CN109897788A - 一种芸薹链格孢及在制备抑菌剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种芸薹链格孢Gb.PY‑F2及在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂是芸薹链格孢Gb.PY‑F2经发酵培养获得的发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩，再用乙酸乙酯萃取，浓缩至恒重，获得芸薹链格孢Gb.PY‑F2代谢产物，即为抑菌剂。本发明提供一株新菌株‑‑银杏果内生真菌Gb.PY‑F2，芸薹链格孢Gb.PY‑F2代谢产物对金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)的MIC＝1.5625mg/mL，通过微生物发酵得到具有抑菌活性的成分，产量大，工艺简单，更加安全，环保。

Description

一种芸薹链格孢及在制备抑菌剂中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种金黄色葡萄球菌抑菌剂，具体涉及一种内生真菌芸薹链格孢Gb.PY-F2及在制备抗金黄色葡萄球菌药物的应用。

(二)背景技术

银杏是晚古生代的孑遗植物，具有“活化石”的美称，集食用、药用、绿化、观赏为一身。中国银杏种植面积位居世界首位，银杏叶产量约占全球总产量的70％。银杏种子甜而苦，与医药、食品同源，含有多种活性底物，如黄酮类、萜内酯、银杏酸、苯丙酮类、酚类等。因此，它具有促进唾液分泌、止渴祛痘、改善脑功能、增强记忆、治疗阿尔茨海默病、扩张微血管、促进血液循环、平滑血管、治疗脑供血等多种保健功能。银杏果一直被誉为高级滋补品，应用范围从食品领域扩展到医药、保健品、化妆品等领域。内生植物在各种植物中普遍存在。许多内生植物可以产生与宿主植物相同或相似的代谢产物，而且许多代谢产物是尚未发现的新物质。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种芸薹链格孢Gb.PY-F2及在制备抑菌剂中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种芸薹链格孢(Altemaria brassicae)Gb.PY-F2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 219126，保藏日期为2019年3月6日，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编：430072。

本发明所述芸薹链格孢Gb.PY-F2，菌落灰黑色，铺散状，菌落背面为黑色。

本发明还提供一种所述芸薹链格孢Gb.PY-F2在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌剂，优选金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003。

进一步，所述抑菌剂是芸薹链格孢Gb.PY-F2经发酵培养获得的发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩(优选浓缩至1/4体积)，再用乙酸乙酯萃取 (优选萃取至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相)，有机相浓缩至恒重，获得芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物，即为抑菌剂。

更进一步，所述抑菌剂按如下方法制备：将芸薹链格孢Gb.PY-F2接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；将发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩至原体积的1/4，用1倍体积乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相，浓缩至恒重，获得芸薹链格孢Gb.PY-F2 粗提物，即为抑菌剂；所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蔗糖30g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0～7.2；利用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌，条件为121℃，20分钟。

进一步，所述超声破碎条件为：在405W条件下，每工作3s，间歇4s，进行300 次循环。

进一步，所述芸薹链格孢Gb.PY-F2发酵前先活化培养，然后再接入发酵培养基，所述活化培养为：将芸薹链格孢Gb.PY-F2接种于PDA培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养7d；所述PDA培养基组成：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供一株新菌株--芸薹链格孢Gb.PY-F2，通过微生物发酵得到具有抑菌活性的成分，芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物对金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)的MIC＝1.5625mg/mL。传统抑菌剂为抗生素，国内抗生素滥用情况普遍，现已加大管控，天然的抑菌剂将是未来市场的趋势，该抑菌剂产量大，工艺简单，更加安全，环保。

(四)附图说明

图1为Gb.PY-F2菌株形态。

图2为Gb.PY-F2菌株系统发育树。

图3为芸薹链格孢Gb.PY-F2发酵物乙酸乙酯萃取相的抗真菌活性抑菌圈照片； A为卡那霉素阳性对照；B为空白对照(DMSO)；C样品浓度为0.750mg/mL；D 样品浓度为1.500mg/mL；E样品浓度为12.500mg/mL；F样品浓度为6.250mg/mL； G样品浓度为3.125mg/mL；H为空白对照(无菌超纯水)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述银杏(学名：Ginkgo biloba L.)，为银杏科、银杏属落叶乔木。银杏树的种子俗称白果，因此银杏又名白果树。

本发明所述超纯水是指电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水。水中除了水分子外，几乎没有什么杂质，更没有细菌、病毒、含氯二噁英等有机物，也没有人体所需的矿物质微量元素。

实施例1：芸薹链格孢Gb.PY-F2的典型分离

1.植物样本采集：新鲜健康的银杏果采于江苏省无锡市惠山大道，银杏果用自来水清洗10分钟，然后用体积浓度75％乙醇水溶液漂洗一次。用质量浓度2％次氯酸钠水溶液浸泡10分钟后，用无菌水反复洗涤种子，再用体积浓度75％乙醇水溶液浸泡10分钟，然后用无菌水漂洗三次，合并漂洗液，用干燥的无菌吸收纸吸去表面水分，获得表面消毒后的银杏果。在超净工作台中，放置PDA培养基的无菌平板作为空白对照1，该对照为检查超净工作台的洁净程度；将漂洗液接种于PDA培养基的无菌平板作为空白对照2，该对照为漂洗液的检查；将表面消毒后的银杏果，置于PDA 培养基的无菌平板中滚动后取出，作为空白对照3，该对照为植物组织印迹法筛选无菌的组织块。

2.内生真菌的筛选以及分离纯化：于无菌超净工作台，将步骤1中表面消毒后的银杏果从中间切成薄片，作为无菌组织，然后接种在PDA培养基中，在28℃倒置培养，待出现菌丝沿着组织切口向外生长时，与空白对照1、2以及3均进行比较，采用尖端菌丝挑选的方法，将不同形态的菌落划线接种于PDA培养基中，待长出单菌落后，将单菌落再次划线接种于无菌PDA培养基中，反复多次接种，直到菌落形态一致且只有一种真菌生长时说明纯化完成，得到1株菌株为灰黑色，铺散状，菌落背面为黑色的真菌，见于图1，将该菌株记为菌株Gb.PY-F2。

PDA培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，自然pH。

3.总DNA的提取：将菌株Gb.PY-F2接种于PDA培养基中，于28℃恒温培养箱中倒置培养7d。采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海) 股份有限公司，产品编号：B518229)以及相关操作说明提取基因组DNA：①取50-100 mg新鲜真菌或20mg干燥子实体或菌丝，液氮中充分研磨成粉末后放入到1.5mL离心管中，依次加入400μL BufferDigestion和4μlβ-巯基乙醇，震荡混匀。65℃水浴1 h至细胞完全裂解。②加入200μlBuffer PF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。③室温10000rpm离心5min，将上清液(500～550μl)转移到新的1.5ml离心管中。④加入等体积的异丙醇，颠倒5～8次使之充分混匀，室温放置2～3min。室温10000 rpm离心5min，弃上清。⑤加入1ml 75％乙醇，颠倒漂洗1～3min，10,000rpm离心2min，弃上清。⑥重复步骤⑤一次。⑦开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发。⑧得到的DNA用50-100μl TE Buffer溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

4.菌株Gb.PY-F2的ITS序列扩增：采用真菌扩增通用引物ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) 扩增内部转录区间序列，反应体系如下：

DNA模板1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、PCRMix 12.5μL、ddH₂O 9.5μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min， 35个循环，72℃延伸10min，4℃低温保存。

5.PCR反应产物确认：取5μLPCR产物与1μLDAN Green染料混合后点样于 1.2％琼脂糖凝胶，110V条件下电泳15分钟，于凝胶成像系统中观察条带，如出现 500bp左右条带，则初步判断扩增成功。

6.PCR反应产物测序：将PCR产物送样生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，菌株Gb.PY-F2的ITS序列见SEQ ID NO.1所示。

7.数据分析：用Blast比对，将菌株Gb.PY-F2的序列与GenBank中的序列进行同源性比对，BLAST检索表明，菌株Gb.PY-F2的ITS序列与芸薹链格孢(Altemaria brassicae)(GenBank登录号KU204772)的序列相似度为99％，绘制系统发育树，见图2所示。由图2可知支持率为100％，根据基因亲缘性对比，确定菌株Gb.PY-F2 为交链孢酶(Altemaria)属，命名为芸薹链格孢(Altemaria brassicae)Gb.PY-F2，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 219126，保藏日期为 2019年3月6日。

实施例2：芸薹链格孢Gb.PY-F2发酵液抑菌能力筛选

1、菌株复苏活化：将保存在4℃冰箱中的芸薹链格孢Gb.PY-F2接种于PDA培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养7d；

2、芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物的制备：在超净工作台中，用无菌打孔器将步骤1的Gb.PY-F2菌株沿着菌落边缘打直径为5mm的菌饼，接种于含200mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，28℃，180r/min发酵培养7d，以未接种菌饼的发酵培养基为空白对照。取发酵完成的发酵液，采用Y92-IIDN型超声波细胞粉碎机在405W条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环对发酵液进超声破壁处理，然后抽滤得滤液，经孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后，微滤液利用旋转蒸发仪将其浓缩至原体积的1/4，获得浓缩液。用1倍体积乙酸乙酯对浓缩液进行多次萃取，直至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相，再次利用旋转蒸发仪将乙酸乙酯萃取相浓缩干燥至恒重，获得芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物31.582g，于-20℃保存。

发酵培养基组成：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2。

3、抑菌实验：在超净工作台中将金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003，南京茂捷微生物科技有限公司)接种于液体LB培养基中，180r/min，37℃培养1d，作为供试菌；称取步骤2获得的25mg芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物，溶于1mL DMSO中，配置 25mg/mL的样品储备液。采用双层平板牛津杯法对抑菌活性进行测定：在超净工作台中，样品储备液经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，用无菌超纯水稀释得到浓度为0.750 mg/mL、1.500mg/mL、12.500mg/mL、6.250mg/mL、3.125mg/mL的样品。在无菌条件下，将牛津杯放置在无菌平皿中后倒入无菌LB培养基；取另一瓶无菌LB培养基，待其温度冷却至45℃左右，以体积浓度1％(例：100mL培养基，接种量为1mL)的接种量将供试菌接种于其中，摇匀后，倒入已放置牛津杯且底层无菌LB培养基已经凝固的培养皿中，待其冷却凝固用镊子将牛津杯取出后，在孔中加入150μL不同浓度的样品，分别以DMSO和无菌超纯水为空白对照，以1.500mg/mL卡那霉素水溶液为阳性对照，将平皿置于37℃恒温培养箱中培养1d，观察芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物对供试菌金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003的抑制效果，各浓度样品及对照的透明抑菌圈的直径见表1和图3所示，当透明圈直径大于8mm则说明该菌株发酵液中含有抑菌活性成分。

LB培养基组成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，1000mL 去离子水，pH7.0。

LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，1000mL离子水，pH7.0。

4、实验结果：芸薹链格孢Gb.PY-F2的抗真菌活性见图3和表1所示。

表1

实施例3：芸薹链格孢Gb.PY-F2发酵液对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度测定供试菌株的活化：将金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003接种于无菌的牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水， pH 7.4～7.6)中，置于37℃倒置培养1d；将活化后的供试菌接种于LB液体培养基中，置于37℃，180r/min的恒温摇床中发酵培养1d，取发酵液用无菌水稀释使得菌悬液浓度为10⁶cfu/mL，作为供试菌液。

称取实施例2方法制备的芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物50mg，溶于2mL DMSO 中，配置25mg/mL的储备液，在超净工作台中，储备液经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，用无菌水半倍稀释得到不同浓度的样品(12.500，6.250，3.125，1.562，0.781mg/mL)。在无菌条件下，将牛津杯放置在无菌平皿中后将无菌LB培养基倒入平皿；取另一瓶无菌LB培养基，待其温度冷却至45℃左右，以体积浓度1％的接种量将供试菌液接种于其中，摇匀后，倒入已放置牛津杯且底层无菌LB培养基已经凝固的培养皿中，待其冷却凝固用镊子将牛津杯取出后，在孔中加入150μL不同浓度的样品，分别以 DMSO和无菌超纯水为空白对照，以1.500mg/mL卡那霉素水溶液为阳性对照，将平皿置于37℃恒温培养箱中培养1d，观察各浓度代谢产物对供试菌的抑制效果，记录各浓度样品的透明抑菌圈直径，见表2，当透明圈直径大于8mm则说明该浓度样品有抑菌效果，小于等于8mm则说明该浓度样品中没有抑菌效果，每组实验重复操作 3次。

表2

实验结果：

芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物对金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)的 MIC＝1.5625mg/mL。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种芸薹链格孢及在制备抑菌剂中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 552

<212> DNA

<213> 芸薹链格孢(Altemaria brassicae)

<400> 1

gtaacctgcg gagggatcat tacacaaata tgaaggcggg ctggaacctc tcggggttac 60

agccttgctg aattattcac ccttgtcttt tgcgtacttc ttgtttcctt ggtgggttcg 120

cccaccacta ggacaaacat aaaccttttg taattgcaat cagcgtcagt aacaaattaa 180

taattacaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa 240

tgcgataagt agtgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg 300

cgccctttgg tattccaaag ggcatgcctg ttcgagcgtc atttgtaccc tcaagctttg 360

cttggtgttg ggcgtcttgt ctctagcttt gctggagact cgccttaaag taattggcag 420

ccggcctact ggtttcggag cgcagcacaa gtcgcactct ctatcagcaa aggtctagca 480

tccattaagc ctttttttca acttttgacc tcggatcagg tagggatacc cgctgaactt 540

aagcatatca at 552

Claims (7)

1.一种芸薹链格孢(Altemaria brassicae)Gb.PY-F2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019126，保藏日期为2019年3月6日，保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072。

2.一种权利要求1所述芸薹链格孢Gb.PY-F2在制备抑菌剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抑菌剂为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌剂。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抑菌剂是芸薹链格孢Gb.PY-F2经发酵培养获得的发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩，再用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至恒重，获得芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物，即为抑菌剂。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述抑菌剂按如下方法制备：将芸薹链格孢Gb.PY-F2接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；将发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩至原体积的1/4，用1倍体积乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相，浓缩至恒重，获得芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物，即为抑菌剂；所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蔗糖30g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0～7.2。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述超声破碎条件为：在405W条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述芸薹链格孢Gb.PY-F2发酵前先活化培养，然后再接入发酵培养基，所述活化培养为：将芸薹链格孢Gb.PY-F2接种于PDA培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养7d；所述PDA培养基组成：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH。