CN111264817A - 直投式乳酸菌发酵剂在榨菜腌制中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一直投式乳酸菌发酵剂在榨菜腌制中的应用，其中所述直投式乳酸菌发酵剂的应用是将直投式乳酸菌发酵剂投入到新鲜榨菜中发酵，以得到成品榨菜，其中所述直投式乳酸菌发酵剂由菌种ZJ316制备而成，CCTCC No：208077。
Description
技术领域
本发明涉及发酵领域，尤其涉及到直投式乳酸菌发酵剂在榨菜腌制中的应用。
背景技术
榨菜(Pickled tuber mustard)是以青菜头(植物学名茎瘤芥Brassica junceacoss var tumida tsenee lee)为原料，经过脱水、加盐腌制后再经后熟而成的一种半干态并伴有轻微乳酸发酵的腌制蔬菜制品。
目前，榨菜加工的整个过程和产品质量控制仍然是传统加工技术的主导、以小规模作坊式生产居多。在传统的腌制榨菜时，大多数都采用固态高盐发酵。大量加入食盐不仅是一种浪费，而且在加工过程中会产生大量含盐废水，导致环境污染。因为釆用高盐腌制，榨菜存在食盐含量高、生产周期长、安全质量不稳定、亚硝酸盐含量高等问题，同时榨菜腌制过程中可能会有杂菌的污染：如金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌等影响。此外，高盐腌制榨菜很容易造成大量营养物质流失，产品品质可能难以满足市场的需求。
另外，一些制造商在榨菜添加防腐剂如苯甲酸钠以抑制微生物活性来延长保质期。然而，添加防腐剂会对风味产生不利影响，苯甲酸纳的防腐不利于人体健康，不符合目前“绿色消费”理念。这些问题严重阻碍了我国酱腌菜生产现代化和国际竞争力。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一直投式乳酸菌发酵剂在榨菜腌制中的应用，其中所述直投式乳酸菌发酵剂能够被应用于榨菜腌制中，并且腌制获得的榨菜的亚硝酸盐的含量较低。
本发明的另一目的在于提供一直投式乳酸菌发酵剂在榨菜腌制中的应用，其中所述直投式乳酸菌发酵剂能够被应用于榨菜腌制中并且腌制时间能够被缩短。
本发明的另一目的在于提供一直投式乳酸菌发酵剂在榨菜腌制中的应用，其中榨菜腌制过程中细菌活动能够被抑制。
本发明的另一目的在于提供一直投式乳酸菌发酵剂在榨菜腌制中的应用，其中榨菜腌制过程中能够产生大量醇类化合物和酸类化合物，以赋予榨菜优良的发酵风味。
根据本发明的一方面，本发明提供了一直投式乳酸菌发酵剂的应用，其将直投式乳酸菌发酵剂投入到新鲜榨菜中发酵，以得到成品榨菜，其中所述直投式乳酸菌发酵剂由菌种植物乳杆菌ZJ316制备而成，CCTCC No：208077。
根据本发明的至少一个实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的应用包括如下步骤：
(1)投入菌剂于新鲜榨菜，其中所述菌剂包括所述直投式乳酸菌；和
(2)发酵结束后获得成品榨菜。
根据本发明的至少一个实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的应用在投入所述菌剂后进一步包括如下步骤：
加入盐水于榨菜。
根据本发明的至少一个实施例，所述直投式乳酸菌和所述榨菜的质量比为0.1～1∶100。
根据本发明的至少一个实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂包括所述植物乳杆菌ZJ316和保护剂，其中所述保护剂选自组合脱脂乳粉、海藻糖、D-山梨醇和甘油中的一种或多种。
根据本发明的至少一个实施例，所述保护剂是10％浓度脱脂奶粉；或者所述保护剂是2％浓度的海藻糖；或者所述保护剂是1％浓度的甘油；或者所述保护剂是3％浓度的D-山梨醇。
根据本发明的至少一个实施例，所述保护剂包括脱脂奶粉、海藻糖、甘油和D-山梨醇，其中脱脂奶粉∶海藻糖∶甘油∶D-山梨醇的浓度比例为8～12∶1～2∶0.5～1.5∶3～4。
根据本发明的至少一个实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂抑制金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1和副溶血性弧菌SCF16的生长。
根据本发明的至少一个实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂通过如下步骤制备：
活化植物乳杆菌ZJ316以获得活菌，其中所述植物乳杆菌ZJ316的保藏编号CCTCCNo：M 208077；
添加保护剂；以及
冷冻干燥获得直投式乳酸菌发酵剂。
根据本发明的至少一个实施例，所述植物乳杆菌ZJ316的接种量为3％。
根据本发明的至少一个实施例，在所述添加保护剂步骤之后，预冻所述植物乳杆菌ZJ316和所述保护剂的混合物。
根据本发明的至少一个实施例，在所述冷冻干燥步骤中，主冻干隔板温度为-5℃，解析干燥阶段隔板温度为5℃。
根据本发明的至少一个实施例，进一步包括如下步骤：
保藏所述直投式乳酸菌发酵剂于-20℃环境。
根据本发明的至少一个实施例，在所述冷冻干燥获得直投式乳酸菌发酵剂之前对于所述菌体和所述保护机进行预冻。
根据本发明的至少一个实施例，在-80摄氏度的条件下预冻12h。
根据本发明的至少一个实施例，在所述冷冻干燥步骤中的干燥条件为主冻干隔板温度-5摄氏度，冻干14h。
根据本发明的至少一个实施例，在所述冷冻干燥步骤中的干燥阶段隔板温度为5摄氏度，干燥10h，真空度为0.01mbar。
根据本发明的至少一个实施例，所述植物乳杆菌ZJ316保存在-80摄氏度。
根据本发明的至少一个实施例，所述植物乳杆菌ZJ316在固体培养基上培养至出现明显单菌落，然后接种单菌落体于液体培养基以培养。
根据本发明的至少一个实施例，所述植物乳杆菌ZJ316在液体培养基内于30摄氏度下培养24h。
附图说明
图1是根据本发明的一较佳实施例的直投式乳酸菌发酵剂的应用过程中乳酸菌数变化的示意图。
图2是根据本发明的一较佳实施例的直投式乳酸菌发酵剂的应用过程中pH变化的示意图。
图3是根据本发明的一较佳实施例的直投式乳酸菌发酵剂的应用过程中亚硝酸盐含量变化的示意图。
图4是根据本发明的一较佳实施例的直投式乳酸菌发酵剂的应用过程中氨基态氮含量变化的示意图。
图5A是在榨菜发酵前期根据多个样品测序所得的Shannon指数的示意图。
图5B是在榨菜发酵后期根据多个样品测序所得的Shannon指数的示意图。
图6A是在榨菜发酵前期的多个样品对应的榨菜的发酵结果的示意图。
图6B是在榨菜发酵后期的多个样品对应的榨菜的发酵结果的示意图。
图7A是在榨菜发酵前期的多个样品对应的榨菜的发酵结果的示意图。
图7B是在榨菜发酵后期的多个样品对应的榨菜的发酵结果的示意图。
图8A是榨菜腌制前期基于非加权距离的PcoA分析示意图。
图8B是榨菜腌制后期基于非加权距离PcoA分析示意图。
图9A是榨菜腌制前期LefSe分析示意图。
图9B是榨菜腌制前期LefSe分析示意图。
图10A是榨菜腌制后期LefSe分析示意图。
图10B是榨菜腌制后期LefSe分析示意图。
图11A是根据本发明的一较佳实施例的直投式乳酸菌发酵剂对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的抑菌示意图。
图11B是根据本发明的一较佳实施例的直投式乳酸菌发酵剂对单增李斯特氏菌LM1的抑菌示意图。
图11C是根据本发明的一较佳实施例的直投式乳酸菌发酵剂对副溶血球菌SCF16的抑菌示意图。
图12是榨菜卤水上清对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的抑菌示意图。
图13是榨菜卤水上清对单增李斯特氏菌LM1的抑菌示意图。
图14是榨菜卤水上清对副溶血弧菌SCF16的抑菌示意图。
图15是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在不同浓度脱脂乳影响下的存活率的示意图。
图16是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在不同浓度海藻糖影响下的存活率的示意图。
图17是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在不同浓度甘油影响下的存活率的示意图。
图18是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在不同浓度D-山梨醇影响下的存活率的示意图。
图19是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在不同贮藏条件影响下的存活率的示意图。
图20是根据本发明的一个较佳实施例的亚硝酸盐标准曲线的示意图。
图21是植物乳杆菌LZ227的生长曲线的示意图。
图22是植物乳杆菌ZFM228生长曲线的示意图。
图23是根据本发明的一个较佳实施例的植物乳杆菌ZJ316生长曲线的示意图。
图24是根据本发明的一个较佳实施例的初始接种量对乳酸菌生长的影响的示意图。
图25是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在榨菜汁培养基上的生长曲线的示意图。
图26是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在榨菜汁培养基上的pH变化的示意图。
图27是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在榨菜汁培养基上的可滴定酸的变化的示意图。
图28是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌对亚硝酸盐降解的影响的示意图。
图29是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌对亚硝酸盐的耐受性的示意图。
图30是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌抑菌效果的示意图。
图31是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌抑菌效果的示意图。
图32是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌抑菌效果的示意图。
图33是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌抑菌效果的示意图。
图34是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在不同浓度的NaCl处理下的存活率的示意图。
图35是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在不同浓度的乙醇处理下的存活率的示意图。
具体实施方式
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
本领域技术人员应理解的是，在本发明的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。
可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。
本发明提供了一直投式乳酸菌发酵剂的应用，其能够被应用于榨菜制备过程中，并且在制备过程中抑制亚硝酸盐的生成和某些细菌的生长，以高效地获得成品榨菜。
所述直投式乳酸菌发酵剂通过一种植物乳杆菌ZJ316(Lactobacillus plantarumZJ316)制备而成，其中所述植物乳杆菌ZJ316被保持于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC No：208077，保藏日期为2008年5月23。
本说明部分主要包括三部分内容，第一部分内容为植物乳杆菌ZJ316发酵剂应用于榨菜，第二部分内容为植物乳杆菌ZJ316发酵剂的制备，第三部分内容为植物乳杆菌ZJ316在发酵中的优势。
一、植物乳杆菌ZJ316发酵剂在应用于榨菜。
相关的试剂用品和设备如下：
实验菌种及其培养条件：
表1 实验主要菌种
Table 1 List of strains
表2 主要仪器
Table 2 List of main equipments
鲜菜头：余姚市铜钱桥食品菜业有限公司提供。
腌制用盐：余姚市铜钱桥食品菜业有限公司提供。
市售菌剂：泡菜酸菜乳酸菌发酵粉。(植物乳杆菌：活菌数为1.2×1011CFU/g)
植物乳杆菌ZJ316发酵剂：实验室自制。(活菌数为1.5×1012CFU/g)
亚铁氰化钾溶液：称取106.0g亚铁氰化钾，用超纯水定容至1000mL。
乙酸锌溶液：称取220.0g乙酸锌，先加30mL冰醋酸，用超纯水稀释至1000mL。
饱和硼砂溶液：称取5.0g硼酸钠，溶于100mL热水中，冷却后备用。
对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL 20％(V/V)盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存。
盐酸萘乙二胺溶液：称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶于100mL水中,混匀后，置棕色瓶中，避光保存。
亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.1000g干燥恒重的亚硝酸钠，加超纯水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。
亚硝酸钠标准使用液：使用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL，置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度。
溶菌肉汤培养基(Lysogency Broth Medium，LB)：准确称取氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，用超纯水完全溶解，调pH至7.2，定容至1L。
乳酸菌培养基(De-Man Rogosa Sharpe Medium，MRS)：准确称取无水葡萄糖20g，吐温-80 1mL，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，牛肉浸膏10g，无水乙酸钠5g，用超纯水溶解并定容至1L。
榨菜汁培养基：榨菜经洗净、打浆、抽滤后取榨菜汁250mL，加蒸馏水250mL、氯化钠20g，葡萄糖20g混匀，121℃，15min灭菌备用。
固体培养基在液体培养基的基础上添加2％的琼脂。培养基均需121℃高压灭菌15min。
根据本发明的一实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂在榨菜中的应用包括如下步骤：
发酵剂→人工接种
↓
鲜菜头→清洗→修剪整形→装坛→压实→适量盐水→密封发酵→后熟→混成品菜胚
具体操作如下：
(1)原料处理：选择不发黄、不干枯的新鲜榨菜，去皮切块，清洗沥干备用。
(2)修剪整形：将冷却的榨菜修剪成大小均一、无腐烂疤痕的小块。
(3)将菌剂(0.1％植物乳杆菌ZJ316发酵剂、1.25％市售菌剂、自然发酵)接入榨菜块中，并小心拌匀。
(4)装坛：将处理好的榨菜块小心地放入榨菜坛中，压实使其紧密无松动。
(5)再在坛子上面加入盐水(质量分数为8％)。
(6)成品：发酵结束后(30℃，一个月左右)，取出榨菜，切丝调味灭菌，成为成品榨菜。
所述菌剂可以是0.1％～1％的植物乳杆菌ZJ316发酵剂。为了对比说明所述直投式植物乳杆菌ZJ316发酵剂在榨菜制备中的优势，以市售菌剂和自然发酵作为对比例进行说明。
根据本发明的一些实施例，所述榨菜和盐水的质量比范围可以是5～10∶1。
对比试验的配方：榨菜与盐水(w＝8％)的质量比为8:1，菌剂添加量分别为0.1％植物乳杆菌ZJ316发酵剂、1.25％市售菌剂，使榨菜中植物乳杆菌ZJ316组与市售菌剂组乳酸菌活菌数在同一数量级。
根据本发明的另一些实施例，菌剂的添加量和榨菜的质量之比范围可以是0.1～1∶100。根据本发明的另一些实施例，菌剂的添加量和榨菜的质量之比范围可以是0.1∶100。
利用L.plantarum ZJ316发酵剂和市售菌剂腌制榨菜，并用自然发酵的榨菜作为对照，分组腌制。测定和分析腌制过程中乳酸菌数、酸度、亚硝酸盐含量的动态变化，并测定腌制后榨菜的氨基态氮含量以及主要风味物质成分，同时对腌制过程中的微生物群落多样性进行检测，以说明为乳酸菌L.plantarum ZJ316发酵剂应用于榨菜的优势。
1.1测试方法
(1)乳酸菌计数法：采用梯度稀释平板计数法，将卤水用生理盐水梯度稀释，涂布于MRS固体培养基，在最适条件下培养24h，选取菌落数在30-300之间的平板计数，每个试验设置三个平行。
(2)酸度测定方法：pH计测定，参照GB/T13662-2008。直接pH酸度计PB-10测定榨菜卤水pH。
(3)亚硝酸盐测定方法：亚硝酸盐含量的测定方法参照国标相关规定。
(4)氨基态氮测定方法：甲醛滴定法，参照国标GB/T13662-2008分析。甲醛法:吸取5.0mL匀浆,置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL，置于200mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，氢氧化纳标准溶(c(NaOH)＝0.050mol/L)滴定至酸度计指示pH8.2，加人10.0mL甲醛溶液，混匀。再用氢氧化纳标准滴定溶液(0.05mol/L)继续滴定至pH9.2，记下消耗氢氧化纳标准滴定溶液(0.05mol/L)的毫升数。同时取80mL水，先用氢氧化纳溶液(0.05mol/L)调节至pH为8.2，再加人10.0mL甲醛溶液溶液，用氢氧化纳标准滴定溶液(0.05mol/L)滴定至pH 9.2，同时做试剂空白试验。
(5)风味物质测定：
样品处理：将自然发酵的榨菜、市售菌剂接种发酵的榨菜和植物乳杆菌ZJ316发酵剂接种的榨菜样品分别制成匀浆后，过滤后置于15mL顶空进样瓶中，将顶空进样瓶放到50℃水浴锅内加热30min，备用。
萃取头老化方法：
1)点击软件左上角的菜单“方法(M)”，选择“固相微萃取老化.M”，此时软件最上方显示的方法名称就是“固相微萃取老化”，将萃取手柄上的刻度调到4，点击气质软件上方偏左位置的绿色箭头，打开样品信息输入窗口，输入数据文件名称如“老化-月-日”。
2)然后点击窗口下方的“确定并运行方法”按钮，等待15秒，气质软件出现“GC采集”对话框，上面有一个“开始运行”的按钮，将萃取手柄前端的针垂直插入气质的进样口，然后马上按下黑色推杆，伸出萃取头，然后按下气质仪器面板上的“Start”按键，开始运行老化程序。
3)30分钟后，将萃取手柄上部的黑色推杆向上收回，收回萃取头，然后拔出萃取手柄放在桌上。气质上的老化程序运行40分钟。
进样方法：
1)萃取头进行老化后，点击软件左上角的菜单“方法(M)”，选择“固相微萃取.M”，此时软件最上方显示的方法名称就是“固相微萃取”，然后就可以正常做样了。
2)30分钟后，转动萃取手柄的黑色套管，将刻度调到1，然后将萃取手柄前端的针插入顶空进样瓶瓶盖，按下萃取手柄上部的黑色推杆，伸出萃取头，略微转动卡在卡槽处，然后用铁架台把萃取手柄固定，萃取30分钟。
3)到时间后，点击气质软件左上方的绿色箭头，打开样品信息输入窗口，输入数据文件名称，然后点击窗口下方的“确定并运行方法”按钮。松开铁架台的固定，将萃取手柄上部的黑色推杆向上收回，收回萃取头，拔出萃取手柄。如果萃取手柄上有凝结的水珠，用纸巾擦干。
4)将萃取手柄上的刻度调到4。此时气质软件上应该已经出现一个叫“GC采集”的对话框，上面有一个“开始运行”的按钮。在插入进样口之前，需先确认软件左侧显示的柱箱温度是35℃，左上方“仪器状态”下面是绿色条带，上面显示“就绪”，这说明仪器已经准备好可以进样了。
GC-MS分析条件：7890A/5975GC/MS联用仪，色谱柱:HP-5MS型(30m×0.250mm×0.25μm)；载气：氦气；进样温度：230℃；进样量：1μL；升温程序：初温45℃保持2min，5℃/min上升至180℃，保持1min，25℃/min升到230℃，保持5.5min。
数据处理：由计算机质谱系统NSIT检索未知化合物，匹配度大于70％的结果将予以报告，面积归一法计算各成分的含量。
(6)DNA的提取及测序
DNA的提取
1)取2mL发酵原液至于70℃水浴锅中溶解；
2)将溶解好的发酵原液12000rpm离心2min；
3)在每个发酵原液中加入1mL Inhibit EX Buffer，再加入半勺的玻璃珠，振荡1min；
4)70℃水浴5min；
5)水浴完之后，20000×g，离心1min；
6)加入25μL的Proteinase K到新的2mL离心管中，并加入第5步的上清液600μL。
7)加入600μLBuffer AL，振荡15s；
8)70℃水浴10min；
9)取出后，加入600μL无水乙醇并充分混匀；
10)取第9步中的600μL于QIAamp spin column，离心1min，重复此步骤直至所有的液体都过完柱，并弃QIAamp spin column；
11)加入500μL Buffer AW 1，20000×g，离心1min；弃QIAamp spin column；
12)加入500μL Buffer AW 2，20000×g，离心3min，弃QIAamp spin column；
13)取新的QIAamp spin column，20000xg离心空转3min；
14)准备1.5mL EP管，将柱子置于其中，加入60μL ddH2O于柱子中，金属浴65℃，1min，20000×g离心1min，收集DNA溶液。
各样品细菌DNA测序：
将所提细菌DNA送于北京百迈克生物有限公司进行16S rDNA基因V3-V4区测序。用Visual Genomics-AS软件包(北京百迈克生物科技有限公司)进行细菌多样性分析。
(7)牛津杯法抑菌圈
实验操作如下：
1)将抑菌实验的指示菌活化。充分加热融化已灭菌的半固体培养基，轻轻振荡混匀，并置于55℃水浴锅内平衡温度防止凝固。
2)将灭过菌的牛津杯按照适宜间隔放置于一次性培养皿上。
3)将活化的指示菌按照1％的接菌量接种于15mL半固体培养基中，充分混匀后倒入培养皿中，轻轻混匀，使半固体培养基均匀覆盖培养皿表面，注意不要将培养基倒入牛津杯中。
4)待半固体培养基充分凝固后，用灭菌的镊子将牛津杯拔出，此时则会在半固体培养皿上形成的圆柱形孔洞。
5)在每个圆柱形孔洞中加入三种发酵榨菜卤水上清80μL，放置平板于4℃冰箱3h，使样品充分扩散。然后按照指示菌的最适培养条件于培养箱中培养，直至出现明显的抑菌圈。
(8)孔板抑菌试验
实验操作如下：
(1)将抑菌实验的指示菌活化。
(2)将活化的指示菌按照0.5％的接菌量接种于10mL液体培养基(LB)中，充分混匀。
(3)取三种发酵榨菜卤水上清20μL加入96孔板中，然后加入180μL混匀好的指示菌。对照组加MRS液体培养基。每个试验设置三个平行。
(4)将加好的96孔板置于指示菌的最适培养条件于培养箱中培养。10h后用酶标仪测定吸光度。
1.2分析和讨论
(1)榨菜腌制过程中乳酸菌数的变化
从图1可以看出，腌制初期市售菌剂接种组和植物乳杆菌ZJ316发酵剂接种组乳酸菌的数量显著高于对照组。腌制后期各组乳酸菌数呈下降趋势，主要原因是营养物质的减少和乳酸菌进入衰亡期。乳酸菌在榨菜后熟阶段起着关键性的作用，乳酸菌数量的优势可以加速这个阶段的完成。对照组中乳酸菌数量增长缓慢，腌制一个月后乳酸菌数只能达到3.09×106CFU/mL；市售菌剂接种组乳酸菌数量一开始可以达到1.34×108CFU/mL，但腌制后期乳酸菌数量持续减少，最终乳酸菌数量仅为8.12×105CFU/mL，稳定性较差；植物乳杆菌ZJ316接种组在腌制过程中乳酸菌数的数量最高可达4.27×108CFU/mL，腌制后期仍有较高的乳酸菌数，这对加快榨菜腌制有着重要意义。因此，植物乳杆菌ZJ316发酵剂接种组在乳酸菌数量上具有优势，在一定程度上可以加快榨菜的腌制过程。(2)榨菜腌制过程中卤水pH的变化
榨菜腌制过程卤水pH的变化见图2。可以看出，榨菜腌制的早期阶段，市售菌剂接种组和植物乳杆菌ZJ316发酵剂接种组乳酸菌乳酸菌数量较多，通过发酵产生大量酸性物质，因此接种组pH下降速度比对照组快。对照组乳酸菌数较少，pH值在腌制第21后pH值才能达到4.5以下；市售菌剂接种组一开始乳酸菌数较高，在腌制第17天后pH可接近4，但腌制后期乳酸菌急剧减少，导致pH有所回升；ZJ316接种组第9天后pH可以达到4以下，可以抑制亚硝酸盐的形成和有害微生物的生长，同时腌制后期pH值可以保持在3.67-3.79之间从而保证榨菜后熟阶段的安全。
(3)榨菜腌制过程中亚硝酸盐含量的变化
从图3可以看出，腌制初期ZJ316接种组、市售菌剂接种组和接对照组的亚硝酸盐含量呈上升趋势，然后出现一个亚硝酸盐的峰值，ZJ316接种组亚硝酸盐峰值为3.66mg/kg，市售菌剂接种组亚硝酸盐峰值为4.39mg/kg，自然发酵组亚硝酸盐峰值为10.28mg/kg。在pH4以下可以有效控制亚硝酸盐的产生，ZJ316接种组pH快速降低至4以下会抑制亚硝酸盐的形成，同时乳酸菌可以产生亚硝酸盐还原酶，ZJ316接种组后期乳酸菌数含量相对高，可以降解亚硝酸盐。
(4)榨菜中氨基态氮含量分析
从图4可以看出，ZJ316接种组氨基态氮含量最高为2.17g/L。榨菜中的蛋白质分解会产生氨基态氮，ZJ316接种组乳酸菌数量较多会分解蛋白质，生成大量的氨基态氮，从而增加榨菜的风味。
(5)榨菜汁挥发性风味物质的测定
经GC-MS分析，挥发性风味物质的相对含量见表4-3。从表中可以看出，共检测出61种物质，其中醇类18种、酸类6种、酯类11种、酮类5种、醛类3种、硫醚类5种、腈类5种、含苯化合物4种、烷类2种、烯烃类2种；其中对照组、市售菌剂接种组和ZJ316接种组含量均较高的物质为：酸类、醇类、酯类和酮类物质，这些物质应为榨菜的主要风味成分。对照组共检测出22种物质，其中醇类8种、酸类1种、酯类3种、酮类5种、硫醚类1种、腈类2种、苯环化合物1种、烷类1种。市售菌剂接种组共检测出28种物质，其中醇类8种、酸类3种、酯类5种、酮类1种、硫醚类3种、腈类3种、苯环化合物1种、烃类1种、烷类1种。植物乳杆菌ZJ316接种组共检出51种物质，其中醇类15种、酸类6种、酯类10种、酮类4种、硫醚类5种、腈类4种、苯环化合物3种、烃类2种、烷类2种。市售菌剂接种组和ZJ316接种组发酵榨菜，醇类化合物、酸类化合物和酮类化合物明显高于对照组。醇类、酸类和酮类是榨菜风味的主要影响化合物，ZJ316接种组醇类、酸类和酮类在种类和总体含量上优于市售菌剂接种组，可赋予榨菜优良的发酵风味。
表3 榨菜挥发性风味成分表
Table 3 Volatile flavor components of mustard juice medium
注：“—”表示未检测出此物质。
(6)微生物多样性分析
(a)16S rRNA基因高通量测序结果分析：
采用Illumina测序平台对3组(ZJ316发酵剂接种组腌制前期与后期分别表示为ZJ316A和ZJ316B、市售菌剂接种组表示为CA和CB、自然发酵组表示为ZA和ZB)榨菜样品中微生物群落进行16S rDNA(V3-V4高变区)进行高通量测序，获得的数据经筛选，优化和拼接，对拼接后的序列进一步去除嵌合体等质控后获得高质量的序列，再对高质量的序列在0.97相似度下进行聚类，对聚类后的序列进行嵌合过滤后，得到用于物种分类的OTU(OpticalTransform Unit)，最后统计各个样本OTU中的丰度信息，进行下一步分析。
测序深度是否达到要求，测序数据量是否合理是由测序稀释曲线决定的。稀释曲线主要用于反映测序数据量是否达到要求，并能间接反映样品中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，说明测序深度达到要求，测序数据量合理；反之，则表示样品中物种多样性较高，测序深度不够，还存在较多未被检测到的物种。如图5显示的是3个组别榨菜高通量测序的Shannon曲线。Shannon是用来估算样品中微生物多样性指数，Shannon值越大，说明微生物多样性越高。由图可知，随着Sequences取样的增加，OTUS曲线趋于平稳，表明测序深度已基本覆盖样品中所有物种，即测序深度达到实验要求。
(b)菌群结构相似性分析:
从图6A和图6B可知，从门的水平上分析，发酵前期的榨菜卤水样品总体每个都测到5种门，分别厚壁菌门(Firmicutes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)。其中厚壁菌门最主要菌群，平均占到了各个样品总OUT的60％左右。厚壁菌门包括芽孢杆菌纲(芽孢杆菌目和乳杆菌目)，其中芽孢杆菌属的主要作用是维持动物肠道的健康。厚壁菌门在农业、工业、环保、卫生、国防、医药、等领域具有重要应用价值，可用于降解土壤中难溶化合物、降解原油、固定空气中氮、防治植物病虫害、处理工业废水等。蓝藻门含有较高的蛋白质(一般为20～25％)，较完备的氨基酸和多种维生素；变形菌门是细菌中最大的一门，包括大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺旋杆菌等病原菌，这类细菌易引起动物腹泻；放线菌大部分是腐生菌，普遍分布于土壤中，有少数是和某些植物共生的，也有的是寄生菌，可致病，放线菌有一种土霉味，使水和食物变味；拟杆菌门主要为拟杆菌纲，是肠道中的主要病原菌。图6A和图6B可知，榨菜卤水样品发酵后期与发酵前期相比，ZJ316发酵剂接种组中Firmicutes含量略有减少，Cyanobacteria含量有所增加，Proteobacteria趋近消失；市售菌剂接种组和自然发酵组Firmicutes含量减少，Cyanobacteria含量增加，同时含有部分Proteobacteria。总体上，自然发酵组、市售菌剂接种组和ZJ316发酵剂接种组含有的细菌门的种类相似。接种组与自然发酵组相比都有一个共同特征，Firmicutes含量多于对照组中，ZJ316发酵剂接种组Firmicutes含量最高。综上所述，经植物乳杆菌ZJ316发酵剂接种后，榨菜中厚壁菌门比例增加，变形菌门减少。
我们在细菌“属”水平对3个组别的榨菜卤水样品中相对丰度的菌群绘制柱状图，结果如图7A和图7B所示。3组样品在属群水平上的菌群组成方面包含Lactobacillus和Staphylococcus等多个属。乳杆菌属(Lactobacillus)含大量益生菌菌种，可抑制病原菌的生长，繁殖改善肠道菌群结构；增强机体免疫功能；降低胆固醇、改善血脂等功能；葡萄球菌属(Staphylococcus)是一群革兰氏阳性球菌，葡萄球菌可通过多种途径侵入机体，导致皮肤或器官的多种感染，甚至败血症。自然发酵组中菌群比例最高的Staphylococcus，含少量的Lactobacillus；市售菌剂接种组Lactobacillus比例高于60％，Staphylococcus比例接近20％；ZJ316发酵剂接种组Lactobacillus比例高达90％，含少量的Staphylococcus。与自然发酵组相比，榨菜经过市售菌剂接种和ZJ316发酵剂接种后乳酸菌中的乳杆菌属(Lactobacillus)增多，但增多情况不一致，ZJ316发酵剂接种组最为明显。植物乳杆菌ZJ316数量的增多可能抑制了葡萄球菌的生长，对于此发现是否具有普遍性，需要进行更深入的研究来验证。
(c)Alpha多样性分析：
Alpha多样性主要用于评价单个样品中微生物菌群组成的多样性程度，是反映丰富度和均匀度的综合指标。Alpha多样性主要与两个因素有关：一是种类数目，即丰富度；二是多样性，即群落中个体分配上的均匀性。群落丰富度(Community richness)的指数主要包括Chao1指数、observed species指数和ACE指数，这三个指数越大，表明群落的丰富度越高。群落多样性(Community diversity)的指数，包括Shannon指数和Simpson指数，其中Shannon指数值越高，表明群落的多样性越高，而Simpson指数值越大，说明群落多样性越高。如表4所示。由Alpha多样性各指数来看，自然发酵组菌落丰富多样性最高，市售菌剂接种组和植物乳杆菌ZJ316接种组丰富度相对较低，其中植物乳杆菌ZJ316接种组最低。分析原因可能是接种L.plantarum ZJ316抑制了榨菜中腐败微生物的生长，使群落多样性降低。
表4 菌落微生物多样性指数表
Table 4 Colony Microbial Diversity Index Table
(d)Beta多样性分析：
Beta多样性用于不同生态系统之间多样性的比较，也就是样品间整体的差异。Beta多样性利用各样本序列间的进化关系及丰度信息来计算样本间距离，反映不同样本(组)间是否具有微生物群落结构的差异。Beta多样性计算主要基于OTU的群落比较方法，其中最常用的一种算法是Unifrac距离法，它考虑了序列间的进化距离，Unifrac指数越大表示样品间的差异越大。其中，UniFrac结果分为加权UniFrac(weighted UniFrac)与非加权UniFirac(unweighted UniFrac)两种，weighted UniFrac考虑了序列的丰度，而unweighted UniFrac只考虑了系列间的进化距离，没有考虑序列丰度。UniFrac结果分析有多种方法，其中主坐标分析(Principal coordinates analysis PcoA)是常用的一种分析方法，是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，没有改变样品点之间的项目位置关系，只改变了坐标系统。为了展示样品间物种多样性差异，我们使用unweighted UniFracPCoA的方法展示各处理组样品间的差异大小，结果如图8A和图8B所示。通过图中各样品点的远近观察个体或者群体间的差异，坐标图上距离越近的样品，相似性越大。总体来看，自然发酵组(ZA、ZB)主要分布在右侧，与其他各接种组分离的比较开，即与各接种组菌群是有差异的。其中，植物乳杆菌ZJ316发酵剂接种组(ZJ316A、ZJ316B，主要分布在左中侧)与自然发酵组(ZA、ZB，主要分布在最右侧)相距最远，说明植物乳杆菌ZJ316发酵剂接种组与自然发酵组差异最大。市售菌剂接种组(CA、CB)主要分布于中间两侧，与其他组分离的也比较开，也是有差异的。综上所述，植物乳杆菌ZJ316发酵剂接种组及市售菌剂接种组可以影响榨菜腌制过程中菌群的Beta多样性。图8A是榨菜腌制前期基于非加权距离的PcoA分析，图8B是榨菜腌制后期基于非加权距离PcoA分析；百分比表示该主成分对样品差异的贡献程度；图中的每个点表示一个样品，同一个组的样品使用同一种颜色表示。
(e)各处理组榨菜卤水中物种显著性差异分析：
为具体分析各处理组之间在丰度上有显著差异的物种(Biomarke)，我们选用了LefSe分析法。LefSe分析即LDA Effect Size分析，是一种线性判别分析方法用来估算每个物种丰度对差异效果影响的大小，以找出对样本划分产生显著性差异影响的群落或物种。
如图9A和图9B所示，经过LefSe分析，榨菜腌制前期自然发酵组微生物菌群中出现显著性增加的菌群为“目”水平上的Bacillales(能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢，抗逆性强)“科”水平上的Micrococcaceae(包括微球菌属、葡萄球菌属和动性球菌)、Staphylococcaceae(葡萄球菌科少数为致病菌，如金黄色葡萄球菌)和family_VII，“属”水平上的Glutamicibacter(谷氨酸杆菌产乙酸和少量的NH3、甲酸、CO2、H2、丙酸等。)、staphylococcus(葡萄球菌属多数为非致病菌，少数可导致疾病)、Citrobacter(柠檬酸杆菌属是肠道细菌中常见的非致病菌)和Exiguobacterium(微小杆菌属)；市售菌剂接种组微生物菌群中出现显著性增加的菌群为“属”的Streptococcus(链球菌属会引起各种化脓性炎症，猩红热，丹毒，新生儿败血症等疾病)；ZJ316接种组微生物菌群中出现显著性增加的菌群为“目”水平上的Lactobacillales(乳杆菌目，广泛分布于含有碳水化合物的动植物发酵产品中，具有益生作用)和Caulobacterales(柄杆菌目为非致病菌)，“科”水平上的Caulobacteraceae(柄杆菌科)和Lactobacillaceae(乳杆菌科)，“属”水平上的Lactobacillus(乳杆菌属)和Caulobacter(柄杆菌属)。图9A为聚类树图，不同颜色表示不同分组，不同颜色的节点表示在该颜色代表的分组中，起到重要作用的微生物群，黄色均代表无显著差异的微生物，由内到外的圆环分别表示门、纲、目、科、属、种的物种分类水平。图9B为统计不同分组中有显著作用的微生物类群通过LAD分析后得到的LAD分值，不同颜色代表不同分组。
图10A和图10B为榨菜腌制后期的微生物菌群的LefSe分析，由图可知，榨菜腌制后期自然发酵组微生物菌群中出现显著性增加的菌群为Chloroplast(叶绿体)和Cyanobacteria(蓝藻)，“门”水平上的Actinobacteria(放线菌门)“目”水平上的Bacillales(芽孢杆菌目)、Pseudomonadales(假单胞菌目，常见的有铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌)和Micrococcales(微球菌目)，“科”水平上的Staphylococcaceae(葡萄球菌科)、Micrococcaceae(微球菌科)、Pseudomonadaceae(假单胞菌科)和Leuconostocaceae(明串珠菌科，发酵多种糖产酸产气，不还原硝酸盐)，“属”水平上的Staphylococcus(葡萄球菌属多数为非致病菌，少数可导致疾病)、Pseudomonas(假单胞菌属)和Leuconosto(明串珠菌属)，“种”水平上的Paenarthrobacter；市售菌剂接种组微生物菌群中出现显著性增加的菌群为“科”水平上的Ruminococcaceae(瘤胃菌科属厚壁菌门)和Streptococcaceae(链球菌科)，“属”水平上的Streptococcus(链球菌属)，“种”水平上的Rathayibacter(鸭茅蜜穗病菌)；ZJ316接种组微生物菌群中出现显著性增加的菌群为“门”水平上的Firmicutes(厚壁菌门)和Caulobacterales(柄杆菌目为非致病菌)，“目”水平上的Lactobacillales(乳杆菌目)“科”水平上的Lactobacillaceae(乳杆菌科)，“属”水平上的Lactobacillus(乳杆菌属)。图10A为统计不同分组中有显著作用的微生物类群通过LAD分析后得到的LAD分值，不同颜色代表不同分组。图10B为聚类树图，不同颜色表示不同分组，不同颜色的节点表示在该颜色代表的分组中，起到重要作用的微生物群，黄色均代表无显著差异的微生物，由内到外的圆环分别表示门、纲、目、科、属、种的物种分类水平。
综上所述，自然发酵的榨菜中会产生有害微生物，市售菌剂接种发酵的榨菜中也存在有害微生物，而植物乳杆菌ZJ316接种发酵的榨菜，厚壁菌门微生物是起到重要作用的微生物群，使有益微生物增加，有害微生物减少。
(7)榨菜卤水的抑菌作用
通过微生物多样性分析可知，自然发酵的榨菜和市售菌剂接种发酵的榨菜中存在有害微生物，造成污染。选取榨菜中可能出现的有害微生物：金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1、副溶血球菌SCF16作为敏感指示菌，通过牛津杯法和96孔板法进行抑菌作用的研究。按照上述的牛津杯抑菌圈法研究榨菜卤水的抑菌作用。从图11A至图11C的结果发现，植物乳杆菌ZJ316发酵剂接种组对金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1和副溶血球菌SCF16均有一定的抑菌效果。利用96孔板继续研究榨菜卤水上清的抑菌作用。
利用96孔板继续研究榨菜卤水上清的抑菌作用。按照上述的96孔板抑菌实验方法，得到的结果如图12、图13和图14所示。发现当三组榨菜卤水上清的加样量20μL时，自然发酵组、市售菌剂接种组和ZJ316接种组金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1和副溶血性弧菌SCF16的生长有不同程度的抑制作用。其中自然发酵组与市售菌剂接种组抑菌作用相当；ZJ316接种组作用下，指示菌几乎不生长。当加大榨菜卤水上清加样量为50μL时，自然发酵接种组对指示菌的抑菌作用无明显变化；市售菌剂接种组对金黄色葡萄球菌ATCC25923、单增李斯特氏菌LM1的抑制作用的抑制作用增强，副溶血性弧菌SCF16几乎不生长；同时ZJ316接种组金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1和副溶血性弧菌SCF16无明显生长，对榨菜中有害微生物有明显的抑制作用，提高食用安全性。图12、图13和图14分别为榨菜卤水上清对金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1、副溶血弧菌SCF16的抗菌效果。
(8)小结
1、ZJ316发酵剂接种组自然发酵和市售菌剂接种组相比，ZJ316发酵剂接种组乳酸菌数较高，乳酸菌数的数量总是高于107CFU/mL；酸度下降较快，9天后pH可低于4；出现亚硝酸盐峰值较早，且峰值较低；腌制完成后，氨基态氮含量最高。
2、GC-MS分析可知，ZJ316发酵剂接种组中产生大量醇类化合物、酸类化合物和酮类化合物，可以赋予榨菜较好的优良的发酵风味。酮类物质可以产生清澈的香气，同时有机酸与发酵过程中产生的不同醇结合生成不同的酯物质，使其具有独特的复合香味。
3、微生物多样性的分析可知，厚壁菌门中的所属菌群成为显著性最大差异的菌群。厚壁菌门是ZJ316发酵剂接种组起到重要作用的微生物群。从细菌属的水平来分析，对照组中起到重要作用的微生物群葡萄球菌属(Staphylococcus)和假单胞菌属(Pseudomonas),含致病菌；同时市售菌剂接种组起重要作用的微生物群为链球菌属(Streptococcus)，能引起疾病；ZJ316发酵剂接种组重要作用的微生物群为乳杆菌属(Lactobacillus)，多数为益生菌。
4、接种了植物乳杆菌ZJ316发酵剂的榨菜，对金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1和副溶血弧菌SCF16有很强的抑制作用，几乎不生长。植物乳杆菌ZJ316可以抑制榨菜腌制过程中杂菌的生长，保证榨菜腌制安全。
二、植物乳杆菌ZJ316发酵剂的制备
根据本发明的一实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的制备过程如下所示，主要包括如下步骤：菌种活化→大瓶发酵培养→收集菌泥(湿重)→活菌计数→制备保护剂→添加保护剂→活菌计数→预冻→真空冷冻干燥。
在菌种活化和大瓶发酵培养步骤中：将20％甘油保藏于-80℃冰箱的菌种，划线于相应的固体培养基上，在适宜温度下培养至出现明显单菌落，接种单菌落体于相应液体培养基，置于适宜培养条件下培养，连续传代两次。
在收集菌体步骤中：将活化的L.plantarum ZJ316接种到1L MRS液体培养基中，接种量为3％，在30℃下培养24h。将发酵液离心(8000rpm，20min)，用0.85％生理盐水洗涤细胞三次，收集细胞。
值得一提的是，所述菌种ZJ316能够耐受亚硝酸盐、具有抑菌作用并且能够赋予榨菜优良的风味。相关的数据将在后文中具体阐述。
根据本发明的一些实施例，所述MRS液体培养基可以通过如下方式配置，准确称取无水葡萄糖20g，吐温-80 1mL，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，牛肉浸膏10g，无水乙酸钠5g，用超纯水溶解并定容至1L。
在活菌计数步骤中：采用菌落总数平板计数法，按计数的溶解液所对应的菌泥重量换算，最终单位以CFU/g计。
在制备保护剂步骤中：首先利用单因素试验确定保护剂的用量，然后基于正交试验优化以获得保护剂的较佳组合。根据本发明的一些实施例，所述制备保护剂步骤包括称取一定量的脱脂乳粉、海藻糖、D-山梨醇和甘油分别装入不同的蓝口瓶中进行高压灭菌。分别以不同的比例进行添加，检测冻干前后细胞的存活率，得到每种保护剂的最佳剂量，保护剂/菌泥(体积/质量)为3:1的比例添加。根据本发明的另一些实施例，所述制备保护剂步骤进一步包括根据单因素试验的结果，为了进一步确定冷冻干燥保护剂的最佳组合，以海藻糖、脱脂乳粉、D-山梨醇和甘油的添加量为影响因子，每个因子取三个水平并进行四因子，三级L9(34)正交试验，重复三次。
在添加保护剂和真空冷冻干燥步骤中：菌体和保护剂混匀之后放置-80℃下预冻12h，然后置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24h。干燥条件为：主冻干隔板温度-5℃，冻干14h，真空度0.1mbar；解析干燥阶段隔板温度为5℃，干燥10h，真空度为0.01mbar。
在上述步骤中，冻干存活率的计算是通过如下的步骤：将冻干粉末用脱脂奶粉再水化，以梯度稀释，并通过MRS培养基倒入平板中，在30℃下培养24h，并计数。测量冻干前和冻干后每毫升样品的活细胞数，每个试验重复三次。冷冻干燥存活率(％)＝冻干后每单位体积的活细胞数(CFU/mL)/冻干前每单位体积的活细胞数(CFU/mL)
值得注意的是，在所述直投式乳酸菌发酵剂中，关键的成分是冷冻干燥保护剂，它直接影响乳酸菌的发酵活力，存活率和稳定性。虽然真空冷冻干燥技术在微生物粉剂生产中应用最为广泛且与其他技术相比有着巨大的优越性，但是不可避免的是对于具有活性的菌株在较为极端的环境条件下进行冷冻干燥，它必然会对细胞造成不可逆转的损害。因此，在冻干前向物料中添加适当比例的保护剂，使菌体细胞在冷冻干燥过程中避免受到机械损伤，有效缓解细胞的冻害，从而提高存活率[97]。冻干保护剂有很多种类，一般分为两大类：大分子量保护剂和小分子量保护剂。最广泛使用的保护剂是糖，氨基酸，蛋白质和醇类。不同的保护剂具有不同的保护效果，对不同菌株的而言保护剂的效果也大相径庭。
本实施例中选取脱脂奶粉，海藻糖，甘油和D-山梨糖醇甘油作为保护剂，提高成活率。最后通过急性毒性实验研究制成的乳酸菌直投式发酵剂的安全性。
本文中关于所述直投式乳酸菌发酵剂涉及的试剂、设备和测试方法如下所示：
菌种为植物乳杆菌ZJ316：L.plantarum ZJ316。所述菌种ZJ316被保持于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC No：M 208077，保藏日期为2008年5月23号。
脱脂乳粉市售，海藻糖，D-山梨醇，甘油，乳糖均购自杭州常青化工有限公司，均为分析纯。
牛肉浸膏、琼脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物等购自上海生工有限公司。
无水葡萄糖、硝酸钠、蔗糖、氯化钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、硫酸锰、四水硫酸亚铁、无水乙酸钠、吐温-80、柠檬酸三铵、磷酸氢二钾、氯化钠等购自杭州常盛科教器具厂。
对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、乙酸锌、四硼酸钠、亚铁氰化钾、亚硝酸钠、亚硝酸钠标准溶液购于国药集团化学试剂有限公司。
鲜菜头：余姚市铜钱桥食品菜业有限公司提供。
溶菌肉汤培养基(Lysogency Broth Medium，LB)：准确称取氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，用超纯水完全溶解，调pH至7.2，定容至1L。
乳酸菌培养基(De-Man Rogosa Sharpe Medium，MRS)：准确称取无水葡萄糖20g，吐温-80 1mL，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，牛肉浸膏10g，无水乙酸钠5g，用超纯水溶解并定容至1L。
榨菜汁培养基：榨菜经洗净、打浆、抽滤后取榨菜汁250mL，加蒸馏水250mL、氯化钠20g，葡萄糖20g混匀，121℃，15min灭菌备用。
固体培养基在液体培养基的基础上添加2％的琼脂。培养基均需121℃高压灭菌15min。
生理盐水：称取0.85g NaCl，用超纯水定容至100mL，高压灭菌，备用。
海藻糖溶液：称取不同克数海藻糖于容量瓶中，用超纯水溶解均匀，配成不同浓度的海藻糖溶液。高压灭菌，备用。
脱脂乳粉：称取不同克数脱脂乳粉于容量瓶中，用超纯水溶解均匀，配成不同浓度的脱脂乳粉溶液。高压灭菌，备用。
D-山梨醇：在容量瓶中称取不同克的脱脂奶粉，用超纯水均匀溶解，并制备不同浓度的D-山梨糖醇溶液。高压灭菌，备用。
甘油：用量筒量取不同毫升甘油，用超纯水混合均匀，配成不同浓度的甘油。高压灭菌，备用。
5％乳糖溶液：称取5克乳糖，用超纯水定容至100mL，高压灭菌，备用。
主要仪器如下表所示
2.1确定所述直投式乳酸菌发酵剂的保护剂所述直投式乳酸菌保护剂的筛选过程如下述说明：称取一定量的脱脂乳粉、海藻糖、D-山梨醇和甘油分别装入不同的蓝口瓶中进行高压灭菌。分别以不同的比例进行添加，检测冻干前后细胞的存活率，得到每种保护剂的最佳剂量，保护剂/菌泥(体积/质量)为3:1的比例添加。
(1)脱脂乳粉的影响：
脱脂乳粉的保护作用机理是：当冻干时，脱脂乳中的乳清蛋白可在细菌外形成一层蛋白质膜，以防止细胞壁破裂时细胞内物质的泄漏。同时，脱脂乳中的乳糖也起到保护细菌的作用。由于脱脂奶粉含有丰富的蛋白质，它可以为细胞提供保护壳，稳定细胞膜结构，有利于细胞复水作用的特性[98,99]。脱脂奶粉是最广泛使用的保护剂之一，因为它价格实惠且易于购买。本实验中使用脱脂乳作为保护剂来观察不同浓度的脱脂乳对细胞的保护作用。
附图15中示出了不同浓度的脱脂乳对菌剂存活率的影响。从图15可以看出，在适当的浓度范围内，随着脱脂乳浓度的增加，乳酸菌的存活率显着增加，表明脱脂乳的保护效果更好。从图中的数据来看，当脱脂奶粉浓度为10％时，细胞活力可达49.67％，当脱脂奶浓度超过10％时，细菌的存活率呈下降趋势，导致此结果的原因可能是当脱脂奶粉的浓度增加时，保护剂中的固体含量增加，再加上脱脂乳溶液本身的粘度相对较大，不利于冷冻干燥过程中水的升华挥发，导致冷冻干燥时间延长，使得细胞在过长的冻干过程中受到较大损害，导致细菌死亡率上升。综上所述，最初确定10％的脱脂奶粉是最佳浓度。
(2)海藻糖的影响：
关于海藻糖对细胞的保护机制有两种假说，分别是水替代假说和玻璃状态假说。水替代假说认为一层水膜包围保护着生物体中的碳水化合物、脂肪、蛋白质和其他大分子物质，这层薄薄的水膜起着维持其结构和功能特性的作用。在冷冻干燥过程中，这层水膜逐渐被除去，导致这些大分子物质发生不可逆变化，海藻糖可在干燥生物分子的失水部位以羟基和分子形成氢键，取代了由水形成的氢键，这使得分子在缺水条件下仍保持其原有结构，而不丧失活性。玻璃态假说认为当干燥时海藻糖紧密地包住相邻近的分子，形成一种碳水化合物玻璃体，这种非晶体结构的扩散系数很低，能够使生物分子维持一定的空间结构。
附图16中示出了不同浓度的海藻糖对菌剂存活率的影响。从图16可知，设定不同浓度的海藻糖进行实验，得到不同数值的菌体存活率。如果海藻糖浓度高或低，保护效果将大大降低。当加入的海藻糖量为2％时，植物乳杆菌ZJ316的冻干存活率达到最大值64.00％。所以，初步确定海藻糖的最佳浓度为2％。
(3)甘油的影响：
当冷冻保存菌株时，甘油充当保护剂和防冻剂，以防止由于水的冷冻或升华而对细胞造成损害。在冷冻干燥过程中，由于甘油有多个氢键细胞膜中的磷酸基团或细菌蛋白质的极性基团与羟基形成氢键，以保护细胞膜的完整性和蛋白质结构和功能。
附图17中示出了不同浓度的甘油对菌剂存活率的影响。图17可以看出，甘油的浓度对细胞的存活率具有显着影响。当甘油浓度为1％时，细胞的存活率最高，由此初步确定甘油的最佳浓度为1％。
(4)山梨糖醇的影响：
D-山梨糖醇具有良好的保护作用，因为其结构中具有多个羟基，并且在冻干过程中水分子可被羟基取代，细胞膜中的磷酸基团或细菌蛋白质的极性基团与羟基形成氢键，以保护细胞膜的完整性和蛋白质结构和功能。
附图18中示出了不同浓度的D-山梨醇对菌剂存活率的影响。从图18可知，细胞存活率在不同浓度下的D-山梨醇有所差异。D-山梨醇的浓度为1％，2％，3％和4％所对应的菌体存活率分别为21.33％，30.00％，36.67％和25.33％。该结果的原因是过高的D-山梨糖醇浓度加速了细胞内蛋白质的聚合，形成玻璃化结构不利于复水。根据本发明的一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的保护剂可以是：10％的脱脂奶粉；或者是2％的海藻糖；或者是1％的甘油；或者是3％的甘油。进一步地，使用高效保护剂是通过真空冷冻干燥技术制备活性微生物剂的关键。单独使用单一保护剂不足以减轻真空冷冻干燥过程中细胞受到的损害。为了制备更高活性的植物乳杆菌ZJ316菌剂。根据上述单因素四种保护剂脱脂奶粉，海藻糖，甘油和D-山梨醇，每个因子需要3个等级，设计L9(34)的正交试验表以选择保护剂的组合。因子水平表如表5所示，实验计划表如下表6所示。
表5 正交试验因素水平表
Table 5 Factors and levels of orthogonal test
表6 四因素三水平正交试验方案与结果
Table 6 Result of orthogonal experiment
表7 四因素三水平方差分析表
Table 7 Four factors and three levels of variance analysis
在正交试验中，样品存活率最高的组合是A2B1C2D3，即脱脂乳粉10％、海藻糖1.5％、甘油1％、D-山梨醇3.5％，样品的活菌数达1.5×1012CFU/g。
根据方差分析，四个因素对产品活菌数的影响是牛奶脱脂粉>甘油>D-山梨醇>甘油。单因素的最佳组合是A2B2C2D2，它没有出现在正交设计表中，但在实验过程中，有设计这组参数组合，所得样品的存活率达1.09×1012CFU/g。显然没有按照A2B1C2D3这一组合进行冷冻干燥所制得的样品活菌数高。根据本发明的一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的所述保护剂包括脱脂奶粉、海藻糖、甘油、D-山梨醇中的一个或者是多种。根据本发明的另一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的所述保护剂包括脱脂奶粉、海藻糖、甘油和D-山梨醇。
根据本发明的另一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的所述保护剂包括即脱脂奶粉10％，海藻糖1.5％甘油1％，D-山梨醇3.5％，样品的活菌数达1.5×1012CFU/g。根据范围分析，四种因素对产品活菌数的影响依次是脱脂奶粉，甘油，海藻糖，D-山梨糖醇。根据本发明的另一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的所述保护剂的脱脂奶粉：海藻糖：甘油：D-山梨醇的比例为10∶1.5∶1∶3.5。
根据本发明的另一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的所述保护剂的脱脂奶粉：海藻糖：甘油：D-山梨醇的比例为8～12∶1～2∶0.5～1.5∶3～4。根据本发明的另一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的所述保护剂的脱脂奶粉∶海藻糖∶甘油∶D-山梨醇的比例为8∶1∶0.5∶3。根据本发明的另一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的所述保护剂的脱脂奶粉∶海藻糖∶甘油∶D-山梨醇的比例为12∶2∶1.5∶4。
2.2所述直投式植物乳杆菌ZJ316发酵剂的复水活性
进一步地，通过如下步骤测试所述直投式植物乳杆菌ZJ316发酵剂的复水活性：使用生理盐水，5％乳糖，10％脱脂奶粉作为复水介质，以1∶100(质量/体积)的比例分别溶于复水介质中。在30℃下活化30min后，置于30℃培养箱中培养24h，测量活细胞数。每个试验重复三次。
活化不仅可以将细菌从休眠状态转变为正常细胞，还可以修复在冷冻干燥过程中受损的细胞。它可以减少复水过程中水渗透到细胞中的影响，从而保持较高的活力。不同的复水介质对植物乳杆菌ZJ316冻干细胞的影响如表8所示。结果表明，10％脱脂乳培养基的活化效果最为理想，可以在较短的时间内恢复植物乳杆菌ZJ316的活力。
表8 不同复水介质对细菌复水活性的影响
Table 8 Influence of different rehydration media on bacteria activity
结论如下：通过再水化实验，真空冷冻干燥后的细胞具有良好的活性，相当于未冷冻干燥的细胞。
2.3所述直投式植物乳杆菌ZJ316发酵剂的储藏温度
进一步地，通过如下步骤测试所述直投式植物乳杆菌ZJ316发酵剂的储藏温度：将植物乳杆菌ZJ316发酵剂分别在室温(25℃)，4℃和-20℃下储存。分别在0d、15d、30d后测定菌剂的活菌数，确定冻干细菌的最佳储存温度。
在菌粉的保藏过程中，湿度、水分、温度等均会对保藏期产生一定的影响。从图19中的实验结果可知，菌粉中菌株的活性在不同温度环境下有所不同。本实验分别选择在常温(25℃)、4℃和-20℃下进行储存，从整体上看，三种不同条件下对菌粉中活菌数影响不是很大，在4℃和-20℃下存活的粉末具有比室温更好的保存效果，活菌数在存储30天后依旧保持在12次方以上。综合考虑，在-20℃下储存的菌粉活菌数更稳定。
结论如下：菌粉在4℃和-20℃的活菌数相比室温的保存效果更好，活菌数在储存30天后都依旧保持高活力，但显然在-20℃保藏时菌粉的活性最佳。综合考虑，-20℃为最佳储藏温度。
2.4所述直投式植物乳杆菌ZJ316发酵剂的急性毒性
进一步地，通过如下步骤测试所述直投式植物乳杆菌ZJ316发酵剂的急性毒性：使用体重为18-22g的20只健康ICR小鼠，半雄性和半雌性。实验动物使用许可证号为SYXK(浙江)2011-0166。实验动物饲料由浙江省实验动物中心提供，实施标准为GB14924-2010。检测环境条件，温度范围为20℃至25℃，相对湿度范围为40％至70％。在测试之前，将实验动物在动物房环境中适应3天。按限量法设20.0g/kg体重一个剂量组。称取样品20g用1％羧甲基纤维素钠配置成40mL悬浮液备用，小鼠灌胃前禁食(不禁水)6h，按0.2mL/10g体重灌胃容量灌胃给予受试物，灌胃一次。小鼠灌胃给受试物后自由进食，饮水。连续给药14天后，观察并记录小鼠的一般状况、中毒表现和死亡，并在实验的开始和结束时记录小鼠的体重。
在毒性试验期间，雌性小鼠的平均初始体重为19.7±1.0g，最终体重为27.8±1.0g。雄性小鼠平均初始体重为19.8±1.0g，终期体重为30.5±1.4g，体重明显有变化，且雄性体重增加的更加明显，雌雄小鼠在实验期间均未出现中毒表现，也无死亡的情况。植物乳杆菌ZJ316对雄性和雌性小鼠的口服毒性耐受剂量大于20.0g/kg BW，小鼠体重示于表9中。
表9 植物乳杆菌ZJ316急性经口毒性试验小鼠死亡情况
Table 9 Acute oral toxicity test of L.plantarum ZJ316 in mice
植物乳杆菌ZJ316发酵剂根据“食品安全国家急性口服毒性试验”测试结果表明：雄性和雌性小鼠的急性毒性LD50大于20.0g/Kg体重。根据急性毒性(LD50)剂量分类的分类，植物乳杆菌ZJ316属实际无毒。
三、用于制备所述直投式发酵剂的所述植物乳杆菌ZJ316
用于制备所述直投式发酵剂的所述植物乳杆菌ZJ316本身具有优异的特性，在发酵过程中，植物乳杆菌ZJ316本身能够抑制硝酸盐的生成并且具有抑菌作用，并且还适用于大规模的生产。
3.1相关的用品和测试方法
3.1.1实验相关的试剂用品和设备如下所示：
实验主要菌种
主要仪器
牛肉浸膏、琼脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物等购自上海生工有限公司。
无水葡萄糖、硝酸钠、蔗糖、氯化钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、硫酸锰、四水硫酸亚铁、无水乙酸钠、吐温-80、柠檬酸三铵、磷酸氢二钾、氯化钠等购自杭州常盛科教器具厂。
对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、乙酸锌、四硼酸钠、亚铁氰化钾、亚硝酸钠、亚硝酸钠标准溶液购于国药集团化学试剂有限公司。
鲜菜头：余姚市铜钱桥食品菜业有限公司提供。
溶菌肉汤培养基(Lysogency Broth Medium，LB)：准确称取氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，用超纯水完全溶解，调pH至7.2，定容至1L。
乳酸菌培养基(De-Man Rogosa Sharpe Medium，MRS)：准确称取无水葡萄糖20g，吐温-80 1mL，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，牛肉浸膏10g，无水乙酸钠5g，用超纯水溶解并定容至1L。
榨菜汁培养基：榨菜经洗净、打浆、抽滤后取榨菜汁250mL，加蒸馏水250mL、氯化钠20g，葡萄糖20g混匀，121℃，15min灭菌备用。
固体培养基在液体培养基的基础上添加2％的琼脂。培养基均需121℃高压灭菌15min。
亚铁氰化钾溶液：称取106.0g亚铁氰化钾，用超纯水定容至1000mL。
乙酸锌溶液：称取220.0g乙酸锌，先加30mL冰醋酸，用超纯水稀释至1000mL。
饱和硼砂溶液：称取5.0g硼酸钠，溶于100mL热水中，冷却后备用。
对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL 20％(V/V)盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存。
盐酸萘乙二胺溶液：称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶于100mL水中,混匀后，置棕色瓶中，避光保存。
亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.1000g干燥恒重的亚硝酸钠，加超纯水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。
亚硝酸钠标准使用液：使用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL，置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度。
3.1.2相关的测试方法如下：
(1)菌种活化：将20％甘油保藏于-80℃冰箱的菌种，划线于相应的固体培养基上，在适宜温度下培养至出现明显单菌落，接种单菌落体于相应液体培养基，置于适宜培养条件下培养，连续传代两次。
(2)亚硝酸盐测试方法：参照国标GB 5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法。称取5g制成匀浆的试样，置于50mL烧杯中，加12.5mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300mL将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温，加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL，滤液备用。
测定时吸取40.0mL上述滤液于50mL带塞比色管中，另吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.0mL、2.50mL亚硝酸钠标准使用液(相当于0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亚硝酸钠)，分别置于50mL带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液,混匀，静置3min～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。
(3)降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选：将活化好的乳酸菌接到MRS液体种子培养基中活化18h后，以3％的接种量接入MRS培养基中(50mL培养基/250mL三角瓶)，30℃静置培养48h，用1mol/L氢氧化钠将培养基pH调至6.0，加入事先配制好的无菌NaNO2标准液使得培养基中最终含量为125μg/mL，37℃避光静置24h，测定培养液中NaNO2含量，空白试验组以无菌水接种。每个试验重复三次。
亚硝酸盐降解率计算公式：亚硝酸盐降解率＝(对照组亚硝酸盐含量-处理组亚硝酸盐含量)/对照组亚硝酸盐含量×100％
(4)接种量的确定方法：将L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316分别以1％、2％、3％、4％、5％的接种量接入到10mL榨菜汁培养基中，30℃培养24h后测定活菌数。每个试验重复三次。
(5)菌株生长曲线和产酸特征特定：将L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316按体积分数为3％、4％、3％的接种量接种于10mL榨菜汁培养基，30℃培养，每隔6h测定菌体生长的OD600值，并测定pH值及产酸率。
细胞浓度测定(光密度法)：用尤尼柯2000可见分光光度计测定。
产酸率：乳酸(％)＝(NNaOHVNaOH×0.09/V样品)×100
乳酸菌在榨菜汁培养基中对于亚硝酸盐的降解率：在含NaNO2(125μg/mL)的榨菜汁培养基中按体积分数为3％、4％、3％的接种量接种培养菌株L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316每隔12h测定亚硝酸盐降解率。以灭菌未培养的榨菜汁培养基中添加NaNO2为对照。每个试验重复三次。
亚硝酸盐降解率计算公式：亚硝酸盐降解率＝(对照组亚硝酸盐含量-处理组亚硝酸盐含量)/对照组亚硝酸盐含量×100％
(6)菌株在榨菜汁培养基上挥发性风味物质的测定
样品处理：将L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM 228和L.plantarum ZJ316分别按体积分数为3％、4％、3％的接种量接种于10mL榨菜汁培养基，置于最适条件下培养24h。培养结束装入15mL顶空进样瓶中，将顶空进样瓶放到50℃水浴锅内加热30min，备用。
萃取头老化方法：
1)点击软件左上角的菜单“方法(M)”，选择“固相微萃取老化.M”，此时软件最上方显示的方法名称就是“固相微萃取老化”，将萃取手柄上的刻度调到4，点击气质软件上方偏左位置的绿色箭头，打开样品信息输入窗口，输入数据文件名称如“老化-月-日”。
2)然后点击窗口下方的“确定并运行方法”按钮，等待15s，气质软件出现“GC采集”对话框，上面有一个“开始运行”的按钮，将萃取手柄前端的针垂直插入气质的进样口，然后马上按下黑色推杆，伸出萃取头，然后按下气质仪器面板上的“Start”按键，开始运行老化程序。
3)30min后，将萃取手柄上部的黑色推杆向上收回，收回萃取头，然后拔出萃取手柄放在桌上。气质上的老化程序运行40min。
进样方法：
1)萃取头进行老化后，点击软件左上角的菜单“方法(M)”，选择“固相微萃取.M”，此时软件最上方显示的方法名称就是“固相微萃取”，然后就可以正常做样了。
2)30min后，转动萃取手柄的黑色套管，将刻度调到1，然后将萃取手柄前端的针插入顶空进样瓶瓶盖，按下萃取手柄上部的黑色推杆，伸出萃取头，略微转动卡在卡槽处，然后用铁架台把萃取手柄固定，萃取30min。
3)到时间后，点击气质软件左上方的绿色箭头，打开样品信息输入窗口，输入数据文件名称，然后点击窗口下方的“确定并运行方法”按钮。松开铁架台的固定，将萃取手柄上部的黑色推杆向上收回，收回萃取头，拔出萃取手柄。如果萃取手柄上有凝结的水珠，用纸巾擦干。
4)将萃取手柄上的刻度调到4。此时气质软件上应该已经出现一个叫“GC采集”的对话框，上面有一个“开始运行”的按钮。在插入进样口之前，需先确认软件左侧显示的柱箱温度是35℃，左上方“仪器状态”下面是绿色条带，上面显示“就绪”，这说明仪器已经准备好可以进样了。
GC-MS分析条件：7890A/5975GC/MS联用仪，色谱柱:HP-5MS型(30m×0.250mm×0.25μm)；载气：氦气；进样温度：230℃；进样量：1μL；升温程序：初温45℃保持2min，5℃/min上升至180℃，保持1min，25℃/min升到230℃，保持5.5min。
数据处理：由计算机质谱系统NSIT检索未知化合物，匹配度大于70％的结果将予以报告，面积归一法计算各成分的含量。
(7)植物乳杆菌ZJ316的亚硝酸盐耐受性
将L.plantarum ZJ316接种于0-10mg/mL的NaNO2培养基中，30℃培养12h，测定OD600nm。
(8)牛津杯法抑菌圈牛津杯法，又称管碟法，是国际上通用的用来测定抗生素效价的方法，也是很多国家药典所规定的方法。牛津杯法显示的抑菌圈大小来测定抑菌物质对指示菌的作用效果。实验操作如下：
实验操作如下：
1)将抑菌实验的指示菌活化。充分加热融化已灭菌的半固体培养基，轻轻振荡混匀，并置于55℃水浴锅内平衡温度防止凝固。
2)将灭过菌的牛津杯按照适宜间隔放置于一次性培养皿上。
3)将活化的指示菌按照1％的接菌量接种于15mL半固体培养基中，充分混匀后倒入培养皿中，轻轻混匀，使半固体培养基均匀覆盖培养皿表面，注意不要将培养基倒入牛津杯中。
4)待半固体培养基充分凝固后，用灭菌的镊子将牛津杯拔出，此时则会在半固体培养皿上形成的圆柱形孔洞。
5)在每个圆柱形孔洞中加入80μL待测样品(LZ227、ZFM228、ZJ316的发酵液上清)，放置平板于4℃冰箱3h，使样品充分扩散。然后按照指示菌的最适培养条件于培养箱中培养，直至出现明显的抑菌圈。
(9)孔板抑菌试验：
1)将抑菌实验的指示菌活化。
2)将活化的指示菌按照1％的接菌量接种于10mL液体培养基(LB)中，充分混匀。
3)取植物乳杆菌ZJ316培养24h后发酵上清20μL加入96孔板中，然后加入180μL混匀好的指示菌。对照组加MRS液体培养基。每个试验设置三个平行。
4)将加好的96孔板置于指示菌的最适培养条件于培养箱中培养。10h后用酶标仪测定吸光度。
3.2植物乳杆菌ZJ316对于亚硝酸盐的降解能力
测试植物乳杆菌ZJ316的降解能力的步骤如下所示，首先进行菌种活化，将20％甘油保藏于-80℃冰箱的菌种，划线于相应的固体培养基上，在适宜温度下培养至出现明显单菌落，接种单菌落体于相应液体培养基，置于适宜培养条件下培养，连续传代两次。
然后将活化好的乳酸菌接到MRS液体种子培养基中活化18h后，以3％的接种量接入MRS培养基中(50mL培养基/250mL三角瓶)，30℃静置培养48h，用1mol/L氢氧化钠将培养基pH调至6.0，加入事先配制好的无菌NaNO2标准液使得培养基中最终含量为125μg/mL，37℃避光静置24h，测定培养液中NaNO2含量，空白试验组以无菌水接种。每个试验重复三次。
亚硝酸盐降解率计算公式：亚硝酸盐降解率＝(对照组亚硝酸盐含量-处理组亚硝酸盐含量)/对照组亚硝酸盐含量×100％
参照国标GB 5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法对于亚硝酸盐进行测试。可以是如下的步骤：
称取5g制成匀浆的试样，置于50mL烧杯中，加12.5mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300mL将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温，加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL，滤液备用。
测定时吸取40.0mL上述滤液于50mL带塞比色管中，另吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.0mL、2.50mL亚硝酸钠标准使用液(相当于0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亚硝酸钠)，分别置于50mL带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液,混匀，静置3min～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。
分别取准确吸取0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00，2.50mL亚硝酸钠标准使用液(0，1，2，3，4，5，7.5，10，12.5μg亚硝酸钠)，共9个亚硝酸盐浓度，绘制亚硝酸盐标准曲线。获得的线性方程式为y＝0.0241x+0.0001(R2＝0.9999)，如图20。该标准曲线线性良好，可用于测定亚硝酸盐含量。
表10 菌株发酵液中亚硝酸盐降解率
Table 10 Nitrite degradation ability of different lactic acidbacterium strains
结合亚硝酸盐标准曲线方程求得各菌株的亚硝酸盐降解率，其降解亚硝酸盐能力具体结果见表10。结果表明，对初始含量为125μg/mL的亚硝酸盐降解率在90％以上的菌株有5株，降解率在80％～90％之间的菌株有2株，降解率在70％～80％和60％～70％之间的菌株各有1株。L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316对亚硝酸盐降解率达到了93％以上，NaNO2残留量(μg/mL)分别为8.2750、8.6875和4.1375，表现出了强降解亚硝酸盐的能力。
3.3降亚硝酸盐乳酸菌的发酵特性
(1)生长速率
从图21、图22、图23中可以看出三株乳酸菌L.plantarum LZ227、L.plantarumZFM228和L.plantarum ZJ316的生长规律。其中，L.plantarum LZ227在0-4h生长较为缓慢，4-12h进入对数生长期，在此阶段进行种子取样，接种到MRS液体培养基，14-32h为稳定生长期；L.plantarum ZFM228在0-4h缓慢生长，4-10h迅速生长，进入对数生长期，此时取种子接种到MRS液体培养基，18-26h菌株处于稳定期；L.plantarum ZJ316在0-2h缓慢生长，2-10h迅速生长，进入对数生长期，在此期间进行种子取样，接种到MRS液体培养基，16-30h菌株处于稳定期。
(2)接种量
活化相关的乳酸菌。分别以1％、2％、3％、4％、5％接种量接入到榨菜汁培养基中，培养24h后测定活菌数，结果如图24。从图24可知不同接种量对乳酸菌的生长产生不同的影响，接种量较少时，培养基中营养物质成分充足，乳酸菌可以大量生长；随着接种量的增加，培养基中的营养成分被充分利用，乳酸菌数量增加；当接种量过高，虽然前期乳酸菌生长迅速，但后期乳酸菌因营养缺乏而导致部分菌体死亡。三株菌种的最适接种量:L.plantarumLZ227为3％，L.plantarum ZFM228为4％，L.plantarum ZJ316为3％。
(3)在榨菜汁培养基上的生长曲线和产酸特性
由图25可知，乳酸菌L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarumZJ316都能够很好地适应榨菜发酵环境，在榨菜汁培养基中生长良好，其中以L.plantarumZJ316生长情况最好。在榨菜发酵过程中，主导发酵的乳酸菌会分泌乳酸、乙酸等有机酸，在赋予榨菜产品独特风味的同时，导致环境pH的下降，抑制了好氧杂菌的生长，这对保证榨菜的安全性至关重要。所以考察了L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarumZJ316利用榨菜汁培养基发酵产酸的情况，来衡量乳酸菌发酵性能。由图26和图27可知3株乳酸菌均能利用榨菜汁培养基产酸，L.plantarum ZJ316在榨菜汁培养基中产酸速度最快，培养至24h发酵液的pH下降至4.10，可滴定酸度达到0.143％，培养24h后低pH可能参与亚硝酸盐的降解。
(4)在榨菜汁培养基上对亚硝酸盐的降解率
乳酸菌L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316在榨菜汁培养基上对亚硝酸盐的降解率的结果见图28。L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316经过36h的培养，亚硝酸盐降解率达到80％以上，72h亚硝酸盐降解率分别为90.3％、89.6％和95.23％，其中L.plantarum ZJ316表现最强的降解亚硝酸能力，且降解速度较快。
(5)榨菜汁挥发性风味物质的测定
经顶空固相微萃取后进行GC-MS分析，挥发性风味物质的相对含量见表2-4。从表中可以看出，共检测出54种物质，其中醇类17种、酸类7种、酯类7种、酮类7种、醛类4种、硫醚类3种、腈类2种、含芳香化合物3种、烷类4种。其中乳酸菌L.plantarum LZ227、L.plantarumZFM228和L.plantarum ZJ316接种组含量均较高的物质有：乙酸、辛酸、月桂酸、含硫化合物、甘油芥酸酯，这些物质应为榨菜的主要风味成分。对照组共检测出18种物质，其中醇类3种、酯类2种、酮类2种、醛类3种、腈类2种、芳香化合物2种、烷类4种。L.plantarum LZ227接种组共检测出27种物质，其中醇类9种、酸类6种、酯类1种、酮类4种、醛类2种、硫醚类3种、腈类2种、芳香化合物1种、烷类1种。L.plantarum ZFM228接种组共检出31种物质，其中醇类8种、酸类5种、酯类5种、酮类3种、醛类4种、硫醚类3种、腈类2种、芳香化合物1种。L.plantarum ZJ316接种组共检出34种物质其中醇类11种、酸类6种、酯类4种、酮类3种、醛类2种、硫醚类3种、腈类2种、芳香化合物3种。乳酸菌L.plantarum LZ227、L.plantarumZFM228和L.plantarum ZJ316接种组中，醇类化合物、酸类化合物和酮类化合物明显高于对照组。醇类、酸类和酮类是榨菜风味的主要影响化合物，有机酸与不同醇类物质相结合生成不同酯类物质，赋予了蔬菜发酵制品独特的复合香味；而酮类物质会使榨菜具有清香味。另一方面，感官嗅觉分析也清楚地感觉到乳酸菌L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316接种组在香气香味上要比对照组强。而L.plantarum ZJ316醇类含量与酸类含量优于菌L.plantarum LZ227和L.plantarum ZFM228。
表11 乳酸菌发酵榨菜汁挥发性风味成分表
Table 11 Volatile flavor components of mustard juice medium
注：“—”表示未检测出此物质。
3.4植物乳杆菌ZJ316亚硝酸盐的耐受性
考察了L.plantarum ZJ316在不同亚硝酸盐浓度的耐受性，结果见图29。L.plantarum ZJ316在亚硝酸盐浓度3.2mg/mL时，乳酸菌仍能正常生长；当亚硝酸盐浓度达到3.6mg/mL时，乳酸菌生长量明显降低；当浓度为4.8mg/mL时，其生长受到严重抑制；亚硝酸盐浓度大于8.4mg/mL时，几乎不生长。由此得出L.plantarum ZJ316最适的亚硝酸盐浓度为0～3.2mg/mL。
3.5植物乳杆菌ZJ316的抑菌作用
由于榨菜腌制过程中容易受到有害微生物的污染，如金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和单增李斯特菌等影响。选取金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1、副溶血球菌SCF16作为敏感指示菌，通过牛津杯法和96孔板法进行抑菌作用的研究。按照牛津杯抑菌圈法研究其对榨菜中可能出现的致病菌的抑菌作用。从图30A至图30C的结果发现，植物乳杆菌ZJ316对金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1和副溶血球菌SCF16均有一定的抑菌效果。利用96孔板继续研究L.plantarum ZJ316的抑菌作用。图30A、图30B以及图30C分别为植物乳杆菌ZJ316对金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1、副溶血性弧菌SCF16。
按照上述的96孔板抑菌实验方法，得到的结果如图31、图32以及图33。发现当L.plantarum ZJ316发酵液上清的加样量20μL时，会抑制金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1和副溶血弧菌SCF16的生长，尤其对金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌抑菌效果明显。当加大植物乳杆菌ZJ316的发酵上清加样量为50μL，副溶血弧菌SCF16和金黄色葡萄球菌ATCC 25923的生长严重受到抑制，而单增李斯特氏菌LM1几乎不生长。可以得出L.plantarum ZJ316对榨菜中潜在的致病菌具有明显的抑菌作用。图31、图32和图33分别为植物乳杆菌ZJ316对金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1、副溶血弧菌SCF16的抗菌效果。
通过上述的实验可知，植物乳杆菌ZJ316本身具有较强的亚硝酸盐降解能力，在榨菜培养基中表现出了较强的产酸能力，并且产酸速度强于其他类型的乳酸菌。进一步地，植物乳杆菌ZJ316在发酵过程中可以产生大量的醇类化合物和酸类化合物，并且产生的数量强于其他的乳酸菌，以赋予榨菜优良的发酵风味。进一步地，植物乳杆菌ZJ316对于亚硝酸盐具有一定的耐受性和能够抑制榨菜中潜在的致病菌。值得一提的是，植物乳杆菌ZJ316适于应用于工业化的生产。
3.6植物乳杆菌ZJ316耐渗透压性能
植物乳杆菌ZJ316的耐渗透压性能测试可以通过如下的步骤进行：
将-80℃冻存的植物乳杆菌ZJ316于MRS固体平板划线接种，37℃厌氧培养24h复苏，经两次传代活化后转接MRS液体，过夜培养菌液16-18小时，以6000r/min离心10分钟，弃去发酵上清液，菌泥用无菌生理盐水(0.85％)洗涤两次后，用等体积的无菌生理盐水缓冲液重悬。
菌株液体培养16-18h后，4℃，6000r/min离心10min，菌泥用无菌生理盐水(0.85％)洗涤两次后，用等体积的灭菌生理盐水重悬。取重悬后的菌体悬浮液100μL接种于含不同浓度NaCl的MRS培养基中，37℃培养24h后，无菌情况下取培养液50μL，用无菌水梯度稀释，于MRS固体培养基平板上涂布，37℃培养至菌落明显出现，准确计数，每组做三个平行，以未加NaCl的MRS培养基培养的菌株作对照。
在上述步骤中，MRS液体培养基的配制如下：准确称取10g蛋白胨，5g酵母提取物，20g无水葡萄糖，10g牛肉膏，2g磷酸氢二钾，2g柠檬酸氢二铵，5g乙酸钠，0.2g七水硫酸镁，0.05g硫酸锰，1mL吐温-80，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。
MRS固体培养基的配制如下：在MRS液体培养基配方的基础上加入1％-1.5％的琼脂，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。
含3％、6％、8％NaCl MRS培养基配制如下：在普通MRS液体培养基配方的基础上分别加入30g、60g和80g NaCl，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。
耐高渗透压性能是乳酸菌株能否在商业中应用的先决条件之一。发酵过程中菌株产生乳酸，增加细胞的渗透压，将游离酸转化为盐，可防止体系中pH过度降低。由图34可知，植物乳杆菌ZJ316在NaCl浓度为3％，6％和8％时存活率分别为89.03％，69.53％和18.44％，表明植物乳杆菌ZJ316可以在高渗透压环境下可存活，且存活率较高，此结果与Masuda等人报道的大多数LAB菌株耐渗透压性能相似。
3.7植物乳杆菌ZJ316耐乙醇性能
植物乳杆菌ZJ316的耐乙醇性能测试可以通过如下的步骤进行：
将-80℃冻存的植物乳杆菌ZJ316于MRS固体平板划线接种，37℃厌氧培养24h复苏，经两次传代活化后转接MRS液体，过夜培养菌液16-18小时，以6000r/min离心10分钟，弃去发酵上清液，菌泥用无菌生理盐水(0.85％)洗涤两次后，用等体积的无菌生理盐水缓冲液重悬。
菌株液体培养16-18h后，4℃，6000r/min离心10min，菌泥用无菌生理盐水(0.85％)洗涤两次后，用等体积的无菌生理盐水(0.85％)重悬。取重悬后的菌体悬浮液100μL接种于乙醇浓度分别为2.5％，5％，7.5％，10％的MRS液体培养基中，37℃培养箱培养24h，无菌情况下取培养液50μL，用无菌水梯度稀释，于MRS固体培养基平板上涂布，37℃培养至菌落明显出现，准确计数，每组做三个平行，以未加乙醇的MRS培养基培养的菌株作对照。
在上述步骤中，MRS液体培养基的配制如下：准确称取10g蛋白胨，5g酵母提取物，20g无水葡萄糖，10g牛肉膏，2g磷酸氢二钾，2g柠檬酸氢二铵，5g乙酸钠，0.2g七水硫酸镁，0.05g硫酸锰，1mL吐温-80，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。
MRS固体培养基的配制如下：在MRS液体培养基配方的基础上加入1％-1.5％的琼脂，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。
含2.5％、5％、7.5％、10％和12.5％乙醇(98％)MRS液体培养基配制如下：于灭菌后的普通MRS培养基中分别加入25mL、50mL、75mL、100mL和125mL乙醇(98％)可得到相应浓度的乙醇MRS培养基。
在工业发酵和食品加工过程中，细菌必须克服各种物理和化学屏障，才能发挥其作用，与耐高渗透压相似，乳酸菌对乙醇的耐受性也经常作为评价其在工业应用中的指标之一。如图35所示，随着乙醇浓度的增大，植物乳杆菌ZJ316的存活率逐渐降低，当乙醇浓度为5％时，植物乳杆菌ZJ316的存活率高达71％，当乙醇浓度为10％时，植物乳杆菌ZJ316的存活率依然保持在40％左右，由此说明，植物乳杆菌ZJ316的乙醇耐受性能良好。而Masuda等人研究发现大多数LAB菌株当乙醇浓度大于5％时，其耐受性极差，存活率很低。
本领域的技术人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。
Claims (20)
1.一直投式乳酸菌发酵剂的应用，其特征在于，将直投式乳酸菌发酵剂投入到新鲜榨菜中发酵，以得到成品榨菜，其中所述直投式乳酸菌发酵剂由菌种ZJ316制备而成，CCTCCNo：208077。
2.根据权利要求1所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其包括如下步骤：
(1)投入菌剂于新鲜榨菜，其中所述菌剂包括所述直投式乳酸菌；和
(2)发酵结束后获得成品榨菜。
3.根据权利要求2所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，在投入所述菌剂后进一步包括如下步骤：
加入盐水于榨菜。
4.根据权利要求3所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中所述榨菜和所述直投式乳酸菌的质量比为0.1～1∶100。
5.根据权利要求1至4任一所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中所述直投式乳酸菌发酵剂包括所述植物乳酸菌ZJ316和保护剂，其中所述保护剂选自组合脱脂乳粉、海藻糖、D-山梨醇和甘油中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中所述保护剂是10％浓度脱脂奶粉；或者所述保护剂是2％浓度的海藻糖；或者所述保护剂是1％浓度的甘油；或者所述保护剂是3％浓度的D-山梨醇。
7.根据权利要求5所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中所述保护剂包括脱脂奶粉、海藻糖、甘油和D-山梨醇，其中脱脂奶粉：海藻糖：甘油：D-山梨醇的浓度比例为8～12∶1～2∶0.5～1.5∶3～4。
8.根据权利要求1至4任一所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中所述直投式乳酸菌发酵剂抑制金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1和副溶血弧菌SCF16的生长。
9.根据权利要求1至4任一所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中所述直投式乳酸菌发酵剂通过如下步骤制备：
活化植物乳杆菌ZJ316以获得活菌，其中所述植物乳杆菌ZJ316的保藏编号CCTCC No：M208077；
添加保护剂；以及
冷冻干燥获得直投式乳酸菌发酵剂。
10.根据权利要求1至3任一所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中所述植物乳杆菌ZJ316的接种量为3％。
11.根据权利要求9所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中在所述添加保护剂步骤之后，预冻所述植物乳杆菌ZJ316和所述保护剂的混合物。
12.根据权利要求9所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中在所述冷冻干燥步骤中，主冻干隔板温度为-5℃，解析干燥阶段隔板温度为5℃。
13.根据权利要求12所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，进一步包括如下步骤：
保藏所述直投式乳酸菌发酵剂于-20℃环境。
14.根据权利要求9所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中在所述冷冻干燥获得直投式乳酸菌发酵剂之前对于所述菌体和所述保护机进行预冻。
15.根据权利要求14所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中在-80摄氏度的条件下预冻12h。
16.根据权利要求9所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中在所述冷冻干燥步骤中的干燥条件为主冻干隔板温度-5摄氏度，冻干14h。
17.根据权利要求9所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中在所述冷冻干燥步骤中的干燥阶段隔板温度为5摄氏度，干燥10h，真空度为0.01mbar。
18.根据权利要求9所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中所述植物乳杆菌ZJ316保存在-80摄氏度。
19.根据权利要求9所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中所述植物乳杆菌ZJ316在固体培养基上培养至出现明显单菌落，然后接种单菌落体于液体培养基以培养。
20.根据权利要求9所述的直投式乳酸菌发酵剂的应用，其中所述植物乳杆菌ZJ316在液体培养基内于30摄氏度下培养24h。
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