CN110343627A - 一种桑椹菌核病菌生防菌株、菌剂及其制备方法及应用 - Google Patents

一种桑椹菌核病菌生防菌株、菌剂及其制备方法及应用 Download PDF

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CN110343627A CN201811527472.7A CN201811527472A CN110343627A CN 110343627 A CN110343627 A CN 110343627A CN 201811527472 A CN201811527472 A CN 201811527472A CN 110343627 A CN110343627 A CN 110343627A
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邓文
胡兴明
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游景茂
顾琼楠
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Abstract

本发明公开了一种桑椹菌核病菌生防菌株、菌剂及其制备方法及应用，涉及农害防治技术领域。菌株的名称为贝莱斯芽孢杆菌，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019078，保藏时间为2019年1月23。所述菌株经过发酵后可产生具有强烈抑菌作用、有对温度不敏感等活性代谢产物，该活性代谢产物可用于防治桑椹菌核病及制备广谱性防治植物真菌病害的生物制剂。

Description

一种桑椹菌核病菌生防菌株、菌剂及其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及农害防治技术领域，尤其涉及一种桑椹菌核病菌生防菌株、菌剂及其制备方法及应用。
背景技术
果桑是以产果为主、果叶兼用型桑树的统称，其果实桑椹具有丰富的营养和药用价值，其花青素含量极高，抗氧化功效明显，具有促进造血细胞生长、降血糖、降血脂等药理作用。桑椹除直接食用外，目前已开发出果汁饮品、桑果酒、桑果酱、桑椹膏及花青素等产品，具有巨大的产业发展潜力和广阔的市场前景。然而在果桑产业发展过程中，桑椹菌核病来势猛、发病快，发病率高达30％～90％，有些果桑园甚至绝产，桑椹菌核病已成为限制果桑产业发展的瓶颈问题。
桑椹菌核病又称白果病，目前公认且常见的菌核病有桑椹肥大型菌核病、桑椹缩小型菌核病和桑椹小粒型菌核病3种，病原菌分别为桑实杯盘菌(Ciboria shiraiana)、桑椹核地杖菌(Scleromitrula shiraiana)和肉阜状杯菌(Ciboria carunculoides)。除上述病原菌外，曾发现宁波地区有5种核盘菌(Ciboria caranculoides,Ciboria shiraiana,Scleromitrula sp., Scleromitrula rubicola和Synciboria ningpoensis)；也有报道指出桑茎点霉(Phoma moricola) 同样可以引发桑椹菌核病，且其病果形态与桑椹肥大型菌核病颇为相似；在宁波天宫庄园桑果基地发现核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)也能导致桑椹菌核病。所有病原种类中由C. shiraiana引起的桑树肥大型菌核病被报道在亚洲分布最广泛。
目前生产上防治桑椹菌核病主要靠化学药剂防治，且防治桑椹菌核病的化学药剂多为单作用位点的内吸性杀菌剂，大量滥用化学农药，病原菌很容易产生抗药性，己报道多菌灵已在多种作物防治上产生了抗药性，而且农药残留还会引发食品安全、环境污染等问题。一些农业措施如清除病枝、病果、合理栽植、深翻土壤、合理施肥、覆盖地膜等，虽可一定程度减轻病害发生，但不能从根本上控制病害。
因此，亟待寻找一种对环境污染小且效果佳的桑椹菌核病防治菌剂或方法。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例提供了一种桑椹菌核病菌生防菌株、菌剂及其制备方法及应用，主要目的是解决防治桑椹菌核病效果差和污染环境的问题。
为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种桑椹菌核病菌生防菌株，所述菌株的名称为贝莱斯芽孢杆菌，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019078，保藏时间为2019年1月23。
另一方面，本发明实施例提供了上述菌株在抑制桑椹菌核病中的应用。
作为优选，所述菌株抑制桑椹核地杖菌和桑实杯盘菌生长；所述菌株抑制从发病桑椹上分离的真菌生长，所述真菌包括灰霉、链格孢、茎点霉、镰刀菌及节孢霉。
作为备选，所述菌株在病椹病原菌为灰霉、链格孢、茎点霉、镰刀菌或节孢霉时的应用。
又一方面，本发明实施例提供了上述菌株的获取方法，所述方法包括以下步骤：采用无菌刀片将健康桑椹分成小块样品，将所述样品置于75％的酒精中浸泡后再置于4％的次氯酸钠溶液中浸泡，用灭菌水漂洗浸泡过的样品，再将漂洗过的样品置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，25℃培养1周，最后将长出的细菌用平板划线法纯化后即获所述菌株，命名为贝莱斯芽孢杆菌。
又一方面，本发明实施例提供了一种菌剂，所述菌剂的抑菌成分为所述菌株的发酵液。
再一方面，本发明实施例提供了上述菌剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：所述菌株经活化、接种及振荡培养后获得所述菌株的原始发酵菌液，所述原始发酵菌液经离心分离后提取上清液，所述上清液经过滤后提取滤液，所述滤液即为所述发酵液；向所述发酵液中加入吐温-20后的混合物即为所述菌剂。
作为优选，所述菌剂的具体制备方法包括以下步骤：
(1)将权利要求1-4任一项所述的贝莱斯芽孢杆菌在培养基PDA平板上于25℃活化2d，再将单菌落接种到PDB培养基上，在28℃-33℃振荡培养12h-84h，得到所述贝莱斯芽孢杆菌的发酵菌液A；
(2)将所述发酵菌液A在4℃下进行离心，取离心后的上清液，用孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤所述上清液，得到不含所述贝莱斯芽孢杆菌的发酵液B；
(3)向所述发酵液B中添加吐温-20形成混合液，所述混合液中吐温-20的质量浓度为 0.025％，所述混合液即为所述菌剂。
作为优选，所述PDA培养基制备过程为：将马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g混合，再补充蒸馏水至1000mL，将混合物在121℃高压蒸汽灭菌30min；所述PDB培养基的制备过程为：将马铃薯200g与葡萄糖20g混合，并补充蒸馏水至1000mL，将混合物在121℃高压蒸汽灭菌30min。
作为优选，所述菌落在所述PDB上的振荡培养时间为48-72h；将所述发酵液B加入PDA 中，再将桑椹菌核病的病原菌接种到含有发酵液B的PDA上培养，所述发酵液B在所述PDA 中的体积浓度大于等于0.1％；所述发酵液B的耐热温度为4℃-120℃。
作为优选，所述菌落在所述PDB上的最佳振荡培养时间为48h，其发酵液B的抑菌率达到90％以上；所述发酵液B在所述PDA中的最佳体积浓度为5％，所述发酵液B的抑菌率达到100％；所述发酵液B的最佳耐热温度为40℃-100℃，所述发酵液B的抑菌效果稳定。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明分离筛选了一株对桑椹菌核病具有显著生物防治效果的细菌菌株；该菌株经过发酵后可产生具有强烈抑菌作用、有对温度不敏感等活性代谢产物，该活性代谢产物可用于制备广谱性防治植物真菌病害的生物制剂，用来防治桑椹菌核病，以此消弱化学药剂对环境的破坏以及人类身体健康的影响，同时延缓桑椹菌核病抗药性菌株的出现，以实现农业、人类和环境的和谐、可持续发展。
本发明提供的一种菌株，命名为贝莱斯芽孢杆菌，其拉丁文名称为Bacillusvelezensis Wh-1，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路 299号武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2019078，保藏时间为2019年1月23。
附图说明
图1是本发明提供的桑椹内生拮抗细菌Wh-1菌株形态学特征的显微镜图；
(A：Wh-1在PDA培养基上的培养2d菌落形态；B：显微镜下菌体形态观察，Bar＝10μm)
图2是本发明提供的桑椹内生拮抗细菌Wh-1菌株基于16S rDNA序列的系统发育树形图；
图3是本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌Wh-1对发病桑椹上分离的真菌的拮抗作用实物图；
(A：桑椹菌核病菌；B：桑实杯盘菌；C：灰霉；D：链格孢；E：茎点霉；F：镰刀菌；G：节孢霉)
图4是本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌Wh-1发酵液B对桑实杯盘(CCTCC AF2014019)菌丝破坏作用的显微镜图；
(A：在PDA上生长桑实杯盘菌的菌丝顶端；
B：在含有Wh-1菌株1％发酵液B的PDA上桑实杯盘菌菌丝；)
图5是本发明提供的Wh-1发酵液B对桑实杯盘菌生长抑制作用的实物图；
(A：PDA培养基对照；
B：PDA培养基添加5％的发酵液B；
C：PDA培养基添加2％的发酵液；
D：PDA培养基添加1％的发酵液B；
E：PDA培养基添加0.6％的发酵液B；
F：PDA培养基添加0.2％的发酵液B；
G：PDA培养基添加0.1％的发酵液B)
图6是本发明提供的不同温度对发酵液B拮抗物质活性影响的实物图。
(A：PDA培养基对照；B：4℃处理发酵液20min；
C：20℃处理发酵液20min；D：40℃处理发酵液20min；
E：60℃处理发酵液20min；F：80℃处理发酵液20min；
G：100℃处理发酵液20min；H：120℃处理发酵液20min)
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
实施例1(菌株的获取)
本发明从湖北省武汉市桑树基地分离筛选出一株适用于桑椹菌核病防治的生防贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Wh-1；具体操作：将健康桑椹用无菌手术刀片分成约0.5mm 的小块置于75％的酒精中浸泡1min，在4％的次氯酸钠溶液中浸泡2min，然后用灭菌水漂洗3次，置于PDA培养基中，25℃培养1周，将长出的细菌用平板划线法纯化，即得该菌株。
实施例2(菌株的生物学特性)
(1)贝莱斯芽孢杆菌Wh-1的形态学
上述贝莱斯芽孢杆菌Wh-1在PDA培养基上前期为白色，菌落不透明，最后逐渐变成米黄色；菌体杆状，大小为0.7-0.8×2-3μm，菌落边缘不光滑(如图1所示)；
(2)Biolog鉴定：对分离筛选生长效果较好的生防菌株经菌落形态鉴定后，Biolog进行证实，在含95个碳源的Biolog阴性(GN)微孔板中，每孔加入100μL所测细菌悬浮液；在30℃下培养48h后，由Biolog读数机测得反应结果，并直接进入Biolog专用细菌鉴定程序(4.1版本)；
(3)贝莱斯芽孢杆菌Wh-1分子生物学分析
取上述菌株Wh-1单菌落在PDB培养基中振荡培养48h(转速180rpm，28℃)，12000rpm 离心5min，弃上清液，收集菌体；加入400μL裂解液(40mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA， 1％w/v十二烷基硫酸钠，pH7.8)混匀，置于37℃水浴1h。然后加入200μl 5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。取上清液，用等体积的苯酚/氯仿抽提1次，再用等体积的氯仿抽提1次；加两倍体积无水乙醇，-20℃沉淀过夜后，12000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；室温干燥后，溶于100μL ddH2O中，溶解后，利用超微量分光光度计检测其浓度及质量，取1μL作为模板，对16S rDNA片段进行PCR扩增；所用的引物的DNA序列如下：
正向引物(SEQ ID NO.1)：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′
反向引物(SEQ ID NO.2)：5′TACGGCTACCTTGTTACGACTT3′
50μl PCR反应体系：2×Es Taq Mastermix 25μL(康为世纪)，10μM引物各2μL(擎科生物科技有限公司)，模板DNA 50ng 1μL，加入ddH2O至体系体积达50μL。在PCR仪上进行扩增：95℃变性4min后，进入PCR循环，每个循环为94℃30s，54℃30s，72℃2min，共35个循环；然后72℃延伸10min。经1％琼脂糖凝胶电泳检测分析PCR扩增结果，扩增片段大小为1.5kb左右，委托擎科生物科技有限公司进行PCR产物纯化和测序。测序后的序列见序列表SEQ ID NO.3；将测序结果与GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中已知的 16SrDNA序列进行BLAST比对分析，发现与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)(序列登录号：MH373544)同源性达到99％，结合菌株形态学、Biolog结果及16S rDNA序列的系统发育分析(如图2所示)，将菌株Wh-1鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。
实施例3(菌株的拮抗性)
用对峙培养法测定生防菌Wh-1的拮抗谱；用打孔器(直径6mm)打取病原菌菌块，将其置于PDA平板中央，用接种环蘸取供试菌株Wh-1菌液，然后在距菌块2cm处轻轻划 3cm线，以未接细菌的菌落为对照，每个处理设置三个重复，置25℃培养箱恒温培养5d后，测量其抑菌率；桑椹核地杖菌和桑实杯盘菌(CCTCC AF 2014019)分别在培养20d和2d 时测算抑菌率,结果表明菌株Wh-1对桑椹核地杖菌Sd1-2和桑实杯盘菌的菌丝生长有显著的抑制作用，抑菌率为100％和63.15％(如图3所示)；对灰霉、链格孢、茎点霉、镰刀菌、节孢霉7种从发病桑椹上分离的真菌的拮抗作用均具有强烈拮抗作用，抑菌率分别为 88.97％、67.54％、44.23％、47.92％，表明Wh-1菌株所产生的抗生物质抗菌谱广，在植物病害的防治中有广泛应用的潜能。
实施例4(贝莱斯芽孢杆菌Wh-1菌剂)
(1)先将贝莱斯芽孢杆菌Wh-1的菌株在PDA平板上于25℃活化2d，再将单菌落接种到含有50ml PDB的三角瓶中，于180r/min下，33℃振荡培养48h，得到浓度为OD600值为 1.95的Wh-1的发酵菌液A；
(2)将所述的发酵菌液A于4℃，6000r/min下离心20min，取离心后的上清液，用孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤所述的上清液，得到不含贝莱斯芽孢杆菌Wh-1的发酵液B，将获得的沉淀菌体备用；
(3)向所述发酵液B中加入吐温-20，使发酵液B中的吐温-20的终浓度为0.025％，即得上述菌剂。
实施例5(菌株的拮抗机理)
在10ml PDA培养基中加入1％(V/V)发酵液B，用打孔器(直径为6mm)打取桑实杯盘菌菌丝块接种于PDA平板中央，25℃培养箱培养，48h后挑取桑实杯盘菌菌丝体置于显微镜下观察；结果如图3所示，正常菌丝分支近直角，分支处稍有缢缩；而发酵液B处理的 Wh-1菌株菌丝体膨大成鸟巢状，说明拮抗细菌对桑实杯盘菌菌丝有致畸作用，可以有效抑制菌丝扩展。
实施例6(菌株的拮抗物质理化特性)
本实施例用平板抑菌法测定无菌发酵液B生物活性，即制备PDA平板，在该平板上接种桑实杯盘菌(保藏号为CCTCC AF2014019)，作为处理组；不加无菌发酵液B的PDA平板为空白对照，3d后测量处理组菌落直径，以抑菌率表示菌株Wh-1产生拮抗物质的活性。所有处理均设置三个重复。抑菌率计算公式如下：
抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌丝直径×100％。
(1)不同发酵时间对发酵液生物活性的影响
将Wh-1单菌落接种到50ml液体PDB培养基中于28℃摇床分别振荡培养12h、24h、36h、 48h、60h、72h和84h后，将不同处理的发酵液B按1％(V/V)加入PDA中，进行生物活性测定；结果如表1所示，当菌株Wh-1培养48h-72h，其发酵液中拮抗物质活性最强，抑菌率为90％以上。因此发酵产物拮抗活性的测定、生防测定等均用培养48h的发酵液进行。
表1.不同培养时间对发酵液中拮抗物质活性的影响
表中数据为平均数±标准误，同列数据后不同字母表示经LSD法检验在P<0.05水平差异显著。
(2)不同浓度无菌发酵液B对桑椹菌核病菌的抑制效果
将活化好的桑实杯盘菌菌株分别接于含0.1％、0.2％、0.6％、1％、2％和5％(V/V)浓度的发酵液B的PDA上培养，以不加发酵液的作为对照，分别测抑菌率；结果如表2及图5所示，随着发酵液浓度的不断升高，发酵液对桑椹菌核病菌的抑制程度不断增强，当发酵液的浓度达到5％就可以在PDA上完全抑制病菌的生长。
表2.不同浓度发酵产物对桑椹菌核病菌抑制效果
表中数据为平均数±标准误，同列数据后不同字母表示经LSD法检验在P<0.05水平差异显著。
(3)不同温度对发酵液拮抗物质活性的影响
将制备好的无菌发酵液B分别经4℃、20℃、40℃、60℃、80℃、100℃或120℃处理20min 后，将不同处理的发酵液B按1％(V/V)加入10ml PDA中进行生物活性测定；结果如表3 及图6所示，发酵液经40℃～100℃处理后，无显著性差异。表明活性成分热稳定性好。
表3.不同温度对发酵液拮抗物质活性的影响
表中数据为平均数±标准误，同列数据后不同字母表示经LSD法检验在P<0.01水平差异显著。
本发明的发明人在湖北省桑树基地进行实验时发现从桑葚内生细菌中分离筛选出的一种菌株对桑椹菌核病病原菌具有拮抗作用。经过上述实施例1-实施例6对拮抗菌株进行鉴定，采用室内平板对峙实验、液体发酵拮抗等方法筛选出对具有稳定拮抗作用的菌株；该菌株对桑椹菌核病具有显著生物防治效果；该菌株经过发酵后可产生具有强烈抑菌作用、有对温度不敏感等活性代谢产物，该活性代谢产物可用于制备广谱性防治植物真菌病害的生物制剂，用来防治桑椹菌核病，以此消弱化学药剂对环境的破坏以及人类身体健康的影响，同时延缓桑椹菌核病抗药性菌株的出现，以实现农业、人类和环境的和谐、可持续发展。
本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 申请人:湖北省农业科学院经济作物研究所
<120> 一种桑椹菌核病菌生防菌株、菌剂及其制备方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
tacggctacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1425
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
ctgtgctgca gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt 60
gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat 120
accggatgct tgtttgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg ctaccactta 180
cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg 240
cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta 300
cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg 360
tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtgccgttc 420
aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 480
gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca 540
ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac 600
tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag 660
agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag 720
cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag 780
tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc 840
ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 900
tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct 960
gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt 1020
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt 1080
agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1140
ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatggg 1200
cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc 1260
ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca 1320
tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg 1380
taacaccgcg aagtcggtga ggtaacctag tggagccaac ctagc 1425

Claims (10)

1.一种桑椹菌核病菌生防菌株，其特征在于，所述菌株的名称为贝莱斯芽孢杆菌，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019078，保藏时间为2019年1月23。
2.权利要求1所述的菌株在抑制桑椹菌核病中的应用。
3.如权利要求2所述的菌株在抑制桑椹菌核病中的应用，其特征在于，所述菌株抑制桑椹核地杖菌和桑实杯盘菌生长；所述菌株抑制从发病桑椹上分离的真菌生长，所述真菌包括灰霉、链格孢、茎点霉、镰刀菌及节孢霉。
4.一种菌株的获取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：采用无菌刀片将健康桑椹分成小块样品，将所述样品置于75％的酒精中浸泡后再置于4％的次氯酸钠溶液中浸泡，用灭菌水漂洗浸泡过的样品，再将漂洗过的样品置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，25℃培养1周，最后将长出的细菌用平板划线法纯化后即获得权利要求1所述的菌株，命名为贝莱斯芽孢杆菌。
5.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂的抑菌成分为权利要求1所述菌株的发酵液。
6.一种菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：所述菌株经活化、接种及振荡培养后获得所述菌株的原始发酵菌液，所述原始发酵菌液经离心分离后提取上清液，所述上清液经过滤后提取滤液，所述滤液即为权利要求5所述的发酵液；向所述发酵液中加入吐温-20后的混合物即为所述菌剂。
7.如权利要求6所述的一种菌剂的制备方法，其特征在于，所述菌剂的具体制备方法包括以下步骤：
(1)将权利要求1-4任一项所述的贝莱斯芽孢杆菌在培养基PDA平板上于25℃活化2d，再将单菌落接种到PDB培养基上，在28℃-33℃振荡培养12h-84h，得到所述贝莱斯芽孢杆菌的发酵菌液A；
(2)将所述发酵菌液A在4℃下进行离心，取离心后的上清液，用孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤所述上清液，得到不含所述贝莱斯芽孢杆菌的发酵液B；
(3)向所述发酵液B中添加吐温-20形成混合液，所述混合液中吐温-20的质量浓度为0.025％，所述混合液即为所述菌剂。
8.如权利要求7所述的一种菌剂的制备方法，其特征在于，所述PDA培养基制备过程为：将马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g混合，再补充蒸馏水至1000mL，将混合物在121℃高压蒸汽灭菌30min；所述PDB培养基的制备过程为：将马铃薯200g与葡萄糖20g混合，并补充蒸馏水至1000mL，将混合物在121℃高压蒸汽灭菌30min。
9.如权利要求7所述的一种菌剂的制备方法，其特征在于，所述菌落在所述PDB上的振荡培养时间为48-72h；将所述发酵液B加入PDA中，再将桑椹菌核病的病原菌接种到含有发酵液B的PDA上培养，所述发酵液B在所述PDA中的体积浓度大于等于0.1％；所述发酵液B的耐热温度为4℃-120℃。
10.如权利要求7所述的一种菌剂的制备方法，其特征在于，所述菌落在所述PDB上的最佳振荡培养时间为48h，其发酵液B的抑菌率达到90％以上；所述发酵液B在所述PDA中的最佳体积浓度为5％，所述发酵液B的抑菌率达到100％；所述发酵液B的最佳耐热温度为40℃-100℃，所述发酵液B的抑菌效果稳定。
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