CN105543141A - 一种降胆固醇菌制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

一种降胆固醇菌制剂及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种菌制剂，由植物乳杆菌(Lactobacillus？plantarum？subsp.plantarum)CICC？NO.6240I4和保护剂组成，保护剂可有效提高菌制剂冻干剂中植物乳杆菌的存活率。该菌制剂可降低胆固醇，经添加保护剂后的植物乳杆菌冻干剂降低胆固醇的效果，与未经冻干的植物乳杆菌活菌降低胆固醇的效果相当。

Description

一种降胆固醇菌制剂及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种菌制剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着乳酸菌对人体健康有益作用机理的不断深入研究和揭示，乳酸菌产品越来越受到消费者的重视。菌制剂以及经菌制剂发酵得到的发酵乳制品的关注度不断得到提升，直投式菌制剂以及直投式酸奶发酵剂因其活力强、含菌量高、菌量稳定，保存期长、耐储运，使用方便，发酵产品稳定等优点而成为了市场热点与研发热点。作为提升发酵剂活力的关键工艺，冻干保护剂能有效防止细菌细胞死亡，保证活菌量和延长菌种保藏期。
目前乳酸菌菌制剂可采用真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等不同的方法进行制备，而其中真空冷冻干燥比较常用且有优势，其基本原理是热力学相平衡理论：即将欲保藏的微生物细胞悬浮液冻结后，在真空条件下使冰升华，最后达到干燥。该方法主要是根据微生物生理、生化特点，使微生物的代谢不活泼，生长繁殖受到抑制，达到休眠状态，以保特菌株原有特性。
真空冷冻干燥过程中影响乳酸菌发酵剂菌体存活率、发酵活力及贮藏稳定性的主要因素有:培养基、培养条件、收获期、起始细胞浓度、冻干保护剂介质、冷冻速度、干燥过程、水分活度、包装方式、保藏温度和复水条件等,其中冻干保护剂是最为关键的因素。由于不同的保护剂对不同菌种的保护效果不同,如果冻干工艺中保护剂选择不当,将导致菌体的存活率下降。
直投式发酵剂是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂菌种，可直接加入热处理的原料进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其他预处理工作。
发明内容
本发明提供了一种菌制剂，由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICCNO.6240和保护剂组成。
本发明所述植物乳杆菌CICCNO.6240，属于植物乳杆菌植物亚种，拉丁文名称为Lactobacillusplantarumsubsp.Plantarum，在本发明申请日前就是已知的生物材料。
本发明所述植物乳杆菌CICCNO.6240保藏于位于北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼的中国工业微生物菌种保藏管理中心(ChinaCenterofIndustrialCultureCollection,CICC)。此外，本发明所述的植物乳杆菌CICCNO.6240同时还保藏于其他的生物材料保藏中心，包括：保藏于中国科学院微生物研究所，保藏编号AS1.2437；保藏于日本微生物菌种保藏中心，保藏编号JCM1149；保藏于美国模式培养物集存库，保藏编号ATCC14917；德国微生物菌种保藏中心，保藏编号DSM20174；日本发酵研究所，保藏编号IFO15981。
本发明所述植物乳杆菌CICCNO.6240在本发明申请日前可以通过国内外商业渠道购买，如可向中国工业微生物菌种保藏管理中心(ChinaCenterofIndustrialCultureCollection,CICC)购买该菌株；向美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection，ATCC)等机构购买。
具体的，本发明提供了一种菌制剂，该菌制剂由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICCNO.6240和保护剂组成；
所述菌制剂的保护剂为海藻糖、谷氨酸钠、蔗糖和脱脂乳粉，以重量百分比计，每克菌制剂含有海藻糖4～4.1％、谷氨酸钠2.9～3％、蔗糖10～10.5％、脱脂乳粉14.5～15％；
所述菌制剂每克含有植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICC6240的活菌数为8×1012cfu/g～8.1×1012cfu/g。
优选的，以重量百分比计，本发明菌制剂每克含有海藻糖4.04％、谷氨酸钠2.9％、蔗糖10.38％、脱脂乳粉14.84％；每克菌制剂含有植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICCNO.6240的活菌数为8.08×1012cfu/g；
或者，优选的，以重量百分比计，本发明菌制剂每克含有海藻糖4.％、谷氨酸钠3％、蔗糖10％、脱脂乳粉15％，其中每克菌制剂含有植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICCNO.6240的活菌数为8.03×1012cfu/g。
本发明还提供落了上述优选菌制剂的制备方法，包括以下步骤：菌种活化，扩大培养，离心收集菌体，加保护剂，分装，预冻，真空冷冻干燥，从而得到所述发酵剂；其制备步骤还包括：对保护剂灭菌或除菌后，再加入菌体中。
具体的，上述优选菌制剂由以下步骤制备得到：
(1)取活化的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICC6240，接种到10mL液体培养基中,37℃下静置培养18h,经两次扩大培养得种子培养液；将种子培养液以4％的接种量接种增菌培养基中，37℃下静置培养18h；
(2)将菌液移入无菌离心管,以4000转/分钟的转速离心10min,弃上清液,用质量体积浓度为0.9％的无菌生理盐水洗涤沉淀菌体后,以4000转/分钟的转速离心10min,弃上清液，得乳酸菌菌泥；
(3)取海藻糖、蔗糖和谷氨酸钠，分别溶于蒸馏水，采用膜孔径为0.22μm的滤菌器除菌，得海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液；取脱脂乳粉，溶于蒸馏水，110℃下保温10分钟杀菌，得脱脂乳粉溶液；
(4)将步骤(2)制备得到的菌泥与步骤(3)制备的海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液、脱脂乳粉溶液混合，混匀，得菌悬液；
(5)取步骤(4)制备的菌悬液分装入菌带塞的玻璃瓶中,-70℃下预冻2h，在冻干条件为真空度5Pa、隔板加热温度20℃、冷阱温度-55℃的真空冻干机中冻干,冻干时间30h，得冻干菌制剂。
本发明所述的菌制剂，优选为冻干剂，如冻干粉、冻干粉针等。
此外，本发明还提供了所述菌制剂作为直投式发酵剂的用途；可用途乳制品等的发酵。
以及，本发明所述菌制剂用于制备降低胆固醇产品的用途；
同时，本发明还提供了使用所述菌制剂发酵得到的发酵产品，以及该发酵产品制备降低胆固醇产品的用途；所述发酵产品包括发酵的乳制品。
本发明还提供了一种菌制剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)取活化的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICCNO.6240接种到10mL液体培养基中,37℃下静置培养18h,经两次扩大培养得种子培养液；将种子培养液以4％的接种量接种增菌培养基中，37℃下静置培养18h；
(2)将菌液移入无菌离心管,以4000转/分钟的转速离心10min,弃上清液,用质量体积浓度为0.9％的无菌生理盐水洗涤沉淀菌体后,以4000转/分钟的转速离心10min,弃上清液，得乳酸菌菌泥；
(3)制备保护剂溶液：分别称取海藻糖4.04g、蔗糖10.38g、谷氨酸钠2.9g，分别在40℃下溶于10ml蒸馏水中，吸入5ml注射器，采用膜孔径为0.22μm的滤菌器除菌，将10ml过滤除菌的海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液，分别注入90ml无菌水中，得到4.04％海藻糖溶液，2.9％谷氨酸钠溶液，10.38％蔗糖溶液，备用；取脱脂乳粉14.84g，溶于100ml蒸馏水中，得14.84％脱脂乳粉溶液，110℃灭菌，备用；
(4)取步骤(2)制备得到的菌泥与步骤(3)制备的海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液、脱脂乳粉溶液，将1g菌泥与5ml海藻糖溶液、5ml蔗糖溶液、5ml谷氨酸钠溶液和5ml脱脂乳粉溶液一起混合，搅拌均匀，得菌悬液；
(5)取步骤(4)制备的菌悬液分装入菌带塞的玻璃瓶中,-70℃下预冻2h，在冻干条件为真空度5Pa、隔板加热温度20℃、冷阱温度-55℃的真空冻干机中冻干,冻干时间30h，得冻干菌制剂。其中，步骤(1)所述的接种量是指是指菌液体积与培养基培养液的体积比。
本发明菌制剂，优选为冻干菌制剂，由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICCNO.6240和保护剂组成，所述保护剂组分包括海藻糖、蔗糖、谷氨酸钠和脱脂乳粉。保护剂组成按照本发明特定比例配伍后，有效增强了对植物乳杆菌CICCNO.6240的保护作用，较选用其他保护剂组方成分、或其他配比比例，明显提高了植物乳杆菌CICCNO.6240的存活率和降低胆固醇的能力。本发明保护剂组方对植物乳杆菌CICCNO.6240的保护作用，具有协同增效的作用，有效提高了经冻干工艺所得冻干菌制剂的活菌存活率，并维持了冻干菌制剂降胆固醇的活性，使植物乳杆菌CICCNO.6240冻干后降胆固醇的效果与植物乳杆菌CICCNO.6240冻干前降低胆固醇的效果相当。
本发明提供了一种植物乳杆菌CICCNO.6240的专属冻干保护剂配方，该保护剂配方各组分按本发明的特定比例配伍，协同增效的增强了对植物乳杆菌CICCNO.6240存活率和活性的保护效力，有效避免了冻干过程对菌株存活率的降低作用，使并维持了冻干菌制剂降胆固醇的活性，使植物乳杆菌冻干后降低胆固醇的效果与冻干前降低胆固醇的效果相当，在提高冻干粉中菌株活性的同时大大降低了发生产成本。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想的前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或者变更。
以下以实施例形式的具体实施方法，对本发明的上述内容在做进一步的详细说明，但不应理解为下述实施例用于限定本发明的保护范围。
具体实施方法
1、本发明实验仪器和实验材料。
1.1实验仪器
UV-2600A型紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)；自动台式灭菌锅(山东新华医疗器械股份有限公司)；微孔过滤器及滤膜(0.22μm)；HetoLyolab3000冻干机(上海汇分电子科技有限公司)
1.2实验材料
蔗糖(成都市科龙化工试剂厂)；海藻糖(河南豫兴生物科技有限公司)；脱脂乳粉(郑州市伟丰生物科技有限公司)；谷氨酸钠(河南凯成化工产品有限公司)；甘露醇(上海陆安生物科技有限公司)；菌种：植物乳杆菌CICCNO.6240，保藏于位于北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼的中国工业微生物菌种保藏管理中心(ChinaCenterofIndustrialCultureCollection,CICC)。
实施例一、植物乳杆菌CICCNO.6240菌泥的制备
(1)菌体的富集培养
取植物乳杆菌CICCNO.6240菌粉，接种到10ml本领域常规的液体培养基中活化,37℃下静置培养18h,经两次活化培养得种子培养液。将种子液以4％的接种量接种到100ml增菌培养基中，37℃下静置培养18h。接种量指种子培养液与培养基的体积比。
(2)菌体的收集
当发酵进行至对数期后期,将菌液移入无菌离心管中,,4000r/min离心10min,弃上清液,用无菌0.9％生理盐水洗涤沉淀菌体,再以同样的条件离心10min,弃上清液即得植物乳杆菌CICCNO.6240菌泥。
将菌泥/菌泥混悬液平均分为10份。
实施例二、冻干菌制剂的制备
(1)首先，配制保护剂各组分的溶液。按照表一记载的保护剂配方和比例，分别取海藻糖、谷氨酸钠、蔗糖，甘露醇，以蒸馏水为溶剂制备溶液，采用膜孔径为0.22μm的滤菌器除菌，分装在灭菌的带塞玻璃瓶中，经培养检验确认无菌后冷藏备用，可根据需要进一步稀释；按照表一记载的保护剂配方和比例，取脱脂乳粉，溶解于蒸馏水中，110℃下保温10min杀菌，备用。
例如，配制表一中保护剂配方编号6的各保护剂成分的特定浓度的溶液：分别称取海藻糖4.04g、蔗糖10.38g、谷氨酸钠2.9g，分别在40℃下溶于10ml蒸馏水中，吸入5ml注射器，采用膜孔径为0.22μm的滤菌器除菌，将10ml过滤除菌的海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液，分别注入90ml无菌水中，得到4.04％海藻糖溶液，2.9％谷氨酸钠溶液，10.38％蔗糖溶液，备用；取脱脂乳粉14.84g，溶于蒸馏水中，得14.84％脱脂乳粉溶液100ml，110℃灭菌，备用。其他编号的保护剂配方，在替换相应的投料量后，可参照类似方法配制溶液。
(2)配制菌悬液，制备冻干制剂。分别按照下表一保护剂配方中的组别编号和保护剂具体组分及其浓度配制保护剂溶液，备用；分别取实施例一制备的菌泥9份，按照菌泥质量与配方中各种保护剂溶液体积之比为1:5的比例，将菌泥与各保护剂溶液混合，得菌悬液9份。例如，以表一中保护剂配方编号6制备菌悬液，即按照保护剂配方6规定的保护剂浓度，按1g菌泥：(5ml海藻糖溶液+5ml蔗糖溶液+5ml谷氨酸钠溶液+5ml脱脂乳粉溶液)的比例，将保护剂溶液添加至菌泥中，混合混匀，配制需要的菌悬液。
分别从9份菌悬液中取5mL菌悬液分装入10mL无菌带塞的玻璃瓶中,放在-70℃下预冻,2h后取出在真空冻干机中冻干,冻干条件为真空度5Pa、隔板加热温度20℃、冷阱温度-55℃,冻干时间约30h，分别得冻干菌制剂9份。
添加保护剂配方1、保护剂配方2、保护剂配方3、保护剂配方4、保护剂配方5、保护剂配方6、复方保护剂配方7、保护剂配方8、保护剂配方9后制备得到的冻干剂，分别对应冻干菌制剂1、冻干菌制剂2、冻干菌制剂3、冻干菌制剂4、冻干菌制剂5、冻干菌制剂6、冻干菌制剂7、冻干菌制剂8、冻干菌制剂9。
表一：保护剂配方(浓度单位：w/v即质量体积浓度：g/ml)
以下为实验例：
实验例一菌泥活菌测定
取实施例一制备的菌泥1份，测定活菌含量。采用梯度稀释平板计数法,即在无菌操作条件下,吸取充分混匀的样液0.5mL,加入灭菌生理盐水中,制成1∶10的均匀稀释液,再依次进行10倍递增稀释,至1:1012。吸取0.5mL置于灭菌培养皿中,再倒入45℃左右的MRS琼脂计数培养基约15mL,混匀。待其凝固后,于37℃恒温培养箱中倒置培养36h,用菌落计数器计数，得菌泥的活菌含量为9.7×1012cfu/g。
实验例二
(1)冻干制剂活菌测定
取实施例二制备的冻干菌制剂1-9，分别用5mL灭菌的PBS缓冲液复水,然后采用梯度稀释平板计数法,即在无菌操作条件下,吸取充分混匀的样液0.5mL,加入灭菌生理盐水中,制成1∶10的均匀稀释液,再依次进行10倍递增稀释,至1:1012。吸取0.5mL置于灭菌培养皿中,再倒入45℃左右的MRS琼脂计数培养基约15mL,混匀。待其凝固后,于37℃恒温培养箱中倒置培养36h,用菌落计数器计数。
(2)计算方法
其中，“冻干前1ml菌悬液的活菌数×菌悬液体积”，即1份菌悬液中的活菌数，相当于添加保护剂之前的1份菌泥中的活菌数，与实验例一测定的1份菌泥的活菌数相当。
(3)计算结果
实验数据显示，冻干菌制剂5、冻干菌制剂6具有最高的植物乳杆菌CICCNO.6240存活率，较其他保护剂配方的冻干菌制剂，显著提高了植物乳杆菌CICCNO.6240的存活率。
实验例二、菌制剂降胆固醇能力测试
(1)冻干后菌制剂降胆固醇能力的测定
分别将实施例二制备的冻干菌制剂菌粉，以0.5％的接种量(w:v)接种于胆固醇培养基中，37℃静置培养48h，以未接种的培养基为空白对照。将培养液漩涡振荡摇匀，吸取0.5ml菌悬液和4.5ml无水乙醇加入离心管中。静置提取10min后，3000r离心15min。取上清液0.5ml加入洁净试管中，再加入1mg/ml邻苯二甲醛液0.2ml、混合酸(1:1浓硫酸、冰乙酸)4.3ml，制成实验组，对照组用无水乙醇代替离心后的上清液，振荡摇匀。静置反应30min后，在波长550nm处测定吸光度，计算其胆固醇降解率。
胆固醇降解率(％)＝(C-A)/C*100
式中：A为实验菌株培养后的培养液550nm处OD值对应的胆固醇浓度；C为空白对照的OD值对应的胆固醇浓度；重复试验3次求平均值。
(2)菌泥降胆固醇能力的测定
将实施例一制备的菌泥(即未经冻干的菌泥)以0.5％的接种量接种于胆固醇培养基中，37℃静置培养48h，以未接种的培养基为空白对照。将培养液漩涡振荡摇匀，吸取0.5ml菌悬液和4.5ml无水乙醇加入离心管中。静置提取10min后，3000r离心15min。取上清液0.5ml加入洁净试管中，再加入1mg/ml邻苯二甲醛液0.2ml、混合酸(1:1浓硫酸、冰乙酸)4.3ml，制成实验组，对照组用无水乙醇代替离心后的上清液，振荡摇匀。静置反应30min后，在波长550nm处测定吸光度，计算其胆固醇降解率。
胆固醇降解率(％)＝(C-A)/C*100
式中：A为实验菌株培养后的培养液550nm处OD值对应的胆固醇浓度；C为空白对照的OD值对应的胆固醇浓度；重复试验3次求平均值。
(3)实验结果
经本发明优选的保护剂配方得到的冻干菌制剂5、冻干菌制剂6，其胆固醇降解率分别为35.8±1.32、36.2±1.75(％，n＝3)，与未冻干的菌泥37.3±1.50(％，n＝3)的胆固醇降解率相当，没有显著差异，表明本发明优选的保护剂配方得到的冻干菌制剂胆固醇降解率没有明显变化，冻干对植物乳杆菌I4的降胆固醇能力没有明显影响。
而其他冻干菌制剂与未冻干的菌泥的降胆固醇能力相比，降胆固醇的能力具有显著差异，即降低胆固醇的能力显著降低。
以下为显著性检验分析数据：
单一样本统计资料
单一样本检定
使用spss软件，对上述降低胆固醇的实验效果进行单样本T检验。数据分析显示，仅冻干菌制剂第5号和冻干菌制剂第6号的p值＞0.05，表明冻干菌制剂第5号和冻干菌制剂第6号与未冻干菌泥降胆固醇效果的差异不显著。其余各组冻干菌制剂的p值均＜0.05，表明与未冻干菌泥降胆固醇效果的差异显著。

Claims (9)

1.一种菌制剂，由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICCNO.6240和保护剂组成，其特征在于，所述菌制剂每克含有植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICC6240的活菌数为8×1012cfu/g～8.1×1012cfu/g，所述保护剂为海藻糖、谷氨酸钠、蔗糖和脱脂乳粉；以重量百分比计，每克菌制剂含有海藻糖4～4.1％、谷氨酸钠2.9～3％、蔗糖10～10.5％、脱脂乳粉14.5～15％。
2.根据权利要求1所述的菌制剂，其特征在于，以重量百分比计，所述菌制剂每克含有海藻糖4.04％、谷氨酸钠2.9％、蔗糖10.38％、脱脂乳粉14.84％，其中每克菌制剂含有植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICCNO.6240的活菌数为8.08×1012cfu/g；
或以重量百分比计，所述菌制剂每克含有海藻糖4％、谷氨酸钠3％、蔗糖10％、脱脂乳粉15％，其中每克菌制剂含有植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICCNO.6240的活菌数为8.03×1012cfu/g。
3.根据权利要求2所述的菌制剂，其特征在于该菌制剂为冻干剂。
4.一种制备权利要求3所述的菌制剂的方法，其特征在于该方法由以下步骤制备组成：
(1)取活化的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICC6240，接种到10mL液体培养基中,37℃下静置培养18h,经两次扩大培养得种子培养液；将种子培养液以4％的接种量接种增菌培养基中，37℃下静置培养18h；
(2)将菌液移入无菌离心管,以4000转/分钟的转速离心1分钟,弃上清液,用质量体积浓度为0.9％的无菌生理盐水洗涤沉淀菌体后,以4000转/分钟的转速离心10分钟,弃上清液，得植物乳杆菌菌泥；
(3)取海藻糖、蔗糖和谷氨酸钠，分别溶于蒸馏水，采用膜孔径为0.22μm的滤菌器除菌，得海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液；取脱脂乳粉，溶于蒸馏水，110℃下保温10分钟杀菌，得脱脂乳粉溶液；
(4)将步骤(2)制备得到的菌泥与步骤(3)制备的海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液、脱脂乳粉溶液混合，混匀，得菌悬液；
(5)取步骤(4)制备的菌悬液分装入菌带塞的玻璃瓶中,-70℃下预冻2h，在冻干条件为真空度5Pa、隔板加热温度20℃、冷阱温度-55℃的真空冻干机中冻干,冻干时间30h，得冻干菌制剂。
5.据权利要求1-3任一项所述的菌制剂作为直投式发酵剂的用途。
6.根据权利要求1-3任一项所述的菌制剂用于制备降低胆固醇产品的用途。
7.一种菌制剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)取植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICCNO.6240接种到10mL液体培养基中,37℃下静置培养18h,经两次扩大培养得种子培养液；将种子培养液以4％的接种量接种增菌培养基中，37℃下静置培养18h；
(2)将菌液移入无菌离心管,以4000转/分钟的转速离心10min,弃上清液,用质量体积浓度为0.9％的无菌生理盐水洗涤沉淀菌体后,以4000转/分钟的转速离心10min,弃上清液，得乳酸菌菌泥；
(3)制备保护剂溶液：分别称取海藻糖4.04g、蔗糖10.38g、谷氨酸钠2.9g，在40℃下分别溶于10ml蒸馏水中，分别吸入5ml注射器，采用膜孔径为0.22μm的滤菌器除菌，将10ml过滤除菌的海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液，分别注入90ml无菌水中，得到4.04％海藻糖溶液，2.9％谷氨酸钠溶液，10.38％蔗糖溶液，备用；取脱脂乳粉14.84g，溶于100ml蒸馏水中，得14.84％脱脂乳粉溶液，110℃灭菌，备用；
(4)取步骤(2)制备得到的菌泥与步骤(3)制备的海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液、脱脂乳粉溶液，按照1g菌泥:(5ml海藻糖溶液和5ml蔗糖溶液、5ml谷氨酸钠溶液和5ml脱脂乳粉溶液)的比例进行混合，搅拌均匀，得菌悬液；
(5)取步骤(4)制备的菌悬液分装入菌带塞的玻璃瓶中,-70℃下预冻2h，在冻干条件为真空度5Pa、隔板加热温度20℃、冷阱温度-55℃的真空冻干机中冻干,冻干时间30h，得冻干菌制剂。
8.一种由权利要求1-3任一项所述菌制剂发酵得到的发酵产品。
9.权利要求8所述的发酵产品制备降低胆固醇产品的用途。
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