CN104962591A - 一种采用响应面法优化ε-聚赖氨酸发酵的新型培养基的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用响应面法优化ε-聚赖氨酸发酵的新型培养基的方法，该方法包括：进行Plackett-Burman实验设计；确定Box-Behnken Design响应面优化实验因素的中心点；对Plackett-Burman实验设计筛选出的主要因素和最陡爬坡实验确定的最适浓度进行进一步优化，获得最佳新型发酵培养基。本发明通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验、响应面实验设计等实验设计方法，优化了ε-聚赖氨酸发酵的新型培养基，经响应面优化后，木薯淀粉、鱼粉和硫酸铵的最佳浓度分别为68.1g/L、15.0g/L，5.1g/L，利用优化后的新型培养基，ε-聚赖氨酸产量达1.302g/L，比原始培养基发酵生产ε-聚赖氨酸产量提高了40％以上。表明使用本发明提供的响应面法优化发酵培养基可显著提高ε-聚赖氨酸产生菌发酵生产ε-聚赖氨酸的能力，为利用木薯淀粉和鱼粉来工业化生产ε-聚赖氨酸奠定了基础。

Description

一种采用响应面法优化ε-聚赖氨酸发酵的新型培养基的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，更具体的，本发明涉及一种采用响应面法优化ε-聚赖氨酸发酵的新型培养基的方法。

背景技术

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是一种仅由25-35个L-赖氨酸残基通过α-羧基和ε-氨基连接而成的多聚物，它一般由微生物有氧发酵获得。由于具有抑菌谱广、安全性能高、热稳定性好、使用方便等优点，这使它成为目前最具商业潜力的生物防腐剂。此外，ε-PL还可以用作可降解性材料、载体材料和聚合材料等等。因此，ε-PL具有广阔的应用前景和十分可观的经济效益。

到目前为止，葡萄糖是工业化发酵生产ε-PL的唯一碳源。而作为一种新的可再生原料，淀粉类生物质原料在发酵领域有着非常广泛的用途，目前淀粉类原料已经成功用来发酵生产乙醇、乳酸、微生物油脂等产品。淀粉包括玉米淀粉、薯类淀粉、变性淀粉等，而其中木薯淀粉被称为“薯类淀粉之王”，用木薯淀粉为原料来进行发酵生产ε-PL，在实验室中已获得成功，扶教龙等人(CN 104726509 A)通过以ε-PL产生菌为发酵菌种，以一定量的木薯淀粉为碳源，在一定培养条件下发酵生产ε-PL。

但是，在用木薯淀粉作为碳源发酵生产ε-PL上还存在以下缺陷：培养基组分的配比不合理，导致白色链霉菌的延迟期较长，增长了培养周期，间接增加了生产成本，而且培养基组分配比的不合理性，也直接影响到了发酵产率和生产成本。

因此，在用木薯淀粉作为碳源发酵生产ε-PL这一领域，迫切需要改良其发酵培养基，以期提高ε-PL的发酵效率，并且进一步降低生产成本。

发明内容

针对现有技术中有关利用木薯淀粉作为碳源发酵生产ε-PL的培养基优化的研究较少的技术现状。本发明为了提高ε-PL产生菌利用木薯淀粉作为碳源发酵生产ε-PL的能力，采用响应面法优化了已公开的ε-PL产生菌产ε-PL的一种以木薯淀粉作为碳源的新型发酵培养基，以期提高ε-PL的产量，为利用木薯淀粉发酵生产ε-PL的工业化生产奠定基础。

本发明是这样实现的，一种采用响应面法优化ε-聚赖氨酸发酵的新型培养基的方法。

包括：

步骤一.应用Design Expert8.05软件对木薯淀粉新型发酵培养基进行Plackett-Burman实验设计，筛选出对发酵生产ε-聚赖氨酸影响显著的因素；

步骤二.根据Plackett-Burman的实验结果，选取其中重要性排列前三的因数，并确定其爬坡实验的方向和步长，其他因子均取低水平，考察ε-聚赖氨酸产量的变化趋势，确定Box-Behnken Design响应面优化实验因素的中心点；

步骤三.采用Box-Benhnken Design实验设计，对Plackett-Burman实验设计筛选出的主要因素和最陡爬坡实验确定的最适浓度进行进一步优化，获得最佳木薯淀粉新型发酵培养基。

本发明在原始培养基的基础上，通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验、响应面实验设计等实验设计方法，优化了ε-聚赖氨酸发酵的木薯淀粉新型培养基，经响应面优化后，得到木薯淀粉、鱼粉和硫酸铵的最佳浓度分别为68.1g/L、15.0g/L，5.1g/L，利用优化后的木薯淀粉新型培养基，摇瓶中ε-聚赖氨酸产量1.302g/L，比原始培养基发酵生产ε-聚赖氨酸产量提高了40％以上。说明使用响应面法优化发酵培养基可显著提高ε-PL产生菌发酵生产ε-PL的能力，此结果为工业化生产ε-PL奠定了基础。

附图说明

图1是本发明实施例提供的响应面法优化ε-聚赖氨酸发酵的新型培养基的方法的流程图；

图2是本发明实施例提供的木薯淀粉与鱼粉交互作用的等高线图和响应面图；

图3是本发明实施例提供的木薯淀粉与硫酸铵交互作用的等高线图和响应面图；

图4是本发明实施例提供的鱼粉与硫酸铵交互作用的等高线图和响应面图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

图1示出了本发明的响应面法优化ε-聚赖氨酸发酵的新型培养基的方法的流程，如图所示，本发明是这样实现的，一种采用响应面法优化ε-聚赖氨酸发酵的新型培养基的方法包括：

步骤一.应用Design Expert8.05软件对增菌培养基进行Plackett-Burman实验设计，筛选出对菌体生长影响显著的因素；

各变量所代表因素及其水平见表1，响应值为ε-聚赖氨酸的产量。本实验选取影响因素8个，同时外加3个虚拟变量。每个因素分别确定高(+1)和低(-1)两个水平，共进行12次实验以确定每个因素的影响水平，从而筛选出对菌体生长影响显著的因素。

表1 Plackett-Burman设计因数水平表

步骤二.根据Plackett-Burman实验结果，选取其中重要性排列前三的因数，并确定其爬坡实验的方向和步长，其他因子均取低水平，考察菌体浓度的变化趋势，确定Box-Behnken Design响应面优化实验因素的中心点；

步骤三.采用Box-Benhnken Design实验设计，对Plackett-Burman实验设计筛选出的主要因素和最陡爬坡实验确定的最适浓度进行进一步优化，获得最佳新型发酵培养基。

结果与分析

1.Plackett-Burman设计筛选ε-聚赖氨酸合成关键营养成分的结果与分析

Plackett-Burman实验设计结果见表2。采用Design-Expert软件对表2中的ε-聚赖氨酸产量数据进行回归分析，得到各影响因子的偏回归系数及其显著性(表3)。结果表明，木薯淀粉、鱼粉和硫酸铵对ε-聚赖氨酸产量影响较大。其中，木薯淀粉的浓度对ε-聚赖氨酸产量的影响是正效应，鱼粉和硫酸铵的浓度对ε-聚赖氨酸产量的影响是负效应。即后面的实验主要考察这三个因素时，应适当增加木薯淀粉的含量，并且减少鱼粉和硫酸铵的含量。

表2 Plackett-Burman实验设计结果

用软件对上述数据进行分析，分析结果如下：

表3 各因素显著效果

表4 显著影响因素的F值，P值

由表3可以得出在这8个因素中，B、C、D、E四个因数产生负影响，A、F、G、H产生正影响，A、B、C三个因素为显著因素，这三个因素的p值都小于0.05，模型的F值为53.02，这些数据表明这个模型是可行的。

回归方程为：

Y＝0.84+0.065A-0.10B-0.11C-0.015D-0.006E-0.00008F+0.007G+0.018H

只保留方程中的显著因素，可得Y＝0.84+0.065A-0.10B-0.11C

把A＝1，B＝-1，C＝-1代入上式，可得Y＝1.115。

由实验结果得出，产ε-聚赖氨酸白色链霉菌的培养基影响最显著的因素为木薯淀粉、鱼粉、硫酸铵。

2.最陡爬坡实验确定响应面中心点的结果与分析

由上表3可知可知，木薯淀粉为正效应，鱼粉和硫酸铵为负效应。在此基础上进行最陡爬坡实验以确定重要因子的水平。

表5 最陡爬坡实验设计及其结果

由表5中数据可知，爬坡实验中1-3组的ε-PL产量逐渐升高，3-6组时ε-PL产量逐渐降低，在第三组时ε-PL产量最高，所以最大相应区域应该在第3组周围，所以在以后的响应面实验时，以第三组的浓度作为中心点，即木薯淀粉、鱼粉、硫酸铵浓度分别为70g/L、13g/L、7g/L。

3.Box-Behnken design响应面优化结果与分析

Box-Behnken design实验的因素与水平见表6。

表6 Box-Behnken实验因素与水平

根据PB分析实验及最陡爬坡实验结果，采用Design-Expert软件对木薯淀粉、鱼粉、硫酸铵进行优化，实验结果如表7所示。

表7 Box-Behnken实验设计及结果

用Design-Expert软件，对表7中数据进行多元回归拟合，可以得到ε-聚赖氨酸产量(Y)对木薯淀粉(A)、鱼粉(B)、硫酸铵(C)的回归方程为：Y＝1.21+0.055A+0.073B-0.060C-0.049A×B+0.11A×C-0.053B×C-0.079A²-0.021B²-0.12C²，对实验结果进行显著性检验及方差分析，结果如表8所示。

表8 响应面实验回归系数检验表

从表8可以看出，模型p＜0.0001，表明该模型是高度显著的，方程拟合度较好；同时失拟项的p为0.0979，说明模型失拟不显著，残差由随机误差引起，模型选择正确；该方程系数R²＝0.9845，说明方程的拟合程度较好，该模型能较好地预测发酵培养基组分与ε-聚赖氨酸产量的关系；校正决定系数R² _Adj＝0.9655，表明方程模型可信度较高，能够较好地描述实验结果。

根据BB实验设计结果及上诉回归方程绘出三维响应面图(见图2、图3和图4)，它们分别反映了木薯淀粉(A)、鱼粉(B)、硫酸铵(C)这三个因素的两两交互作用对响应值的影响。

木薯淀粉和鱼粉对ε-聚赖氨酸产量的影响如图2所示，当木薯淀粉浓度一定时，ε-聚赖氨酸产量随着鱼粉浓度增加而增大，但当鱼粉浓度大于15.0g/L时，ε-聚赖氨酸产量呈下降趋势。当鱼粉浓度一定时，随着木薯淀粉浓度的增加，开始ε-聚赖氨酸产量也随之增大，但当木薯淀粉浓度继续增大时，ε-聚赖氨酸产量逐渐降低。

等高线的形状可以反映因素间交互作用的强弱，圆形表示交互作用不显著，椭圆形表示交互作用显著。如图3所示，木薯淀粉与硫酸铵交互作用显著，等高线木薯淀粉的交点多于与硫酸铵的交点，因此木薯淀粉、硫酸铵的交互作用中，木薯淀粉对ε-聚赖氨酸产量的影响较大，为主效应因子。

鱼粉和硫酸铵对ε-聚赖氨酸产量的影响如图4所示，当硫酸铵浓度一定时，ε-聚赖氨酸产量随着鱼粉浓度增加呈先增大后降低的趋势。当鱼粉浓度一定时，ε-聚赖氨酸产量先增大后降低，这与图2和图3显示的规律相同。此外从响应面图可分析得出，在各因素之间的交互影响中，鱼粉对ε-聚赖氨酸产量影响最大，木薯淀粉次之，硫酸铵最弱。此结果与方差分析表所反映出的结果一致。

本发明在原始培养基的基础上，通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验、响应面实验设计等实验设计方法，优化了ε-聚赖氨酸发酵的木薯淀粉新型培养基，经响应面优化后，得到木薯淀粉、鱼粉和硫酸铵的最佳浓度分别为68.1g/L、15.0g/L，5.1g/L，利用优化后的木薯淀粉新型培养基，摇瓶中ε-聚赖氨酸产量1.302g/L，比原始培养基发酵生产ε-聚赖氨酸产量提高了40％以上。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种采用响应面法优化ε-聚赖氨酸发酵的新型培养基的方法。其特征在于，所述的采用响应面法优化ε-聚赖氨酸发酵的新型培养基的方法包括：

步骤一.应用Design Expert 8.05软件对木薯淀粉新型发酵培养基进行Plackett-Burman实验设计，筛选出显著影响发酵生产ε-聚赖氨酸的因素；

步骤二.根据Plackett-Burman的实验结果，选取重要性排列在前三的因素，确定其最陡爬坡实验的方向和步长，其他因子均取低水平，研究ε-聚赖氨酸产量的变化趋势，确定Box-Behnken Design响应面优化实验的中心点；

步骤三.采用Box-Benhnken Design实验设计，对Plackett-Burman实验筛选出的主要因素和最陡爬坡实验确定的最适浓度进行进一步优化，获得最佳木薯淀粉新型发酵培养基。

2.如权利要求1所述采用响应面法优化ε-聚赖氨酸发酵的新型培养基的方法，其特征在于，木薯淀粉、鱼粉和硫酸铵的最佳浓度分别为68.1g/L、15.0g/L，5.1g/L。