CN111197015B

CN111197015B - 直投式乳酸菌发酵剂和制备方法

Info

Publication number: CN111197015B
Application number: CN201911341978.3A
Authority: CN
Inventors: 顾青; 陈晓镇; 郦萍
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2039-12-24
Also published as: CN111197015A

Abstract

本发明提供了一直投式乳酸菌发酵剂和制备方法，其中所述直投式乳酸菌发酵剂，应用乳酸菌中的植物乳杆菌ZJ316制备，其中所述植物乳杆菌的保藏编号CCTCC No：M 208077。

Description

直投式乳酸菌发酵剂和制备方法

技术领域

本发明涉及到发酵领域，尤其涉及到直投式乳酸菌发酵剂和制备方法。

背景技术

随着发酵行业的发展，发酵剂越来越受到人们的关注，其发展过程主要经历了天然发酵剂、传统发酵剂、冷冻浓缩发酵剂、冷冻干燥浓缩发酵剂几个阶段。

传统发酵剂的制备需要活化复壮标准菌，再逐级扩大培养，过程繁琐复杂，容易造成污染，菌种质量不易控制。冷冻干燥发酵剂具有活力强、用量少、污染低、便于运输、保藏、使用方便等优点，在欧美发达国家的乳制品行业中已经规模应用。

乳酸菌是一组以生成乳酸的能力为特征的细菌，其主要包括乳球菌属、链球菌属、肠球菌属、明串珠菌属和乳杆菌属等18种属。乳酸菌被广泛地应用在食品和饲料工业中，在乳制品、发酵肉和发酵蔬菜、酸面包中都可以找到各种乳酸菌。

在过去的一段时间内，冻干乳酸菌发酵剂被广泛使用，尤其是在乳制品和奶酪工业中，但是多为国外进口，并且限制于冻干乳酸菌发酵剂的不完善的生产技术，冻干乳酸菌发酵剂的价格大多较为昂贵。在使用中还存在着质量不均匀，生命力较短等问题。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一直投式乳酸菌发酵剂和制备方法，其中所述直投式乳酸菌发酵剂基于筛选后的优质乳酸菌制备，适于工业化应用。

本发明的另一目的在于提供一直投式乳酸菌发酵剂和制备方法，其中所述直投式乳酸菌发酵剂适于蔬菜发酵领域，能够抑制蔬菜发酵过程中的亚硝酸盐的生成。

本发明的另一目的在于提供一直投式乳酸菌发酵剂和制备方法，其中所述直投式乳酸菌发酵剂能够抑制发酵过程中产生的有害微生物。

本发明的另一目的在于提供一直投式乳酸菌发酵剂和制备方法，其中通过所述制备方法制备的所述直投式乳酸菌发酵剂具有良好的活性。

本发明的另一目的在于提供一直投式乳酸菌发酵剂和制备方法，其中所述直投式发酵剂对于人体健康无害。

根据本发明的一方面，本发明提供了一直投式乳酸菌发酵剂，其应用乳酸菌中的植物乳杆菌ZJ316制备，其中所述植物乳杆菌的保藏编号CCTCC No：M 208077。

根据本发明的至少一个实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂包括所述植物乳杆菌ZJ316和保护剂，其中所述保护剂选自组合脱脂乳粉、海藻糖、D-山梨醇和甘油中的一种或多种。

根据本发明的至少一个实施例，所述保护剂是10％浓度脱脂奶粉；或者所述保护剂是2％浓度的海藻糖；或者所述保护剂是1％浓度的甘油；或者所述保护剂是3％浓度的D-山梨醇。

根据本发明的至少一个实施例，所述保护剂包括脱脂奶粉、海藻糖、甘油和 D-山梨醇，其中脱脂奶粉：海藻糖：甘油：D-山梨醇的浓度比例为 8～12:1～2:0.5～1.5:3～4。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一直投式乳酸菌发酵剂的制备方法，包括如下步骤：

活化植物乳杆菌ZJ316以获得活菌，其中所述植物乳杆菌ZJ316的保藏编号 CCTCCNo：M 208077；

添加保护剂；以及

冷冻干燥获得直投式乳酸菌发酵剂。

根据本发明的至少一个实施例，在所述添加保护剂步骤之后，预冻所述植物乳杆菌ZJ316和所述保护剂的混合物。

根据本发明的至少一个实施例，在所述冷冻干燥步骤中，主冻干隔板温度为 -5℃，解析干燥阶段隔板温度为5℃。

根据本发明的至少一个实施例，在上述方法中，添加脱脂奶粉、海藻糖、甘油和D-山梨醇中的一个或多个作为保护剂。

根据本发明的至少一个实施例，在上述方法中，其中所述保护剂包括脱脂奶粉、海藻糖、甘油和D-山梨醇，其中脱脂奶粉：海藻糖：甘油：D-山梨醇的浓度比例为8～12:1～2:0.5～1.5:3～4。

根据本发明的至少一个实施例，所述制备方法进一步包括如下步骤：

保藏所述直投式乳酸菌发酵剂于-20℃环境。

根据本发明的至少一个实施例，在所述冷冻干燥获得直投式乳酸菌发酵剂之前对于所述菌体和所述保护机进行预冻。

根据本发明的至少一个实施例，在-80摄氏度的条件下预冻12h。

根据本发明的至少一个实施例，在所述冷冻干燥步骤中的干燥条件为主冻干隔板温度-5摄氏度，冻干14h。

根据本发明的至少一个实施例，在所述冷冻干燥步骤中的干燥阶段隔板温度为5摄氏度，干燥10h，真空度为0.01mbar。

根据本发明的至少一个实施例，所述植物乳杆菌ZJ316保存在-80摄氏度。

根据本发明的至少一个实施例，所述植物乳杆菌ZJ316在固体培养基上培养至出现明显单菌落，然后接种单菌落体于液体培养基以培养。

根据本发明的至少一个实施例，所述植物乳杆菌ZJ316在液体培养基内于 30摄氏度下培养24h。

附图说明

图1是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在不同浓度脱脂乳影响下的存活率的示意图。

图2是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在不同浓度海藻糖影响下的存活率的示意图。

图3是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在不同浓度甘油影响下的存活率的示意图。

图4是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在不同浓度D-山梨醇影响下的存活率的示意图。

图5是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在不同贮藏条件影响下的存活率的示意图。

图6是根据本发明的一个较佳实施例的亚硝酸盐标准曲线的示意图。

图7是植物乳杆菌LZ227的生长曲线的示意图。

图8是植物乳杆菌ZFM228生长曲线的示意图。

图9是根据本发明的一个较佳实施例的植物乳杆菌ZJ316生长曲线的示意图。

图10是根据本发明的一个较佳实施例的初始接种量对乳酸菌生长的影响的示意图。

图11是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在榨菜汁培养基上的生长曲线的示意图。

图12是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在榨菜汁培养基上的pH变化的示意图。

图13是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在榨菜汁培养基上的可滴定酸的变化的示意图。

图14是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌对亚硝酸盐降解的影响的示意图。

图15是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌对亚硝酸盐的耐受性的示意图。

图16是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌抑菌效果的示意图。

图17是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌抑菌效果的示意图。

图18是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌抑菌效果的示意图。

图19是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌抑菌效果的示意图。

图20是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在不同浓度的NaCl处理下的存活率的示意图。

图21是根据本发明的一个较佳实施例的乳酸菌在不同浓度的乙醇处理下的存活率的示意图。

具体实施方式

以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。

可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。

本发明提供了一种直投式乳酸菌发酵剂，其能够显著降低榨菜产品中亚硝酸盐的含量，抑制杂菌的生长，并且提高了榨菜的食用安全性。

乳酸菌的种类十分多样，需要对其进行一定的筛选，本发明提供了一种直投式乳酸菌发酵剂的制备方法，其基于筛选后的乳酸菌进行真空冷冻干燥以获得直投式乳酸菌发酵剂。

乳酸菌具有无芽孢、生长营养要求高的特点导致乳酸菌培养费时而且对外界抵抗力能力较差，难以长期保存。而且在低温环境会造成细胞的结构和功能受到损害。因此考虑制备成乳酸菌发酵剂应用于榨菜腌制。

值得注意的是，液体发酵剂与冷冻发酵剂在使用前需先经过活化复壮、并扩培后才可使用，发酵剂中的活菌数较低，剂量大，细菌在活化和膨胀过程中容易被感染，质量不均匀。冷冻干燥发酵剂也称为直投式发酵剂，并且通过在进行增殖培养后浓缩菌株，添加保护剂以制备高浓度细菌悬浮液，然后进行冷冻干燥来制备。直投式发酵剂具有活菌含量高，使用方便，质量均匀等优点，已广泛应用于发酵工业。

本说明部分主要包括两个部分的内容，第一部分内容为所述直投式乳酸菌发酵剂的制备，第二部分内容为植物乳杆菌ZJ216在发酵中的特性。

一、所述直投式乳酸菌发酵剂的制备

根据本发明的一实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的制备过程如下所示，主要包括如下步骤：菌种活化→大瓶发酵培养→收集菌泥(湿重)→活菌计数→制备保护剂→添加保护剂→活菌计数→预冻→真空冷冻干燥。

在菌种活化和大瓶发酵培养步骤中：将20％甘油保藏于-80℃冰箱的菌种，划线于相应的固体培养基上，在适宜温度下培养至出现明显单菌落，接种单菌落体于相应液体培养基，置于适宜培养条件下培养，连续传代两次。

在收集菌体步骤中：将活化的L.plantarum ZJ316接种到1L MRS液体培养基中，接种量为3％，在30℃下培养24h。将发酵液离心(8000rpm，20min)，用0.85％生理盐水洗涤细胞三次，收集细胞。

值得一提的是，所述菌种ZJ316能够耐受亚硝酸盐、具有抑菌作用并且能够赋予榨菜优良的风味。相关的数据将在后文中具体阐述。

根据本发明的一些实施例，所述MRS液体培养基可以通过如下方式配置，准确称取无水葡萄糖20g，吐温-80 1mL，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，牛肉浸膏10g，无水乙酸钠5g，用超纯水溶解并定容至1L。

在活菌计数步骤中：采用菌落总数平板计数法，按计数的溶解液所对应的菌泥重量换算，最终单位以CFU/g计。

在制备保护剂步骤中：首先利用单因素试验确定保护剂的用量，然后基于正交试验优化以获得保护剂的较佳组合。根据本发明的一些实施例，所述制备保护剂步骤包括称取一定量的脱脂乳粉、海藻糖、D-山梨醇和甘油分别装入不同的蓝口瓶中进行高压灭菌。分别以不同的比例进行添加，检测冻干前后细胞的存活率，得到每种保护剂的最佳剂量，保护剂/菌泥(体积/质量)为3:1的比例添加。根据本发明的另一些实施例，所述制备保护剂步骤进一步包括根据单因素试验的结果，为了进一步确定冷冻干燥保护剂的最佳组合，以海藻糖、脱脂乳粉、D-山梨醇和甘油的添加量为影响因子，每个因子取三个水平并进行四因子，三级L9(3⁴) 正交试验，重复三次。

在添加保护剂和真空冷冻干燥步骤中：菌体和保护剂混匀之后放置-80℃下预冻12h，然后置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24h。干燥条件为：主冻干隔板温度-5℃，冻干14h，真空度0.1mbar；解析干燥阶段隔板温度为5℃，干燥10 h，真空度为0.01mbar。

在上述步骤中，冻干存活率的计算是通过如下的步骤：将冻干粉末用脱脂奶粉再水化，以梯度稀释，并通过MRS培养基倒入平板中，在30℃下培养24h，并计数。测量冻干前和冻干后每毫升样品的活细胞数，每个试验重复三次。冷冻干燥存活率(％)＝冻干后每单位体积的活细胞数(CFU/mL)/冻干前每单位体积的活细胞数(CFU/mL)

值得注意的是，在所述直投式乳酸菌发酵剂中，关键的成分是冷冻干燥保护剂，它直接影响乳酸菌的发酵活力，存活率和稳定性。虽然真空冷冻干燥技术在微生物粉剂生产中应用最为广泛且与其他技术相比有着巨大的优越性，但是不可避免的是对于具有活性的菌株在较为极端的环境条件下进行冷冻干燥，它必然会对细胞造成不可逆转的损害。因此，在冻干前向物料中添加适当比例的保护剂，使菌体细胞在冷冻干燥过程中避免受到机械损伤，有效缓解细胞的冻害，从而提高存活率。冻干保护剂有很多种类，一般分为两大类：大分子量保护剂和小分子量保护剂。最广泛使用的保护剂是糖，氨基酸，蛋白质和醇类。不同的保护剂具有不同的保护效果，对不同菌株的而言保护剂的效果也大相径庭。

本实施例中选取脱脂奶粉，海藻糖，甘油和D-山梨糖醇甘油作为保护剂，提高成活率。最后通过急性毒性实验研究制成的乳酸菌直投式发酵剂的安全性。

本文中关于所述直投式乳酸菌发酵剂涉及的试剂、设备和测试方法如下所示：

菌种为植物乳杆菌ZJ316：L.plantarum ZJ316，分类命名Lactobacillusplantarum。所述菌种ZJ316被保持于中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏编号为CCTCC No： M 208077，保藏日期为2008年5月23号。

脱脂乳粉市售，海藻糖，D-山梨醇，甘油，乳糖均购自杭州常青化工有限公司，均为分析纯。

牛肉浸膏、琼脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物等购自上海生工有限公司。

无水葡萄糖、硝酸钠、蔗糖、氯化钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、硫酸锰、四水硫酸亚铁、无水乙酸钠、吐温-80、柠檬酸三铵、磷酸氢二钾、氯化钠等购自杭州常盛科教器具厂。

对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、乙酸锌、四硼酸钠、亚铁氰化钾、亚硝酸钠、亚硝酸钠标准溶液购于国药集团化学试剂有限公司。

鲜菜头：余姚市铜钱桥食品菜业有限公司提供。

溶菌肉汤培养基(Lysogency Broth Medium，LB)：准确称取氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，用超纯水完全溶解，调pH至7.2，定容至1L。

乳酸菌培养基(De-Man Rogosa Sharpe Medium，MRS)：准确称取无水葡萄糖20g，吐温-80 1mL，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，牛肉浸膏10g，无水乙酸钠5g，用超纯水溶解并定容至1L。

榨菜汁培养基：榨菜经洗净、打浆、抽滤后取榨菜汁250mL，加蒸馏水250 mL、氯化钠20g，葡萄糖20g混匀，121℃，15min灭菌备用。

固体培养基在液体培养基的基础上添加2％的琼脂。培养基均需121℃高压灭菌15min。

生理盐水：称取0.85g NaCl，用超纯水定容至100mL，高压灭菌，备用。

海藻糖溶液：称取不同克数海藻糖于容量瓶中，用超纯水溶解均匀，配成不同浓度的海藻糖溶液。高压灭菌，备用。

脱脂乳粉：称取不同克数脱脂乳粉于容量瓶中，用超纯水溶解均匀，配成不同浓度的脱脂乳粉溶液。高压灭菌，备用。

D-山梨醇：在容量瓶中称取不同克的脱脂奶粉，用超纯水均匀溶解，并制备不同浓度的D-山梨糖醇溶液。高压灭菌，备用。

甘油：用量筒量取不同毫升甘油，用超纯水混合均匀，配成不同浓度的甘油。高压灭菌，备用。

5％乳糖溶液：称取5克乳糖，用超纯水定容至100mL，高压灭菌，备用。

主要仪器如下表所示

1.1确定所述直投式乳酸菌发酵剂的保护剂所述直投式乳酸菌保护剂的筛选过程如下述说明：称取一定量的脱脂乳粉、海藻糖、D-山梨醇和甘油分别装入不同的蓝口瓶中进行高压灭菌。分别以不同的比例进行添加，检测冻干前后细胞的存活率，得到每种保护剂的最佳剂量，保护剂/菌泥(体积/质量)为3:1的比例添加。

(1)脱脂乳粉的影响：

脱脂乳粉的保护作用机理是：当冻干时，脱脂乳中的乳清蛋白可在细菌外形成一层蛋白质膜，以防止细胞壁破裂时细胞内物质的泄漏。同时，脱脂乳中的乳糖也起到保护细菌的作用。由于脱脂奶粉含有丰富的蛋白质，它可以为细胞提供保护壳，稳定细胞膜结构，有利于细胞复水作用的特性。脱脂奶粉是最广泛使用的保护剂之一，因为它价格实惠且易于购买。本实验中使用脱脂乳作为保护剂来观察不同浓度的脱脂乳对细胞的保护作用。

附图1示意了不同浓度的脱脂乳对菌剂存活率的影响。从图1可以看出，在适当的浓度范围内，随着脱脂乳浓度的增加，乳酸菌的存活率显着增加，表明脱脂乳的保护效果更好。从图中的数据来看，当脱脂奶粉浓度为10％时，细胞活力可达49.67％，当脱脂奶浓度超过10％时，细菌的存活率呈下降趋势，导致此结果的原因可能是当脱脂奶粉的浓度增加时，保护剂中的固体含量增加，再加上脱脂乳溶液本身的粘度相对较大，不利于冷冻干燥过程中水的升华挥发，导致冷冻干燥时间延长，使得细胞在过长的冻干过程中受到较大损害，导致细菌死亡率上升。综上所述，最初确定10％的脱脂奶粉是最佳浓度。

(2)海藻糖的影响：

关于海藻糖对细胞的保护机制有两种假说，分别是水替代假说和玻璃状态假说。水替代假说认为一层水膜包围保护着生物体中的碳水化合物、脂肪、蛋白质和其他大分子物质，这层薄薄的水膜起着维持其结构和功能特性的作用。在冷冻干燥过程中，这层水膜逐渐被除去，导致这些大分子物质发生不可逆变化，海藻糖可在干燥生物分子的失水部位以羟基和分子形成氢键，取代了由水形成的氢键，这使得分子在缺水条件下仍保持其原有结构，而不丧失活性。玻璃态假说认为当干燥时海藻糖紧密地包住相邻近的分子，形成一种碳水化合物玻璃体，这种非晶体结构的扩散系数很低，能够使生物分子维持一定的空间结构。

附图2示意了不同浓度的海藻糖对菌剂存活率的影响。从图2可知，设定不同浓度的海藻糖进行实验，得到不同数值的菌体存活率。如果海藻糖浓度高或低，保护效果将大大降低。当加入的海藻糖量为2％时，植物乳杆菌ZJ316的冻干存活率达到最大值64.00％。所以，初步确定海藻糖的最佳浓度为2％。

(3)甘油的影响：

当冷冻保存菌株时，甘油充当保护剂和防冻剂，以防止由于水的冷冻或升华而对细胞造成损害。在冷冻干燥过程中，由于甘油有多个氢键细胞膜中的磷酸基团或细菌蛋白质的极性基团与羟基形成氢键，以保护细胞膜的完整性和蛋白质结构和功能。

附图3示意了不同浓度的甘油对于菌剂存活率的影响。从图3中可以看出，甘油的浓度对细胞的存活率具有显着影响。当甘油浓度为1％时，细胞的存活率最高，由此初步确定甘油的最佳浓度为1％。

(4)山梨糖醇的影响：

D-山梨糖醇具有良好的保护作用，因为其结构中具有多个羟基，并且在冻干过程中水分子可被羟基取代，细胞膜中的磷酸基团或细菌蛋白质的极性基团与羟基形成氢键，以保护细胞膜的完整性和蛋白质结构和功能。

附图4中示意了不同浓度的D-山梨糖醇对于菌剂存活率的影响。从图4可知，细胞存活率在不同浓度下的D-山梨醇有所差异。D-山梨醇的浓度为1％，2％， 3％和4％所对应的菌体存活率分别为21.33％，30.00％，36.67％和25.33％。该结果的原因是过高的D-山梨糖醇浓度加速了细胞内蛋白质的聚合，形成玻璃化结构不利于复水。根据本发明的一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的保护剂可以是：10％的脱脂奶粉；或者是2％的海藻糖；或者是1％的甘油；或者是3％的甘油。进一步地，使用高效保护剂是通过真空冷冻干燥技术制备活性微生物剂的关键。单独使用单一保护剂不足以减轻真空冷冻干燥过程中细胞受到的损害。为了制备更高活性的植物乳杆菌ZJ316菌剂。根据上述单因素四种保护剂脱脂奶粉，海藻糖，甘油和D-山梨醇，每个因子需要3个等级，设计L9(34)的正交试验表以选择保护剂的组合。因子水平表如表1所示，实验计划表如下表2 所示。

表1正交试验因素水平表

Table 1Factors and levels of orthogonal test

表2四因素三水平正交试验方案与结果

Table 2Result of orthogonal experiment

表3四因素三水平方差分析表

Table 3Four factors and three levels of variance analysis

因素	自由度	偏差平方和	F比	F临界值	显著性
						脱脂乳粉	2	1.489	2.947	4.46	*
海藻糖	2	0.073	0.144	4.46
						甘油	2	0.218	0.431	4.46
D-山梨醇	2	0.203	0.402	4.46
						误差	8	2.02

在正交试验中，样品存活率最高的组合是A₂B₁C₂D₃，即脱脂乳粉10％、海藻糖1.5％、甘油1％、D-山梨醇3.5％，样品的活菌数达1.5×10¹²CFU/g。

根据方差分析，四个因素对产品活菌数的影响是牛奶脱脂粉>甘油>D-山梨醇>甘油。单因素的最佳组合是A₂B₂C₂D₂，它没有出现在正交设计表中，但在实验过程中，有设计这组参数组合，所得样品的存活率达1.09×10¹²CFU/g。显然没有按照A₂B₁C₂D₃这一组合进行冷冻干燥所制得的样品活菌数高。根据本发明的一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的所述保护剂包括脱脂奶粉、海藻糖、甘油、D-山梨醇中的一个或者是多种。根据本发明的另一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的所述保护剂包括脱脂奶粉、海藻糖、甘油和D-山梨醇。

根据本发明的另一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的所述保护剂包括即脱脂奶粉10％，海藻糖1.5％甘油1％，D-山梨醇3.5％，样品的活菌数达1.5×10¹² CFU/g。根据范围分析，四种因素对产品活菌数的影响依次是脱脂奶粉，甘油，海藻糖，D-山梨糖醇。根据本发明的另一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的所述保护剂的脱脂奶粉：海藻糖：甘油：D-山梨醇的比例为10:1.5:1:3.5。

根据本发明的另一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的所述保护剂的脱脂奶粉：海藻糖：甘油：D-山梨醇的比例为8～12:1～2:0.5～1.5:3～4。根据本发明的另一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的所述保护剂的脱脂奶粉：海藻糖：甘油：D-山梨醇的比例为8:1:0.5:3。根据本发明的另一些实施例，所述直投式乳酸菌发酵剂的所述保护剂的脱脂奶粉：海藻糖：甘油：D-山梨醇的比例为12:2:1.5:4。

1.2所述直投式乳酸菌ZJ316发酵剂的复水活性

进一步地，通过如下步骤测试所述直投式乳酸菌ZJ316发酵剂的复水活性：使用生理盐水，5％乳糖，10％脱脂奶粉作为复水介质，以1：100(质量/体积) 的比例分别溶于复水介质中。在30℃下活化30min后，置于30℃培养箱中培养 24h，测量活细胞数。每个试验重复三次。

活化不仅可以将细菌从休眠状态转变为正常细胞，还可以修复在冷冻干燥过程中受损的细胞。它可以减少复水过程中水渗透到细胞中的影响，从而保持较高的活力。不同的复水介质对植物乳杆菌ZJ316冻干细胞的影响如表4所示。结果表明，10％脱脂乳培养基的活化效果最为理想，可以在较短的时间内恢复植物乳杆菌ZJ316的活力。

表4不同复水介质对细菌复水活性的影响

Table 4Influence of different rehydration media on bacteria activity

结论如下：通过再水化实验，真空冷冻干燥后的细胞具有良好的活性，相当于未冷冻干燥的细胞。

1.3所述直投式乳酸菌ZJ316发酵剂的储藏温度

进一步地，通过如下步骤测试所述直投式乳酸菌ZJ316发酵剂的储藏温度：将植物乳杆菌ZJ316发酵剂分别在室温(25℃)，4℃和-20℃下储存。分别在0d、 15d、30d后测定菌剂的活菌数，确定冻干细菌的最佳储存温度。在菌粉的保藏过程中，湿度、水分、温度等均会对保藏期产生一定的影响。

图5示出了贮藏天数对于乳酸菌数的影响。从图5中的实验结果可知，菌粉中菌株的活性在不同温度环境下有所不同。本实验分别选择在常温(25℃)、4℃和-20℃下进行储存，从整体上看，三种不同条件下对菌粉中活菌数影响不是很大，在4℃和-20℃下存活的粉末具有比室温更好的保存效果，活菌数在存储30 天后依旧保持在12次方以上。综合考虑，在-20℃下储存的菌粉活菌数更稳定。

结论如下：菌粉在4℃和-20℃的活菌数相比室温的保存效果更好，活菌数在储存30天后都依旧保持高活力，但显然在-20℃保藏时菌粉的活性最佳。综合考虑，-20℃为最佳储藏温度。

1.4所述直投式乳酸菌ZJ316发酵剂的急性毒性

进一步地，通过如下步骤测试所述直投式乳酸菌ZJ316发酵剂的急性毒性：使用体重为18-22g的20只健康ICR小鼠，半雄性和半雌性。实验动物使用许可证号为SYXK(浙江)2011-0166。实验动物饲料由浙江省实验动物中心提供，实施标准为GB14924-2010。检测环境条件，温度范围为20℃至25℃，相对湿度范围为40％至70％。在测试之前，将实验动物在动物房环境中适应3天。按限量法设20.0g/kg体重一个剂量组。称取样品20g用1％羧甲基纤维素钠配置成 40mL悬浮液备用，小鼠灌胃前禁食(不禁水)6h，按0.2mL/10g体重灌胃容量灌胃给予受试物，灌胃一次。小鼠灌胃给受试物后自由进食，饮水。连续给药 14天后，观察并记录小鼠的一般状况、中毒表现和死亡，并在实验的开始和结束时记录小鼠的体重。

在毒性试验期间，雌性小鼠的平均初始体重为19.7±1.0g，最终体重为27.8±1.0g。雄性小鼠平均初始体重为19.8±1.0g，终期体重为30.5±1.4g，体重明显有变化，且雄性体重增加的更加明显，雌雄小鼠在实验期间均未出现中毒表现，也无死亡的情况。植物乳杆菌ZJ316对雄性和雌性小鼠的口服毒性耐受剂量大于20.0 g/kg BW，小鼠体重示于表5中。

表5植物乳杆菌ZJ316急性经口毒性试验小鼠死亡情况

Table 5Acute oral toxicity test of L.plantarum ZJ316 in mice

植物乳杆菌ZJ316发酵剂根据“食品安全国家急性口服毒性试验”测试结果表明：雄性和雌性小鼠的急性毒性LD₅₀大于20.0g/Kg体重。根据急性毒性(LD₅₀) 剂量分类的分类，植物乳杆菌ZJ316属实际无毒。

二、用于制备所述直投式发酵剂的所述植物乳杆菌ZJ316

用于制备所述直投式发酵剂的所述乳酸菌ZJ316本身具有优异的特性，在发酵过程中，乳酸菌ZJ316本身能够抑制硝酸盐的生成并且具有抑菌作用，并且还适用于大规模的生产。

2.1相关的用品和测试方法

2.1.1实验相关的试剂用品和设备如下所示：

实验主要菌种

主要仪器

鲜菜头：余姚市铜钱桥食品菜业有限公司提供。

亚铁氰化钾溶液：称取106.0g亚铁氰化钾，用超纯水定容至1000mL。

乙酸锌溶液：称取220.0g乙酸锌，先加30mL冰醋酸，用超纯水稀释至1000 mL。

饱和硼砂溶液：称取5.0g硼酸钠，溶于100mL热水中，冷却后备用。

对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL 20％(V/V) 盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存。

盐酸萘乙二胺溶液：称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶于100mL水中,混匀后，置棕色瓶中，避光保存。

亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.1000g干燥恒重的亚硝酸钠，加超纯水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

亚硝酸钠标准使用液：使用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL，置于200mL 容量瓶中，加水稀释至刻度。

2.1.2相关的测试方法如下：

(1)菌种活化：将20％甘油保藏于-80℃冰箱的菌种，划线于相应的固体培养基上，在适宜温度下培养至出现明显单菌落，接种单菌落体于相应液体培养基，置于适宜培养条件下培养，连续传代两次。

(2)亚硝酸盐测试方法：参照国标GB 5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法。称取5g制成匀浆的试样，置于50mL烧杯中，加12.5mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300mL将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温，加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL，滤液备用。

测定时吸取40.0mL上述滤液于50mL带塞比色管中，另吸取0.00mL、0.20 mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.0mL、2.50mL亚硝酸钠标准使用液(相当于0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、 10.0μg、12.5μg亚硝酸钠)，分别置于50mL带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液,混匀，静置3min～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。

(3)降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选：将活化好的乳酸菌接到MRS液体种子培养基中活化18h后，以3％的接种量接入MRS培养基中(50mL培养基/250mL 三角瓶)，30℃静置培养48h，用1mol/L氢氧化钠将培养基pH调至6.0，加入事先配制好的无菌NaNO₂标准液使得培养基中最终含量为125μg/mL，37℃避光静置24h，测定培养液中NaNO₂含量，空白试验组以无菌水接种。每个试验重复三次。

亚硝酸盐降解率计算公式：亚硝酸盐降解率＝(对照组亚硝酸盐含量-处理组亚硝酸盐含量)/对照组亚硝酸盐含量×100％

(4)接种量的确定方法：将L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316分别以1％、2％、3％、4％、5％的接种量接入到10mL榨菜汁培养基中，30℃培养24h后测定活菌数。每个试验重复三次。

(5)菌株生长曲线和产酸特征特定：将L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316按体积分数为3％、4％、3％的接种量接种于10mL 榨菜汁培养基，30℃培养，每隔6h测定菌体生长的OD₆₀₀值，并测定pH值及产酸率。

细胞浓度测定(光密度法)：用尤尼柯2000可见分光光度计测定。

产酸率：乳酸(％)＝(N_NaOHV_NaOH×0.09/V_样品)×100

乳酸菌在榨菜汁培养基中对于亚硝酸盐的降解率：在含NaNO₂(125μg/mL) 的榨菜汁培养基中按体积分数为3％、4％、3％的接种量接种培养菌株L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316每隔12h测定亚硝酸盐降解率。以灭菌未培养的榨菜汁培养基中添加NaNO₂为对照。每个试验重复三次。

(6)菌株在榨菜汁培养基上挥发性风味物质的测定

样品处理：将L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM 228和L.plantarum ZJ316分别按体积分数为3％、4％、3％的接种量接种于10mL榨菜汁培养基，置于最适条件下培养24h。培养结束装入15mL顶空进样瓶中，将顶空进样瓶放到50℃水浴锅内加热30min，备用。

萃取头老化方法：

1)点击软件左上角的菜单“方法(M)”，选择“固相微萃取老化.M”，此时软件最上方显示的方法名称就是“固相微萃取老化”，将萃取手柄上的刻度调到 4，点击气质软件上方偏左位置的绿色箭头，打开样品信息输入窗口，输入数据文件名称如“老化-月-日”。

2)然后点击窗口下方的“确定并运行方法”按钮，等待15s，气质软件出现“GC采集”对话框，上面有一个“开始运行”的按钮，将萃取手柄前端的针垂直插入气质的进样口，然后马上按下黑色推杆，伸出萃取头，然后按下气质仪器面板上的“Start”按键，开始运行老化程序。

3)30min后，将萃取手柄上部的黑色推杆向上收回，收回萃取头，然后拔出萃取手柄放在桌上。气质上的老化程序运行40min。

进样方法：

1)萃取头进行老化后，点击软件左上角的菜单“方法(M)”，选择“固相微萃取.M”，此时软件最上方显示的方法名称就是“固相微萃取”，然后就可以正常做样了。

2)30min后，转动萃取手柄的黑色套管，将刻度调到1，然后将萃取手柄前端的针插入顶空进样瓶瓶盖，按下萃取手柄上部的黑色推杆，伸出萃取头，略微转动卡在卡槽处，然后用铁架台把萃取手柄固定，萃取30min。

3)到时间后，点击气质软件左上方的绿色箭头，打开样品信息输入窗口，输入数据文件名称，然后点击窗口下方的“确定并运行方法”按钮。松开铁架台的固定，将萃取手柄上部的黑色推杆向上收回，收回萃取头，拔出萃取手柄。如果萃取手柄上有凝结的水珠，用纸巾擦干。

4)将萃取手柄上的刻度调到4。此时气质软件上应该已经出现一个叫“GC 采集”的对话框，上面有一个“开始运行”的按钮。在插入进样口之前，需先确认软件左侧显示的柱箱温度是35℃，左上方“仪器状态”下面是绿色条带，上面显示“就绪”，这说明仪器已经准备好可以进样了。

GC-MS分析条件：7890A/5975GC/MS联用仪，色谱柱:HP-5MS型(30m ×0.250mm×0.25μm)；载气：氦气；进样温度：230℃；进样量：1μL；升温程序：初温45℃保持2min，5℃/min上升至180℃，保持1min，25℃/min升到230℃，保持5.5min。

数据处理：由计算机质谱系统NSIT检索未知化合物，匹配度大于70％的结果将予以报告，面积归一法计算各成分的含量。

(7)植物乳杆菌ZJ316的亚硝酸盐耐受性

将L.plantarum ZJ316接种于0-10mg/mL的NaNO₂培养基中，30℃培养12h，测定OD₆₀₀nm。

(8)牛津杯法抑菌圈牛津杯法，又称管碟法，是国际上通用的用来测定抗生素效价的方法，也是很多国家药典所规定的方法。牛津杯法显示的抑菌圈大小来测定抑菌物质对指示菌的作用效果。实验操作如下：

实验操作如下：

1)将抑菌实验的指示菌按照2.3.1中的方法进行活化。充分加热融化已灭菌的半固体培养基，轻轻振荡混匀，并置于55℃水浴锅内平衡温度防止凝固。

2)将灭过菌的牛津杯按照适宜间隔放置于一次性培养皿上。

3)将活化的指示菌按照1％的接菌量接种于15mL半固体培养基中，充分混匀后倒入培养皿中，轻轻混匀，使半固体培养基均匀覆盖培养皿表面，注意不要将培养基倒入牛津杯中。

4)待半固体培养基充分凝固后，用灭菌的镊子将牛津杯拔出，此时则会在半固体培养皿上形成的圆柱形孔洞。

5)在每个圆柱形孔洞中加入80μL待测样品(LZ227、ZFM228、ZJ316的发酵液上清)，放置平板于4℃冰箱3h，使样品充分扩散。然后按照指示菌的最适培养条件于培养箱中培养，直至出现明显的抑菌圈。

(9)孔板抑菌试验：

1)将抑菌实验的指示菌按照2.3.1中的方法进行活化。

2)将活化的指示菌按照1％的接菌量接种于10mL液体培养基(LB)中，充分混匀。

3)取植物乳杆菌ZJ316培养24h后发酵上清20μL加入96孔板中，然后加入180μL混匀好的指示菌。对照组加MRS液体培养基。每个试验设置三个平行。

4)将加好的96孔板置于指示菌的最适培养条件于培养箱中培养。10h后用酶标仪测定吸光度。

2.2植物乳杆菌ZJ316对于亚硝酸盐的降解能力

测试植物乳杆菌ZJ316的降解能力的步骤如下所示，首先进行菌种活化，将 20％甘油保藏于-80℃冰箱的菌种，划线于相应的固体培养基上，在适宜温度下培养至出现明显单菌落，接种单菌落体于相应液体培养基，置于适宜培养条件下培养，连续传代两次。

然后将活化好的乳酸菌接到MRS液体种子培养基中活化18h后，以3％的接种量接入MRS培养基中(50mL培养基/250mL三角瓶)，30℃静置培养48h，用1mol/L氢氧化钠将培养基pH调至6.0，加入事先配制好的无菌NaNO₂标准液使得培养基中最终含量为125μg/mL，37℃避光静置24h，测定培养液中NaNO₂含量，空白试验组以无菌水接种。每个试验重复三次。

参照国标GB 5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法对于亚硝酸盐进行测试。可以是如下的步骤：

称取5g制成匀浆的试样，置于50mL烧杯中，加12.5mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300mL将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温，加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置 30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL，滤液备用。

分别取准确吸取0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00，2.50mL 亚硝酸钠标准使用液(0，1，2，3，4，5，7.5，10，12.5μg亚硝酸钠)，共9 个亚硝酸盐浓度，绘制亚硝酸盐标准曲线。获得的线性方程式为 y＝0.0241x+0.0001(R²＝0.9999)，如图6所示。该标准曲线线性良好，可用于测定亚硝酸盐含量。

表6菌株发酵液中亚硝酸盐降解率 Table 6Nitrite degradation ability ofdifferent lactic acid bacterium strains

结合亚硝酸盐标准曲线方程求得各菌株的亚硝酸盐降解率，其降解亚硝酸盐能力具体结果见表6。结果表明，对初始含量为125μg/mL的亚硝酸盐降解率在 90％以上的菌株有5株，降解率在80％～90％之间的菌株有2株，降解率在70％～80％和60％～70％之间的菌株各有1株。L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和 L.plantarum ZJ316对亚硝酸盐降解率达到了93％以上，NaNO₂残留量(μg/mL) 分别为8.2750、8.6875和4.1375，表现出了强降解亚硝酸盐的能力。

2.3降亚硝酸盐乳酸菌的发酵特性

(1)生长速率

从图7、图8、图9中可以看出三株乳酸菌L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316的生长规律。其中，L.plantarum LZ227在0-4h 生长较为缓慢，4-12h进入对数生长期，在此阶段进行种子取样，接种到MRS 液体培养基，14-32h为稳定生长期；L.plantarum ZFM228在0-4h缓慢生长， 4-10h迅速生长，进入对数生长期，此时取种子接种到MRS液体培养基，18-26 h菌株处于稳定期；L.plantarum ZJ316在0-2h缓慢生长，2-10h迅速生长，进入对数生长期，在此期间进行种子取样，接种到MRS液体培养基，16-30h菌株处于稳定期。

(2)接种量

活化相关的乳酸菌。分别以1％、2％、3％、4％、5％接种量接入到榨菜汁培养基中，培养24h后测定活菌数，结果如图10。从图10可知不同接种量对乳酸菌的生长产生不同的影响，接种量较少时，培养基中营养物质成分充足，乳酸菌可以大量生长；随着接种量的增加，培养基中的营养成分被充分利用，乳酸菌数量增加；当接种量过高，虽然前期乳酸菌生长迅速，但后期乳酸菌因营养缺乏而导致部分菌体死亡。三株菌种的最适接种量:L.plantarumLZ227为3％，L. plantarum ZFM228为4％，L.plantarum ZJ316为3％。

(3)在榨菜汁培养基上的生长曲线和产酸特性

由图11可知，乳酸菌L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L. plantarumZJ316都能够很好地适应榨菜发酵环境，在榨菜汁培养基中生长良好，其中以L.plantarumZJ316生长情况最好。在榨菜发酵过程中，主导发酵的乳酸菌会分泌乳酸、乙酸等有机酸，在赋予榨菜产品独特风味的同时，导致环境pH 的下降，抑制了好氧杂菌的生长，这对保证榨菜的安全性至关重要。所以考察了 L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316利用榨菜汁培养基发酵产酸的情况，来衡量乳酸菌发酵性能。由图12和图13可知3株乳酸菌均能利用榨菜汁培养基产酸，L.plantarum ZJ316在榨菜汁培养基中产酸速度最快，培养至24h发酵液的pH下降至4.10，可滴定酸度达到0.143％，培养24h后低 pH可能参与亚硝酸盐的降解。

(4)在榨菜汁培养基上对亚硝酸盐的降解率

乳酸菌L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316在榨菜汁培养基上对亚硝酸盐的降解率的结果见图14。L.plantarum LZ227、L. plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316经过36h的培养，亚硝酸盐降解率达到 80％以上，72h亚硝酸盐降解率分别为90.3％、89.6％和95.23％，其中L.plantarum ZJ316表现最强的降解亚硝酸能力，且降解速度较快。

(5)榨菜汁挥发性风味物质的测定

经顶空固相微萃取后进行GC-MS分析，挥发性风味物质的相对含量见表7。从表中可以看出，共检测出54种物质，其中醇类17种、酸类7种、酯类7种、酮类7种、醛类4种、硫醚类3种、腈类2种、含芳香化合物3种、烷类4种。其中乳酸菌L.plantarum LZ227、L.plantarumZFM228和L.plantarum ZJ316接种组含量均较高的物质有：乙酸、辛酸、月桂酸、含硫化合物、甘油芥酸酯，这些物质应为榨菜的主要风味成分。对照组共检测出18种物质，其中醇类3种、酯类2种、酮类2种、醛类3种、腈类2种、芳香化合物2种、烷类4种。L.plantarum LZ227接种组共检测出27种物质，其中醇类9种、酸类6种、酯类1种、酮类 4种、醛类2种、硫醚类3种、腈类2种、芳香化合物1种、烷类1种。L.plantarum ZFM228接种组共检出31种物质，其中醇类8种、酸类5种、酯类5种、酮类3 种、醛类4种、硫醚类3种、腈类2种、芳香化合物1种。L.plantarum ZJ316 接种组共检出34种物质其中醇类11种、酸类6种、酯类4种、酮类3种、醛类 2种、硫醚类3种、腈类2种、芳香化合物3种。乳酸菌L.plantarum LZ227、 L.plantarumZFM228和L.plantarum ZJ316接种组中，醇类化合物、酸类化合物和酮类化合物明显高于对照组。醇类、酸类和酮类是榨菜风味的主要影响化合物，有机酸与不同醇类物质相结合生成不同酯类物质，赋予了蔬菜发酵制品独特的复合香味；而酮类物质会使榨菜具有清香味。另一方面，感官嗅觉分析也清楚地感觉到乳酸菌L.plantarum LZ227、L.plantarum ZFM228和L.plantarum ZJ316接种组在香气香味上要比对照组强。而L.plantarum ZJ316醇类含量与酸类含量优于菌L.plantarum LZ227和L.plantarum ZFM228。

表7乳酸菌发酵榨菜汁挥发性风味成分表

Table 7Volatile flavor components of mustard juice medium

注：“—”表示未检测出此物质。

2.4植物乳杆菌ZJ316亚硝酸盐的耐受性

考察了L.plantarum ZJ316在不同亚硝酸盐浓度的耐受性，结果见图15。L.plantarum ZJ316在亚硝酸盐浓度3.2mg/mL时，乳酸菌仍能正常生长；当亚硝酸盐浓度达到3.6mg/mL时，乳酸菌生长量明显降低；当浓度为4.8mg/mL时，其生长受到严重抑制；亚硝酸盐浓度大于8.4mg/mL时，几乎不生长。由此得出 L.plantarum ZJ316最适的亚硝酸盐浓度为0～3.2mg/mL。

2.5植物乳杆菌ZJ316的抑菌作用

由于榨菜腌制过程中容易受到有害微生物的污染，如金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和单增李斯特菌等影响。选取金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1、副溶血球菌SCF16作为敏感指示菌，通过牛津杯法和96孔板法进行抑菌作用的研究。按照牛津杯抑菌圈法研究其对榨菜中可能出现的致病菌的抑菌作用。从图16A、16B和16C的结果发现，植物乳杆菌ZJ316对金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1和副溶血球菌SCF16均有一定的抑菌效果。利用96孔板继续研究L.plantarum ZJ316的抑菌作用。图16A为植物乳杆菌ZJ316对金黄色葡萄球菌ATCC 25923，图16B为植物乳杆菌ZJ316对单增李斯特氏菌LM1，图16C为植物乳杆菌ZJ316对副溶血性弧菌SCF16。

按照上述的96孔板抑菌实验方法，得到的结果如图17至图19所示。发现当L.plantarum ZJ316发酵液上清的加样量20μL时，会抑制金黄色葡萄球菌 ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1和副溶血性弧菌SCF16的生长，尤其对金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌抑菌效果明显。当加大植物乳杆菌ZJ316的发酵上清加样量为50μL，副溶血性弧菌SCF16和金黄色葡萄球菌ATCC 25923的生长严重受到抑制，而单增李斯特氏菌LM1几乎不生长。可以得出L.plantarum ZJ316 对榨菜中潜在的致病菌具有明显的抑菌作用。图17、图18和图19分别为植物乳杆菌ZJ316对金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌LM1、副溶血性弧菌SCF16的抗菌效果。

通过上述的实验可知，植物乳杆菌ZJ316本身具有较强的亚硝酸盐降解能力，在榨菜培养基中表现出了较强的产酸能力，并且产酸速度强于其他类型的乳酸菌。进一步地，植物乳杆菌ZJ316在发酵过程中可以产生大量的醇类化合物和酸类化合物，并且产生的数量强于其他的乳酸菌，以赋予榨菜优良的发酵风味。进一步地，植物乳杆菌ZJ316对于亚硝酸盐具有一定的耐受性和能够抑制榨菜中潜在的致病菌。

值得一提的是，植物乳杆菌ZJ316适于应用于工业化的生产。

2.6植物乳杆菌ZJ316耐渗透压性能

植物乳杆菌ZJ316的耐渗透压性能测试可以通过如下的步骤进行：

将-80℃冻存的植物乳杆菌ZJ316于MRS固体平板划线接种，37℃厌氧培养 24h复苏，经两次传代活化后转接MRS液体，过夜培养菌液16-18小时，以6000 r/min离心10分钟，弃去发酵上清液，菌泥用无菌生理盐水(0.85％)洗涤两次后，用等体积的无菌生理盐水缓冲液重悬。

菌株液体培养16-18h后，4℃，6000r/min离心10min，菌泥用无菌生理盐水(0.85％)洗涤两次后，用等体积的灭菌生理盐水重悬。取重悬后的菌体悬浮液100μL接种于含不同浓度NaCl的MRS培养基中，37℃培养24h后，无菌情况下取培养液50μL，用无菌水梯度稀释，于MRS固体培养基平板上涂布，37℃培养至菌落明显出现，准确计数，每组做三个平行，以未加NaCl的MRS培养基培养的菌株作对照。

在上述步骤中，MRS液体培养基的配制如下：准确称取10g蛋白胨，5g 酵母提取物，20g无水葡萄糖，10g牛肉膏，2g磷酸氢二钾，2g柠檬酸氢二铵， 5g乙酸钠，0.2g七水硫酸镁，0.05g硫酸锰，1mL吐温-80，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。

MRS固体培养基的配制如下：在MRS液体培养基配方的基础上加入1％-1.5％的琼脂，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。

含3％、6％、8％NaCl MRS培养基配制如下：在普通MRS液体培养基配方的基础上分别加入30g、60g和80g NaCl，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。

耐高渗透压性能是乳酸菌株能否在商业中应用的先决条件之一。发酵过程中菌株产生乳酸，增加细胞的渗透压，将游离酸转化为盐，可防止体系中pH过度降低。由图20可知，植物乳杆菌ZJ316在NaCl浓度为3％，6％和8％时存活率分别为89.03％，69.53％和18.44％，表明植物乳杆菌ZJ316可以在高渗透压环境下可存活，且存活率较高，此结果与Masuda等人报道的大多数LAB菌株耐渗透压性能相似。

2.7植物乳杆菌ZJ316耐乙醇性能

植物乳杆菌ZJ316的耐乙醇性能测试可以通过如下的步骤进行：

菌株液体培养16-18h后，4℃，6000r/min离心10min，菌泥用无菌生理盐水(0.85％)洗涤两次后，用等体积的无菌生理盐水(0.85％)重悬。取重悬后的菌体悬浮液100μL接种于乙醇浓度分别为2.5％，5％，7.5％，10％的MRS液体培养基中，37℃培养箱培养24h，无菌情况下取培养液50μL，用无菌水梯度稀释，于MRS固体培养基平板上涂布，37℃培养至菌落明显出现，准确计数，每组做三个平行，以未加乙醇的MRS培养基培养的菌株作对照。

含2.5％、5％、7.5％、10％和12.5％乙醇(98％)MRS液体培养基配制如下：于灭菌后的普通MRS培养基中分别加入25mL、50mL、75mL、100mL和125 mL乙醇(98％)可得到相应浓度的乙醇MRS培养基。

在工业发酵和食品加工过程中，细菌必须克服各种物理和化学屏障，才能发挥其作用，与耐高渗透压相似，乳酸菌对乙醇的耐受性也经常作为评价其在工业应用中的指标之一。如图21所示，随着乙醇浓度的增大，植物乳杆菌ZJ316的存活率逐渐降低，当乙醇浓度为5％时，植物乳杆菌ZJ316的存活率高达71％，当乙醇浓度为10％时，植物乳杆菌ZJ316的存活率依然保持在40％左右，由此说明，植物乳杆菌ZJ316的乙醇耐受性能良好。而Masuda等人研究发现大多数 LAB菌株当乙醇浓度大于5％时，其耐受性极差，存活率很低。

本领域的技术人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。

Claims

1.一直投式乳酸菌发酵剂在榨菜腌制中的应用，其特征在于，所述直投式乳酸菌发酵剂应用植物乳杆菌ZJ316制备，其中所述植物乳杆菌的保藏编号为CCTCC No：M 208077；

所述直投式乳酸菌发酵剂包括所述植物乳杆菌ZJ316和保护剂，其中所述保护剂是10%浓度脱脂奶粉；或者所述保护剂是2%浓度的海藻糖；或者所述保护剂是1%浓度的甘油；或者所述保护剂是3%浓度的D-山梨醇；或，所述保护剂由脱脂奶粉、海藻糖、甘油和D-山梨醇组成，其中脱脂奶粉：海藻糖：甘油：D-山梨醇的浓度比例为8~12:1~2:0.5~1.5:3~4；

所述直投式乳酸菌发酵剂经过冷冻干燥处理，所述直投式乳酸菌发酵剂的干燥条件为主冻干隔板温度-5摄氏度，冻干14 h。

2.根据权利要求1所述的应用，进一步包括如下步骤：

保藏所述直投式乳酸菌发酵剂于-20℃环境。

3.根据权利要求1所述的应用，其中在所述冷冻干燥获得直投式乳酸菌发酵剂之前对于所述植物乳杆菌菌体和所述保护剂进行预冻。

4.根据权利要求3所述的应用，其中在-80摄氏度的条件下预冻12h。

5. 根据权利要求1所述的应用，其中在所述冷冻干燥步骤中的干燥阶段隔板温度为5摄氏度，干燥10 h，真空度为0.01 mbar。

6.根据权利要求1所述的应用，其中所述植物乳杆菌ZJ316保存在-80摄氏度。

7.根据权利要求1所述的应用，其中所述植物乳杆菌ZJ316在固体培养基上培养至出现明显单菌落，然后接种单菌落体于液体培养基以培养。

8. 根据权利要求7所述的应用，其中所述植物乳杆菌ZJ316在液体培养基内于30摄氏度下培养24 h。