CN104561228A - 一种降胆固醇植物乳杆菌i4增菌培养基响应面优化方法 - Google Patents

一种降胆固醇植物乳杆菌i4增菌培养基响应面优化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法，该方法包括：进行单因素试验，包括菌种的活化、碳源的选择、氮源的选择、pH的选择、培养温度的选择、接种量的选择；在单因素实验的基础上，进行Plackett-Burman试验设计；确定Box-Behnken Design响应面优化试验因素的中心点；对Plackett-Burman试验设计筛选出的主要因素和最陡爬坡试验确定的最适浓度进行进一步优化，获得最佳增菌培养基。发明通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验、响应面实验设计等实验设计方法，优化了植物乳杆菌I4的增菌培养基，经响应面优化后，得到蔗糖、酵母提取物和乙酸钠的最佳浓度分别为2.05％、1.54％、0.31％，优化后的增菌培养基中，菌体密度OD620可达2.458，比MRS培养基OD620值提高了23.7％，菌落单位提高了3.91倍。

Description

一种降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法
技术领域
本发明属于菌种培养领域，尤其涉及一种降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法。
背景技术
乳酸菌是一类具有许多重要的生理功能微生物群，除了能调节胃肠道健康、消除人体自由基、调节免疫作用、抗肿瘤、预防癌症等功能外，还具有降低食物及人体血清中胆固醇含量、降低心血管病的发病率等作用。乳酸菌发酵产品因其具有一定的保健功能而受到越来越多的学者研究开发和消费者的重视和喜爱，其中乳酸菌菌制剂就是一类非常重要的产品，而在其制备过程中的关键就是如何获得高密度菌体，而这一步需要通过高密度培养来实现，而高密度培养的前提就是配置相对合适的培养基。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法，旨在提高菌体密度和菌落单位。
本发明是这样实现的，一种降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法包括：
步骤一、进行单因素试验，包括菌种的活化、碳源的选择、氮源的选择、pH的选择、培养温度的选择、接种量的选择；
步骤二、在单因素实验的基础上，应用Design Expert7.00软件对增菌培养基进行Plackett-Burman试验设计，筛选出对菌体生长影响显著的因素；
步骤三、根据Plackett-Burman试验结果，选取其中重要性排列前三的因数，并确定其爬坡试验的方向和步长，其他因子均取低水平，考察菌体浓度的变化趋势，确定Box-Behnken Design响应面优化试验因素的中心点；
步骤四、采用Box-Benhnken Design试验设计，对Plackett-Burman试验设计筛选出的主要因素和最陡爬坡试验确定的最适浓度进行进一步优化，获得最佳增菌培养基。
进一步，所述的菌种的活化的具体方法为：
将已分离纯化并鉴定的降胆固醇植物乳杆菌I4，划线于MRS固体培养基中，37℃静置培养24-48h，然后以2％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养18h，连续接种三次。
进一步，所述的碳源的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、果糖分别作为碳源，添加量2％，以酵母提取物为氮源，添加量1％，以5％的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
进一步，所述的氮源的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以硫酸铵、氨水、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、蛋白胨、碳酸氢铵分别作为氮源，添加量1％，以蔗糖为碳源，添加量2％，以5％的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
进一步，所述的pH的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以蔗糖为碳源，添加量为2％，以酵母提取物为氮源添加量为1％，分别调pH为5.8、6.0、6.2、6.4、6.6，以5％的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
进一步，所述的培养温度的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以蔗糖为碳源，添加量为2％，以酵母提取物为氮源添加量为1％，pH为6.2，以5％的接种量接种，分别在温度为33℃、35℃、37℃、39℃、41℃下静置培养18h，620nm处测定OD值。
进一步，所述的接种量的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以蔗糖为碳源，添加量为2％，以酵母提取物为氮源添加量为1％，pH为6.2，分别以0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
进一步，蔗糖、酵母提取物和乙酸钠的最佳浓度分别为2.05％、1.54％、0.31％。
本发明在MRS培养基的基础上，通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验、响应面实验设计等实验设计方法，优化了植物乳杆菌I4的增菌培养基，经响应面优化后，得到蔗糖、酵母提取物和乙酸钠的最佳浓度分别为2.05％、1.54％、0.31％，优化后的增菌培养基中，菌体密度OD620可达2.458，比MRS培养基OD620值提高了23.7％，菌落单位提高了3.91倍。
附图说明
图1是本发明实施例提供的降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法流程图；
图2是本发明实施例提供的不同碳源对菌体密度的影响；
图3是本发明实施例提供的不同氮源对菌体密度的影响；
图4是本发明实施例提供的不同pH对菌体密度的影响；
图5是本发明实施例提供的不同温度对菌体密度的影响；
图6是本发明实施例提供的不同温度对菌体密度的影响；
图7是本发明实施例提供的酵母提取物与蔗糖交互作用的等高线图和响应面图；
图8是本发明实施例提供的酵母提取物与乙酸钠交互作用的等高线图和响应面图；
图9是本发明实施例提供的蔗糖与乙酸钠交互作用的等高线图和响应面图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
菌种来源:
降胆固醇植物乳杆菌I4已分离纯化并鉴定,采用邻苯二甲醛法测定,其胆固醇降解率为37.3±1.50(％，n＝3)。
培养基:
MRS培养基(g/L)：牛肉膏10g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母提取物5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O0.25g，吐温801ml，蒸馏水1L，pH6.2-6.4。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上添加2％的琼脂，pH6.2-6.4。
增菌培养基：按实验设计添加各成分，pH6.2。
上述三种培养基在灭菌锅中于121℃，0.1MPa下灭菌20-25min。
图1示出了本发明的降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法流程，如图所示，本发明是这样实现的，一种降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法包括：
S101、进行单因素试验，包括菌种的活化、碳源的选择、氮源的选择、pH的选择、培养温度的选择、接种量的选择；
S102、在单因素实验的基础上，应用Design Expert7.00软件对增菌培养基进行Plackett-Burman试验设计，筛选出对菌体生长影响显著的因素；
各变量所代表因素及其水平见表1，响应值为菌体发酵液在620nm的OD值。本试验选取菌体生长的影响因素7个，同时外加4个虚拟变量。每个因素分别确定高(+1)和低(-1)两个水平，共进行12次试验以确定每个因素的影响水平，从而筛选出对菌体生长影响显著的因素。
表1 Plackett-Burman设计因数水平表Table 1Plackett-Burman design factorlevel table
S103、根据Plackett-Burman试验结果，选取其中重要性排列前三的因数，并确定其爬坡试验的方向和步长，其他因子均取低水平，考察菌体浓度的变化趋势，确定Box-Behnken Design响应面优化试验因素的中心点；
S104、采用Box-Benhnken Design试验设计，对Plackett-Burman试验设计筛选出的主要因素和最陡爬坡试验确定的最适浓度进行进一步优化，获得最佳增菌培养基。
进一步，S101所述的菌种的活化的具体方法为：
将已分离纯化并鉴定的降胆固醇植物乳杆菌I4，划线于MRS固体培养基中，37℃静置培养24-48h，然后以2％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养18h，连续接种三次。
进一步，S101所述的碳源的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、果糖分别作为碳源，添加量2％，以酵母提取物为氮源，添加量1％，以5％的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
进一步，S101所述的氮源的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以硫酸铵、氨水、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、蛋白胨、碳酸氢铵分别作为氮源，添加量1％，以蔗糖为碳源，添加量2％，以5％的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
进一步，S101所述的pH的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以蔗糖为碳源，添加量为2％，以酵母提取物为氮源添加量为1％，分别调pH为5.8、6.0、6.2、6.4、6.6，以5％的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
进一步，S101所述的培养温度的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以蔗糖为碳源，添加量为2％，以酵母提取物为氮源添加量为1％，pH为6.2，以5％的接种量接种，分别在温度为33℃、35℃、37℃、39℃、41℃下静置培养18h，620nm处测定OD值。
进一步，S101所述的接种量的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以蔗糖为碳源，添加量为2％，以酵母提取物为氮源添加量为1％，pH为6.2，分别以0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
结果与分析
1、碳源的选择
不同碳源对菌体密度的影响结果如图2。
由图2可知，在这5中碳源中，蔗糖对对菌体密度的影响最大，葡萄糖和麦芽其次，果糖对其也有一定的影响，而可溶性淀粉对其基本没有影响。蔗糖相对于其它糖来说，价格相对便宜，所以综合考虑选用蔗糖作为该增菌培养基的碳源。
2、氮源的选择
不同氮源对菌体密度的影响结果如图3。
由图3可知，7种氮源中，有机氮源对菌体密度的影响明显高于无机氮源，菌体几乎不能利用三种无机氮源进行生长。在5种有机氮源中，酵母提取物对菌体密度的影响最大，大豆蛋白胨、牛肉浸膏其次，蛋白胨最低。酵母提取物是常用氮源，而且价格低廉，所以综合考虑选用酵母提取物作为该增菌培养基的氮源。
3、pH的选择
不同pH对菌体密度的影响结果如图4。
由图4可知，随着pH的不断增大，菌体密度呈先增加后减小的变化趋势，当pH为6.2时菌体密度最高，所以选择pH为6.2作为该增加培养基的初始pH。
4、温度的选择
不同温度对菌体密度的影响结果如图5。
由图5可知，随着温度的不断提高，菌体密度呈先增加后减小的变化趋势，当温度在37℃左右时，菌体密度达到最大值，所以选择37℃作为该增菌培养基的培养温度。
5、接种量的选择
不同接种量对菌体密度的影响结果如图6。
由图6可知，随着接种量的不断增加，在接种量为4％之前，菌体密度呈上升趋势，当接种量在4％左右时，菌体密度达到最大值，这之后菌体密度趋于平稳。所以选择4％作为该增菌培养基的接种量。
6、植物乳杆菌I4增菌培养基优化结果及分析
6.1Plackett-Burman试验设计结果见表2
表2 Plackett-Burman试验设计及结果
应用Design Expert7.00软件对表2中菌体生物量OD620值进行方差分析及显著性分析，评价每个因素的效应及重要性，结果见表3。
表3 Plackett-Burman试验结果分析
由表3可知，P值为0.0024小于0.05，表明该拟合模型差异显著，可接受。在这7个因素中，A，B，D的P值都小于0.05，说明这些因素对模型显著。R2＝0.9823，说明模型方程拟和良好。精密度Adeq Precision达到15.4342大于4，模型合理。经统计筛选出影响该菌生长的主要因素为：酵母提取物、蔗糖、乙酸钠。
6.2最陡爬坡试验结果及分析
由上表3可知酵母提取物为正效应，蔗糖和乙酸钠为负效应。在此基础上进行最陡爬坡实验以确定重要因子的水平。
表4 最陡爬坡试验设计及结果
由表4可知由，随着酵母提取物、蔗糖、乙酸钠浓度的增加，菌体密度呈先上升后下降的变化趋势。在实验3时菌体密度达到最大值，该处为最大响应值区域，故以实验3的条件作为响应面设计因素水平的中心点，即酵母提取物、蔗糖、乙酸钠浓度分别为2.00％、1.50％、0.30％。
2.6.3Box-Behnken Design响应面优化结果及分析
Box-Benhnken Design试验的因素与水平见表5、试验结果见表6。
表5 Box-Benhnken Design试验的因素与水平表
表6 Box-Benhnken Design试验结果
应用Design Expert7.00软件对表6中菌体生物量OD620值进行多元回归分析，结果见表7。
表7 Box-Benhnken Design试验结果分析
经过回归拟合后，得到相应的回归方程来表示试验因子对响应值的影响。该二次方程模型为：
Y＝2.48+0.054*X1+0.017*X2+0.015*X3+0.015*X1*X2+3.250E-003*X1*X3-0.016*X2*X3-0.14X1 2-0.054X2 2-0.074X3 2
式中：Y为植物乳杆菌I4菌体浓度预测响应值；X1为酵母提取物的编码值；X2为蔗糖的编码值；X3乙酸钠的编码值。
表7中，模型P值<0.01，差异极显著，可接受；失拟项P值>0.05，失拟项不显著，说明模型在整个回归区域的拟合度很好，接近真实的响应曲面情况，模型建立合理；CV＝1.44％，模型精确度高，试验可信。R2＝0.9522，矫正系数AdjR2＝0.8908，表明预测值与实际值之间具有高度相关性，能解释89.08％的响应值变化，故可以利用此模型对菌体数量进行预测。
根据上述回归方程绘出响应面分析图及等高线图，研究酵母提取物、蔗糖、乙酸钠3个因素对发酵的影响，响应面和等高线图见图7、图8、图9。
由图7可知，在蔗糖浓度为1.50-1.63，酵母提取物浓度为2.0-2.13时，OD620达到最大值。
由图7可知，在酵母提取物浓度为2.00-2.13，乙酸钠浓度为0.30-0.35时，OD620达到最大值。
由图8可知，在蔗糖浓度为1.50-1.63，乙酸钠浓度为0.30-0.35时，OD620达到最大值。
通过软件计算，得到当酵母提取物浓度为2.05％、蔗糖浓度为1.54％、乙酸钠浓度为0.31％时，OD620的理论最大值为2.486。
本发明在MRS培养基的基础上，通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验、响应面实验设计等实验设计方法，优化了植物乳杆菌I4的增菌培养基，经响应面优化后，得到蔗糖、酵母提取物和乙酸钠的最佳浓度分别为2.05％、1.54％、0.31％，优化后的增菌培养基中，菌体密度OD620可达2.458，比MRS培养基OD620值提高了23.7％，菌落单位提高了3.91倍。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法，其特征在于，所述的降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法包括：
步骤一、进行单因素试验，包括菌种的活化、碳源的选择、氮源的选择、pH的选择、培养温度的选择、接种量的选择；
步骤二、在单因素实验的基础上，应用Design Expert7.00软件对增菌培养基进行Plackett-Burman试验设计，筛选出对菌体生长影响显著的因素；
步骤三、根据Plackett-Burman试验结果，选取其中重要性排列前三的因数，并确定其爬坡试验的方向和步长，其他因子均取低水平，考察菌体浓度的变化趋势，确定Box-Behnken Design响应面优化试验因素的中心点；
步骤四、采用Box-Benhnken Design试验设计，对Plackett-Burman试验设计筛选出的主要因素和最陡爬坡试验确定的最适浓度进行进一步优化，获得最佳增菌培养基。
2.如权利要求1所述的降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法，其特征在于，所述的菌种的活化的具体方法为：
将已分离纯化并鉴定的降胆固醇植物乳杆菌I4，划线于MRS固体培养基中，37℃静置培养24-48h，然后以2％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养18h，连续接种三次。
3.如权利要求1所述的降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法，其特征在于，所述的碳源的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、果糖分别作为碳源，添加量2％，以酵母提取物为氮源，添加量1％，以5％的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
4.如权利要求1所述的降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法，其特征在于，所述的氮源的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以硫酸铵、氨水、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、蛋白胨、碳酸氢铵分别作为氮源，添加量1％，以蔗糖为碳源，添加量2％，以5％的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
5.如权利要求1所述的降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法，其特征在于，所述的pH的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以蔗糖为碳源，添加量为2％，以酵母提取物为氮源添加量为1％，分别调pH为5.8、6.0、6.2、6.4、6.6，以5％的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
6.如权利要求1所述的降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法，其特征在于，所述的培养温度的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以蔗糖为碳源，添加量为2％，以酵母提取物为氮源添加量为1％，pH为6.2，以5％的接种量接种，分别在温度为33℃、35℃、37℃、39℃、41℃下静置培养18h，620nm处测定OD值。
7.如权利要求1所述的降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法，其特征在于，所述的接种量的选择的具体方法为：
在MRS培养基的基础上，以蔗糖为碳源，添加量为2％，以酵母提取物为氮源添加量为1％，pH为6.2，分别以0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
8.如权利要求1所述的降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化方法，其特征在于，蔗糖、酵母提取物和乙酸钠的最佳浓度分别为2.05％、1.54％、0.31％。
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