CN105907658A - 一种牡丹内生枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用 - Google Patents

一种牡丹内生枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牡丹内生枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用，所述牡丹内生枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Mdgb45，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号是GDMCC NO：60009。本发明的牡丹内生细菌菌株对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果，可用于防治金黄色葡萄球菌。而牡丹内生细菌菌株发酵产物中的蛋白粗提物可作为抑制金黄色葡萄球菌的活性物质，该活性物质经过植物体内的筛选，对人畜无毒、无伤害，可直接开发为新型抗菌药物。

Description

一种牡丹内生枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种牡丹内生抑制金黄色葡萄球菌的枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用。
背景技术
植物内生菌是指生活在植物组织内，但不破坏宿主细胞而引起植物病害的一类微生物，它包括细菌、放线菌和真菌。植物内生菌可以从植物组织内部分离出来。目前药用植物内生菌能够产生多种抑菌、抗氧化的生物学活性物质，在生物制药，生物防治等领域具有非常广阔的应用前景，成为许多学者争相研究的热点。
牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews）是我国特有的传统花卉，具有极高的观赏价值和药用价值，其药用栽培品种以‘凤丹’（Paeonia ostii‘Feng Dan’）为主，其根入药，名为“丹皮”，丹皮中含有牡丹酚、芍药甙、苯甲酸、挥发油及植物甾醇等多种药用活性物质，在抗菌、消炎、治疗心血管疾病、保肝、降血糖、降血脂、抗肿瘤等方面具有较好疗效。目前国内仅有一些关于牡丹内生真菌及次生代谢产物的研究。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种较为常见的，易引起食物中毒的食源性致病菌，常会导致产品腐败和疾病传染，对食品安全构成巨大的威胁。随着抗生素和防腐剂的大量使用，耐药性菌株大量产生，开发新的抑菌活性物质迫在眉睫。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在自然界广泛存在，对营养的要求不高且具有高度的耐盐性，它是人类化脓感染中最常见的病原菌，由于抗生素的广泛使用，已使90%多的金葡菌产生了耐药性，而且随着食品工业的快速增长，人们对食品防腐剂的安全性以及食品的保质期问题提出了更高的要求。一些食品腐败菌如金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus) 、大肠杆菌( Escherichia coli)等严重危害着食品安全，如何防止食品腐败变质及开发安全的食品防腐剂越来越受到重视目前，筛选金葡菌拮抗菌株的来源主要有土壤和海洋两个途径，而牡丹内生菌的研究也仅在内生真菌及次生代谢产物的研究方面。将两者结合起来关于药用牡丹内生细菌拮抗金葡的研究几乎没有，本专利以药用植物牡丹根部内生细菌为材料，从中筛选能够抑制金黄色葡萄球菌生长的内生细菌菌株，并探讨其活性代谢产物的抑菌活性，从而开发出抑制金黄色葡萄球菌的新的活性物质，避免耐药性菌株的产生。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种牡丹内生抑制金黄色葡萄球菌的枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
一种牡丹内生枯草芽孢杆菌，所述牡丹内生枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Mdgb45，该菌株已在2016 年1月25 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号是GDMCC NO ：60009。
本发明提出了一种分离纯化所述的牡丹内生枯草芽孢杆菌的方法，其包括：
步骤①：从生长状态良好的牡丹根上剥取根皮，之后将根皮漂洗、冲洗、消毒、再冲洗后晾干作为样品，备用；
步骤②：将最后一次冲洗用的液体涂布于平板中作为对照组，并在温度为28℃下恒温培养；
步骤③：将步骤①制得的样品放入无菌研钵中研磨至均匀，静置后取上清液并按1:9的比例稀释为2个梯度，之后把两个梯度的溶液涂布于固体平板上，并在温度为28℃的条件下培养，把每一个梯度再做3个重复，然后将对照组和样品组的两个梯度分别在平板上培养，用平板划线法对不同的菌落进行分离、纯化，即获得分离纯化后的牡丹内生枯草芽孢杆菌。
其中优选的一种分离方法为，步骤①中漂洗根皮所用乙醇的质量百分比浓度为75%；步骤②中消毒根皮的具体方法是将根皮置于质量百分比浓度30%的次氯酸钠中浸泡3min。
本发明提出了一种收集所述牡丹内生枯草芽孢杆菌发酵液的方法，其包括：将牡丹内生枯草芽孢杆菌放于温度为28℃的NA培养基中过夜振荡培养，之后转移到PDA培养基中振荡培养48h，然后收集培养液，并在温度为4℃、转速为10000g的情况下离心2min，收集上清液并用0.22μ m的无菌滤膜过滤除菌即得所述的发酵液。
本发明还提出了一种将所述的牡丹内生枯草芽孢杆菌于防治金黄色葡萄球菌病原菌中的应用。
此外，本发明还提出了一种防治金黄色葡萄球菌病原菌的生防菌，其包括以上所述的拮抗金黄色葡萄球菌的牡丹内生枯草芽孢杆菌。
本发明的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) Mdgb45，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；地址：广州市先烈中路100号59号楼5楼，广东省微生物研究所；保藏日期：2016 年1月25 日；保藏号GDMCC NO ：60009。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
本发明提出了一种牡丹内生抑制金黄色葡萄球菌的枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用，本发明的牡丹内生细菌菌株对金黄色葡萄球菌具的良好的抑菌效果，可用于防治金黄色葡萄球菌。而牡丹内生细菌菌株发酵产物中的蛋白粗提物可作为抑制金黄色葡萄球菌的活性物质，该活性物质经过植物体内的筛选，对人畜无毒、无伤害，可直接开发为新型抗菌药物。
附图说明
图1是枯草芽胞杆菌Mdgb45菌株对金黄色葡萄球菌的拮抗作用结果图；其中，B图是枯草芽胞杆菌Mdgb45菌株，A、C、D图是其他没有拮抗作用的菌株；
图2是枯草芽胞杆菌Mdgb45菌株的菌落特征和菌体特征；其中，A图是枯草芽胞杆菌Mdgb45菌株的菌落特征，B 图是菌体革兰氏染色结果，C图是鞭毛染色结果；
图3 是枯草芽胞杆菌Mdgb45菌株发酵液对金黄色葡萄球菌的拮抗作用结果图；
图4 是枯草芽胞杆菌Mdgb45菌株发酵液中粗蛋白提取液对金黄色葡萄球菌的拮抗作用结果图。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本实施方式中大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）由胰蛋白胨15g、大豆胨5g、NaCl 5g、琼脂17g和1000mL蒸馏水组成，pH7.3；牛肉膏蛋白胨培养基（NA）由牛肉膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖2.5g、琼脂17g和1000mL蒸馏水组成，pH7.2；
PDA培养基由土豆200g、葡萄糖20g、琼脂17g和1000mL蒸馏水组成，自然pH值。
实施例1：牡丹内生细菌的分离方法1
运用5点取样法随机取洛阳理工学院西校区3、4月份牡丹根部组织，立即带回实验室作为内生细菌的分离材料。具体的分离纯化操作步骤如下：在自来水下将牡丹根表面刷洗干净晾干，将其根皮剥下混匀，随机取切好的根皮3g放于培养皿中，在超净工作台中用70%的乙醇漂洗30s后，立即用灭菌水冲洗3次，再用20%的次氯酸钠表面消毒3min，最后用灭菌水冲洗5次，无菌条件下晾干。吸取最后一次冲洗后的灭菌水0.2mL涂布于(TSA)平板中作为对照组，于28℃恒温培养48h。将经过表面消毒后的样品放入无菌研钵中，加入10mL的灭菌水，研磨至均匀。静置10min后，取上清液按1：9的比例稀释2个梯度，分别取0.2mL溶液涂布于(TSA)固体平板，于28℃恒温培养48h，每一梯度设置3个重复，共3个梯度。待分离平板上长出菌落，定期观察分离平板，记录每个平板上的菌落数量，对各菌落形态进行观察记录并挑选出不同菌落。如果对照组平板上生长有菌落，则在实验组中剔除相应的菌落。进一步用(TSA)平板划线将不同的菌落进行分离、纯化，获得牡丹内生细菌菌株。
实施例2：牡丹内生细菌的分离方法2
运用5点取样法随机取洛阳理工学院西校区3、4月份牡丹根部组织，立即带回实验室作为内生细菌的分离材料。具体的分离纯化操作步骤如下：在自来水下将牡丹根表面刷洗干净晾干，将其根皮剥下混匀，随机取切好的根皮3g放于培养皿中，在超净工作台中用75%的乙醇漂洗30s后，立即用灭菌水冲洗3次，再用30%的次氯酸钠表面消毒3min，最后用灭菌水冲洗5次，无菌条件下晾干。吸取最后一次冲洗后的灭菌水0.2mL涂布于(TSA)平板中作为对照组，于28℃恒温培养48h。将经过表面消毒后的样品放入无菌研钵中，加入10mL的灭菌水，研磨至均匀。静置10min后，取上清液按1：9的比例稀释2个梯度，分别取0.2mL溶液涂布于(TSA)固体平板，于28℃恒温培养48h，每一梯度设置3个重复，共3个梯度。待分离平板上长出菌落，定期观察分离平板，记录每个平板上的菌落数量，对各菌落形态进行观察记录并挑选出不同菌落。如果对照组平板上生长有菌落，则在实验组中剔除相应的菌落。进一步用(TSA)平板划线将不同的菌落进行分离、纯化，获得牡丹内生细菌菌株。
实施例3：牡丹内生细菌的分离方法3
运用5点取样法随机取洛阳理工学院西校区3、4月份牡丹根部组织，立即带回实验室作为内生细菌的分离材料。具体的分离纯化操作步骤如下：在自来水下将牡丹根表面刷洗干净晾干，将其根皮剥下混匀，随机取切好的根皮3g放于培养皿中，在超净工作台中用80%的乙醇漂洗30s后，立即用灭菌水冲洗3次，再用40%的次氯酸钠表面消毒3min，最后用灭菌水冲洗5次，无菌条件下晾干。吸取最后一次冲洗后的灭菌水0.2mL涂布于(TSA)平板中作为对照组，于28℃恒温培养48h。将经过表面消毒后的样品放入无菌研钵中，加入10mL的灭菌水，研磨至均匀。静置10min后，取上清液按1：9的比例稀释2个梯度，分别取0.2mL溶液涂布于(TSA)固体平板，于28℃恒温培养48h，每一梯度设置3个重复，共3个梯度。待分离平板上长出菌落，定期观察分离平板，记录每个平板上的菌落数量，对各菌落形态进行观察记录并挑选出不同菌落。如果对照组平板上生长有菌落，则在实验组中剔除相应的菌落。进一步用(TSA)平板划线将不同的菌落进行分离、纯化，获得牡丹内生细菌菌株。 其中以实施例2的方法分离出的菌种数目最多，效果最好。
实施例4：牡丹内生细菌Mdgb45分离和对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的平板抑菌作用
从指示菌株的菌种斜面上挑取一环接入3 mL (NA)培养基，37℃，转速160 r/min，过夜培养，制备出指示菌液。采用平板对峙法对上述实施例2分离出的内生菌进行抑菌实验。向培养皿（90mm）中倒入20 mL 已灭菌的NA培养基，待其凝固后，加入100μL指示菌液（浓度调整为1.0 ×107 cfu/mL），均匀涂布，静置5min。从纯化出的内生菌平板上挑取一环以对角的位置接入已经涂布指示菌的平板上，静置5min，培养皿于37℃ 培养24h后测量抑菌圈大小。每处理重复三次。试验结果如图1所示，内生细菌菌株Mdgb45菌株对金黄色葡萄球菌具有强烈的抑菌作用，抑菌圈平均直径值为7mm。
实施例5：牡丹内生细菌Mdgb45的鉴定
实施主要采用菌体形态观察，生理生化特征测定和分子生物学手段相结合的方法对内生细菌Mdgb45进行鉴定。结果如图2所示，菌株Mdgb45在NA培养基上生长良好，菌落前期突起，干燥，乳白色，边缘锯齿状，后期菌落成褶皱。革兰氏染色均为阳性，菌体均为杆状，有鞭毛，产生芽孢。
16S rRNA的PCR扩增结果表明，菌株Mdgb45扩增产物为1511 bp，具体如如序列表SEQ ID NO.1所示，委托上海生工生物工程公司测序，获得菌株Mdgb45 16S rRNA基因全序列，序列登录号分别为KU570452。利用GenBank中的BLAST软件对菌株的16S rRNA基因序列进行分析，菌株Mdgb45的16S rRNA序列与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有较高的同源性，其相似性都高达99%。结合形态特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，将菌株Mdgb45鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
实施例6：不同条件下牡丹内生细菌Mdgb45发酵液对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的平板抑菌作用。
对筛选得到的拮抗菌株进行发酵培养，检测其发酵液的抑菌活性。挑取拮抗菌株单菌落于NA培养基中28℃过夜振荡培养，取600μL加入20 mL新鲜液体PDA培养基中25℃振荡培养24 h，发酵液10 000×g 4℃离心2 min 后，取上清用0.22μ m的无菌滤膜过滤除菌。平板扩散法测定发酵上清液的抑菌活性，无菌操作取100μL（1.0 ×107 cfu/mL）金黄色葡萄球菌均匀涂布于倒有固体NA培养基的培养皿中，小心放上3个无菌牛津杯，然后在每个牛津杯中分别加入100μL的拮抗菌株的发酵上清液，37℃恒温培养24h 后，测定抑菌圈直径，每处理重复三次。试验结果抑菌圈平均直径值为5mm。
实施例7：不同条件下牡丹内生细菌Mdgb45发酵液对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的平板抑菌作用。
对筛选得到的拮抗菌株进行发酵培养，检测其发酵液的抑菌活性。挑取拮抗菌株单菌落于NA培养基中28℃过夜振荡培养，取600μL加入20 mL新鲜液体PDA培养基中32℃振荡培养48 h，发酵液10 000×g 4℃离心2 min 后，取上清用0.22μ m的无菌滤膜过滤除菌。平板扩散法测定发酵上清液的抑菌活性，无菌操作取100μL（1.0 ×107 cfu/mL）金黄色葡萄球菌均匀涂布于倒有固体NA培养基的培养皿中，小心放上3个无菌牛津杯，然后在每个牛津杯中分别加入100μL的拮抗菌株的发酵上清液，37℃恒温培养24h 后，测定抑菌圈直径，每处理重复三次。
试验结果如图3所示，内生细菌菌株Mdgb45菌株的发酵液对金黄色葡萄球菌具有强烈的抑菌作用，抑菌圈平均直径值为10.5mm。
实施例8：不同条件下牡丹内生细菌Mdgb45发酵液对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的平板抑菌作用。
对筛选得到的拮抗菌株进行发酵培养，检测其发酵液的抑菌活性。挑取拮抗菌株单菌落于NA培养基中28℃过夜振荡培养，取600μL加入20 mL新鲜液体PDA培养基中55℃振荡培养72 h，发酵液10 000×g 4℃离心2 min 后，取上清用0.22μ m的无菌滤膜过滤除菌。平板扩散法测定发酵上清液的抑菌活性，无菌操作取100μL（1.0 ×107 cfu/mL）金黄色葡萄球菌均匀涂布于倒有固体NA培养基的培养皿中，小心放上3个无菌牛津杯，然后在每个牛津杯中分别加入100μL的拮抗菌株的发酵上清液，37℃恒温培养24h 后，测定抑菌圈直径，每处理重复三次。试验结果抑菌圈平均直径值为4mm。其中以实施例7的方法进行培养获得的发酵液抑制效果最好。
实施例9：牡丹内生细菌Mdgb45的蛋白粗提液对金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的平板抑菌作用。
将筛选得到的菌株于NA液体培养基中活化过夜培养，取培养液3mL接种于80 mLPDA培养基中32℃振荡培养48 h，发酵液10000r/min 离心20 min去菌体，取上清液，按分级沉淀法加入不同饱和度的硫酸铵，混匀，4℃静置过夜。盐析液10000r /min、4℃下离心15min，收集沉淀。磷酸缓冲液（0.2mol/L, pH 7）溶解沉淀，装入透析袋(透析袋截流分子量为8 kDa)中透析48 h。透析袋内溶液即为拮抗菌株的胞外蛋白粗提液。用孔径为0.22 μm的无菌滤膜过滤蛋白粗提液，平板扩散法测定其抑菌活性，无菌操作取100μL（1.0 ×107 cfu/mL）金黄色葡萄球菌均匀涂布于倒有固体NA培养基的培养皿中，小心放上3个无菌牛津杯，然后在每个牛津杯中分别加入100μL的拮抗菌株的蛋白粗提液，37℃恒温培养24h 后，测定抑菌圈直径，每处理重复三次。
试验结果如图4所示，内生细菌菌株Mdgb45菌株的蛋白粗提液对金黄色葡萄球菌具有强烈的抑菌作用，抑菌圈平均直径值为30.5mm。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 洛阳理工学院
<120> 一种牡丹内生枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用
<130> 20160212
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 1510
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） Mdgb45
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gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgagcccttt acgcccaata attccggaca 960
acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctggt 1020
taggtaccgt caaggtaccg ccctattcga acggtacttg ttcttcccta acaacagagc 1080
tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt 1140
gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt 1200
ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgttgcctt ggtgagccgt tacctcacca 1260
actagctaat gcgccgcggg tccatctgta agtggtagcc gaagccacct tttatgtttg 1320
aaccatgcgg ttcaaacaac catccggtat tagccccggt ttcccggagt tatcccagtc 1380
ttacaggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg ctaacatcag ggagcaagct 1440
cccatctgtc cgctcgactt gcatgtatta ggcacgccgc cagcgttcgt cctgagccag 1500
gatcaaactc 1510

Claims (7)

1.一种牡丹内生枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述牡丹内生枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Mdgb45，该菌株已在2016 年1月25 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号是GDMCC NO ：60009。
2.一种分离纯化权利要求1所述的牡丹内生枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于包括：
步骤①：从生长状态良好的牡丹根上剥取根皮，之后将根皮漂洗、冲洗、消毒、再冲洗后晾干作为样品，备用；
步骤②：将最后一次冲洗用的液体涂布于平板中作为对照组，并在温度为28℃下恒温培养；
步骤③：将步骤①制得的样品放入无菌研钵中研磨至均匀，静置后取上清液并按1:9的比例稀释为2个梯度，之后把两个梯度的溶液涂布于固体平板上，并在温度为28℃的条件下培养，把每一个梯度再做3个重复，然后将对照组和样品组的两个梯度分别在平板上培养，用平板划线法对不同的菌落进行分离、纯化，即获得分离纯化后的牡丹内生枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述分离纯化牡丹内生枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：步骤①中漂洗根皮所用乙醇的质量百分比浓度为70-80%。
4.根据权利要求2所述分离纯化牡丹内生枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：步骤②中消毒根皮的具体方法是将根皮置于质量百分比浓度20-40%的次氯酸钠中浸泡2-4min。
5.一种收集权利要求1-4中任一项所述的牡丹内生枯草芽孢杆菌发酵液的方法，其特征在于包括：将牡丹内生枯草芽孢杆菌放于温度为28℃的NA培养基中过夜振荡培养，之后转移到PDA培养基中25-55℃振荡培养24-72h，然后收集培养液，并在温度为4℃、转速为10000g的情况下离心2min，收集上清液并用0.22μ m的无菌滤膜过滤除菌即得所述的发酵液。
6.如权利要求1所述的牡丹内生枯草芽孢杆菌于防治金黄色葡萄球菌病原菌中的应用。
7.一种防治金黄色葡萄球菌病原菌的生防菌，其特征在于包括权利要求1-6中任一项所述的拮抗金黄色葡萄球菌的牡丹内生枯草芽孢杆菌。
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