取一定量已风干的柚子核，经组织捣碎机粉碎后，用30 目筛子过筛，得柚子核粉末。
(3)提取多肽：将已进行预处理的柚子核粉末精密称取1g于锥形瓶中，用超纯水调整锥形瓶中柚子核粉的浓度为50g/L，在37℃温度，150rpm 转速下用恒温摇床提取1h。提取后倒入离心管以5000r/min的转速离心20 min，取上清液定容至50ml，并立即储存在4℃以备用。
(4)沉淀蛋白质：为避免蛋白质对多肽含量检测的影响，取1ml样品，加入1ml的10％(w/v)的三氯乙酸(TCA)水溶液混合均匀，静置10min, 于4200r/min下离心30min，取上清液，得到活性多肽。
实验例1
本实验例用福林酚法检测采用实施例1-4及对比例1-5提供的提取方法提取得到的多肽的含量。所述福林酚法包括以下步骤：
取待测液1ml，加入8ml福林酚试剂D液，于室温下静置10min，然后加入1ml福林酚试剂E液并混匀，于40℃下保温20min，室温冷却，于749nm检测吸光值。以多肽标准液浓度为x轴，吸光度为y轴，绘制标准曲线，所得回归方程为y＝0.3884x+0.0334，R2＝0.978。
多肽得率(％)＝样品液中多肽质量浓度×样品液体积/初始柚子核粉末的质量×100％。
检测结果如下表所示：
| 组别 | 多肽得率(％) |
| 实施例1 | 5.65 |
| 实施例2 | 5.51 |
| 实施例3 | 5.46 |
| 实施例4 | 7.04 |
| 实施例5 | 4.46 |
| 对比例1 | 3.30 |
| 对比例2 | 3.52 |
| 对比例3 | 3.61 |
| 对比例4 | 4.11 |
| 对比例5 | 3.51 |
从上述结果中可以看出，本发明提供的从柚子核中提取多肽的方法，在本发明实施例1-5提供的各条件参数下，得到多肽的得率均高于对比例。并且，从实施例1-5之间的对比可以看出，调整各条件参数可以进一步优化活性多肽的提取率。其中，实施例1-4提供的从柚子核中提取多肽的方法，各条件参数均在本发明优选范围内，其活性多肽的提取率均高于实施例5。对比例1-5提供的从柚子核中提取多肽的方法，其提取条件均不在本发明范围内，对柚子核中活性多肽的提取率较低。由此可以看出，通过本发明提供的各条件参数之间的相互配合，对柚子核中活性多肽的提取率更高。
实验例2
(1)菌种活化：用浸过75％酒精的脱脂棉擦净装有大肠杆菌冻干粉的安瓶，将冻干管尖端放在火焰上加热，快速滴少量无菌水至加热处使之破裂，用镊子轻轻敲下冻干管顶端，并将冻干管开口处在火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作。用无菌吸管吸取0.1ml－0.2ml无菌水滴入管内待安瓿管内的牛奶菌粉溶解呈悬浮状，再用无菌吸管，吸取全部菌悬液接在1－2 支TSA斜面上，在37℃下培养18-24h。
(2)制备菌液：用接种环挑取菌，于50ml TSB液体培养基中，37℃， 180rmp的摇床中培养14h。
(3)稀释菌液：用空白TSB做对照，通过双光束紫外可见分光光度计进行检测，将菌液稀释至OD600＝0.1，此时大肠杆菌数为1×106cfu/ml，再将其稀释100倍。
(4)待测样品的制备：分别将0.01g实施例4及对比例6提供的多肽溶解于100ml超纯水中，将其稀释2倍(浓度为0.025mg/ml)，在超净工作台上，用0.22微米的针孔滤膜进行一次过滤。将已经过滤的样品加入1ml 于第一根、第二根离心管中，在第二根离心管中加入1ml的TSB液体培养基混匀，在第二根离心管中吸取1ml加入第三根离心管中，在第三根离心管中加入1ml TSB液体培养基混匀，依此类推，得到以下5个浓度：25ug/ml、 12.5ug/ml、6.25ug/ml、3.13ug/ml、1.56ug/ml。
(5)药敏实验：在超净工作台上，向每个平板中倒入10ml已灭好菌的TSA培养基，用移液枪吸取上述用培养基稀释过的菌液0.5mL小心滴在对应TSA平板培养基表面中央位置，右手拿无菌玻璃涂棒平放在平板培养基表面，将菌悬液沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。静止10 分钟。待菌液被固体培养基完全吸收后，用镊子将3个牛津杯垂直摆放在培养皿表面，轻轻加压，静止3-5分钟，防止在移动培养皿时牛津杯滑动。用移液枪给每个牛津杯加入100ul的不同稀释度的样品液。
(6)设置阴性对照：细菌培养皿上的每个牛津杯分别加入100ul TSB 培养基。
(7)设置空白对照：固体培养基中不加入菌液，直接放置牛津杯。
(8)培养：上述所有培养皿在37℃下培养12h。
(9)测定：用游标卡尺准确测量透明抗菌圈的直径。
益生菌发酵柚子核中多肽对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)结果如下表：
“+”代表有菌体生长，“-”代表无菌体生长。
益生菌发酵柚子核前后中的多肽对大肠杆菌MIC＝12.50ug/ml结果如图 1A、图1B、图1C和图1D所示。实验结果表明，发酵前的柚子核多肽无抑制大肠杆菌作用，发酵后的柚子核多肽具有显著的抑菌活性，发酵后的柚子核多肽对大肠杆菌的最低抑菌浓度为12.50ug/ml，其抑菌圈直径为7.93 ±0.45mm。
实施例6
本实施例应用响应面分析法对从柚子核中提取多肽的方法中各因素进行试验验证，具体如下：
1、实验设计和统计分析
A.单因素实验
以发酵后柚子核多肽得率为指标，考察柚子核固态发酵提取多肽中发酵温度(10、14、18、22、26℃)、发酵时间(20、35、50、65、80h)、发酵料液比(1：7、1:9、1:11、1:13、1:15)、接种量(30％、35％、40％、45％、 50％)4个因素对多肽得率的影响。
B.响应面优化试验方法
在单因素试验结果的基础上，采用Design-Expert 8.0(MSR)软件设计试验条件，选用Box-Behnken(BB)模型，以发酵后柚子核多肽得率为响应面值 y，发酵温度(A)、发酵时间(B)、发酵料液比(C)、接种量(D)为自变量，设计4因素3水平响应面试验(表1)，建立多元回归方程： Y＝4.88-0.17A+0.15B+0.23C+0.036D；
表1因素水平编码表
2、响应面的分析方案及实验结果如下表所示：
3、数据处理
采用Microsoft Excel 2010、SPSS 17.0对实验数据进行统计分析处理。所有试验均重复三次。
回归模型的方差分析与显著性检验：利用Design-Expert 8.0软件对回归模型进行方差分析，以确定每个因素对柚子核多肽的提取率的影响程度，同时也检验回归方程的有效性。从表2可知，RSM获得的模型P值为0.0201 (P<0.05)，显著；失拟项P值为0.4538(P>0.05)，不显著。因此该模型成立。
根据响应面模型方差分析表，利用JMP 14分析得出发酵温度、发酵时间、发酵料液比、接种量的交互作用关系图。交互作用关系图中，曲线的弯曲程度越大，表明这种因素随着相应的变量因素的变化而明显变化。从图2中可以看出，随发酵时间的变化，不同发酵温度、不同发酵液料比和不同接种量之间多肽得率变化较大，每条曲线的斜率变化较大，因此发酵时间与发酵温度、发酵料液比、接种量之间交互作用均明显。
表2响应面回归模型方差分析
注；*表示差异显著(p<0.05)；ns表示不显著。
4、验证试验
根据试验所建立的模型，得到最佳发酵工艺为：发酵温度10℃、发酵时间40h、发酵料液比1:15、接种量50％，在此条件下柚子核多肽提取率为7.13％。在此条件下进行3次重复试验，柚子核活性肽实际平均提取率为 7.04％，与预测值的相对误差为1.26％。表明响应面法优化所得最佳工艺条件可靠，具有实用价值。
本实施例采用乳杆菌发酵柚子核获取生物活性小分子多肽，利用 Design-Expert(RSM)软件设计试验条件，优化柚子核固态发酵提取多肽的发酵温度、发酵时间、发酵料液比、接种量的工艺条件，为柚子核活性肽的生产以及综合开发利用柚子核资源提供理论依据。在单因素试验结果的基础上，通过Design-Expert8.0软件和Box-Behnken(BB)实验设计进行响应面优化，得到最佳发酵工艺为发酵温度10℃、发酵时间40h、发酵料液比1:15、接种量50％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种从柚子核中提取多肽的方法，其特征在于，包括将益生菌接种于柚子核粉末溶液中，发酵培养后进行多肽的提取，得到柚子核中的多肽；
其中，所述柚子核粉末溶液的料液比为1:7-15g/mL；
所述益生菌的接种量为30％-50％；
所述发酵培养的温度为10-26℃，所述发酵培养的时间为20-80小时。
2.根据权利要求1所述的从柚子核中提取多肽的方法，其特征在于，所述益生菌包括酪酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌或酵母菌中的一种或多种，优选为乳杆菌。
3.根据权利要求1所述的从柚子核中提取多肽的方法，其特征在于，将干燥的柚子核粉碎至20-40目，得到柚子核粉末；
优选地，接种前还包括将所述柚子核粉末溶液进行灭菌的步骤。
4.根据权利要求1所述的从柚子核中提取多肽的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为10-20℃；
优选地，所述发酵培养的时间为35-55小时。
5.根据权利要求1所述的从柚子核中提取多肽的方法，其特征在于，对发酵培养的产物进行干燥处理后再进行多肽的提取。
6.根据权利要求1所述的从柚子核中提取多肽的方法，其特征在于，将预处理后的发酵培养的产物在温度30-40℃，转速100-200rpm条件下进行提取；
优选地，所述预处理为调整所述发酵培养的产物的浓度为30-70g/L；
优选地，提取的时间为0.8-1.2h；
优选地，提取后进行固液分离，取液体得到柚子核中的多肽；
优选地，4500-5500r/min离心15-25min进行固液分离。
7.根据权利要求1-6任一项所述的从柚子核中提取多肽的方法，其特征在于，还包括对得到的柚子核中的多肽进行除杂的步骤；
优选地，所述除杂为沉淀蛋白质。
8.应用权利要求1-7任一项所述的从柚子核中提取多肽的方法提取得到的多肽。
9.如权利要求8所述的多肽在制备抗菌产品中的应用。
10.响应面分析法在优化权利要求1-7任一项所述的从柚子核中提取多肽的方法中的应用。
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