CN103642770A - 一种采用响应面法提高基因工程菌c102产酶能力方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种采用响应面法提高基因工程菌C102产酶能力的方法，通过单因素试验考察培养基中酵母氮源含量、pH值、甘油含量和甲醇含量对酶活的影响，确定以酵母氮源含量、pH值和甲醇含量作为响应面优化的基本条件，在30℃，200r／min条件下培养工程菌C102进行72h，培养基的碳源采用甘油含量分别为10.0g／L，氮源采用酵母氮源含量为5-9g／L，甲醇含量为7-11g／L，pH值为5.5-6.5，低温脂肪酶酶活比优化前产酶活力28.0IU／ml提高了50.9％。表明使用本发明提供响应面法优化发酵条件可显著提高基因工程菌株C102的产低温脂肪酶的产酶能力，具有广泛的实用性。

Description

一种采用响应面法提高基因工程菌C102产酶能力方法
发明领域
本发明属于制备微生物发酵技术领域，具体的，本发明涉及一种提高基因工程菌产酶能力的技术领域。 
背景技术
脂肪酶是广泛应用于食品、医药以及皮革等轻工业的一种特殊的酯键水解酶，能够在水相和非水相界面催化长链甘油三酯水解[1]。低温脂肪酶具有较低的最适酶活温度(<40℃)，以及在低温下保持较高酶活的能力[2]，因而在食品、医药、环境和精细化工等诸多领域的低温生物催化方面具有很高的应用价值[3-5]。 
目前已知的低温脂肪酶生产菌株主要为极地地区、高山以及深海等低温环境中的嗜冷菌，包括无色杆菌属、气单胞菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属等细菌和曲霉属、假丝酵母属、白地霉属、青霉、根霉等真菌[6]，而有研究者认为，使用基因工程菌生产脂肪酶将成为未来的主要发展方向，因为工程菌将实现为特定应用领域生产适合的具有显著特性的脂肪酶[7]。Feller等[8]最早从南极嗜冷菌莫拉菌属(Moraxella)TA144中分离克隆了3种低温脂肪酶基因，并在E.coli中表达，随后，多种不同来源的低温脂肪酶基因获得了克隆和表达，如Kim等[9]从活性污泥基因组中克隆、分离得到一类新的细菌来源的低温碱性脂肪酶LipEH166；；Zhang[10]等在大肠杆菌中表达了从冰川土壤中分离的鲍曼不动杆菌XMZ-26的低温脂肪酶基因；王永杰等[11]在巴斯德毕赤酵母中表达了南极嗜冷菌Psychrobacter sp.低温脂肪酶基因lip- 948。但有关低温脂肪酶工程菌的发酵优化的研究较少。 
发明内容
针对现有技术中有关低温脂肪酶工程菌的发酵优化的研究较少的技术现状。本发明为了提供一种采用响应面法提高基因工程菌C102产酶能力的方法，采用响应面法优化已公开的低温脂肪酶基因工程菌C102产低温脂肪酶的发酵条件，以期提高低温脂肪酶的产量，为该基因工程菌产脂肪酶的工业化生产奠定基础。 
本发明的技术方案： 
本发明为了提高基因工程菌毕赤酵母C102表达低温脂肪酶酶活水平，通过单因素试验考察培养基中酵母氮源含量、pH值、甘油含量和甲醇含量对酶活的影响，确定以酵母氮源含量、pH值和甲醇含量作为响应面优化的基本条件。利用Design-Expert软件，以低温脂肪酶酶活为响应值，对培养基的组成和产酶条件进行了优化，得出优化产酶条件为：酵母氮源含量7.3g／L、pH值6.0、甲醇含量9.1g／L，在此培养条件下，低温脂肪酶酶活达到42.25IU／ml，比优化前产酶活力28.0IU／ml提高了50.9％。说明使用响应面法优化发酵条件可显著提高基因工程菌株C102的产低温脂肪酶的产酶能力，此结果为规模化生产低温脂肪酶奠定了基础。 
具体的，本发明提供一种采用响应面法提高基因工程菌C102产酶能力的方法，在30℃，200r／min条件下培养工程菌C102进行72h，培养基的碳源采用甘油含量分别为10.0g／L，氮源采用酵母氮源含量为5-9g／L，甲醇含量为7-11g／L，pH值为5.5-6.5，其他发酵培养条件都为本领域常见工序和技术参数，对基因工程菌C102产低温脂肪酶活性的影响最大。 
进一步，本发明提供一种采用响应面法提高基因工程菌C102产酶能力的 方法，在30℃，200r／min条件下培养工程菌C102进行72h，培养基的碳源采用甘油含量分别为10.0g／L，氮源采用酵母氮源含量为7.3g／L，甲醇含量为9.1g／L，pH值为6.0，其他发酵培养条件都为本领域常见工序和技术参数，在此培养条件下，低温脂肪酶酶活达到42.25IU／ml，比优化前产酶活力28.0IU／ml提高了50.9％，对基因工程菌C102产低温脂肪酶活性的影响最大。 
本发明采用的基因工程菌C102为一种已公开的基因工程菌的菌种，本领域普通技术人员可以通过公众渠道购买获得。 
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果。 
本发明通过单因素试验考察培养基中酵母氮源含量、pH值、甘油含量和甲醇含量对酶活的影响，确定以酵母氮源含量、pH值和甲醇含量作为响应面优化的基本条件，以低温脂肪酶酶活为响应值，对培养基的组成和产酶条件进行了优化，得出优化产酶条件为：酵母氮源含量7.3g／L、pH值6.0、甲醇含量9.1g／L，在此培养条件下，低温脂肪酶酶活达到42.25IU／ml，比优化前产酶活力28.0IU／ml提高了50.9％。说明使用响应面法优化发酵条件可显著提高基因工程菌株C102的产低温脂肪酶的产酶能力，此结果为规模化生产低温脂肪酶奠定了基础。 
附图说明
图1甘油含量对低温脂肪酶酶活的影响图。 
图2酵母氮源含量对低温脂肪酶酶活的影响图。 
图3甲醇含量对低温脂肪酶酶活的影响图。 
图4pH对低温脂肪酶酶活的影响图。 
图5酵母氮源含量、pH值及其交互作用对低温脂肪酶酶活的响应面图。 
图6酵母氮源含量、pH值及其交互作用对低温脂肪酶酶活的等高线图。 
图7酵母氮源含量、甲醇含量及其交互作用对低温脂肪酶酶活的响应面图。 
图8酵母氮源含量、甲醇含量及其交互作用对低温脂肪酶酶活的等高线图。 
图9为pH、甲醇含量及其交互作用对低温脂肪酶酶活的响应面图。 
图10为pH、甲醇含量及其交互作用对低温脂肪酶酶活的等高线图。 
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。 
菌种：产低温脂肪酶巴斯德毕赤酵母基因工程菌C102由新疆师范大学生命科学学院遗传实验室构建，一种已公开的基因工程菌的菌种，本领域普通技术人员可以通过公众渠道购买获得[12-13]。 
培养基：基因工程菌C102菌种保藏和活化培养基YPD：含酵母提取物10g／L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g／L；诱导表达培养基BMGY：含酵母提取物10g/L，蛋白胨20g／L，酵母氮源(yeast nitrogen base)13.4g／L，生物素4×10-4g／L，甘油5g／L，100mM磷酸钾缓冲液调节pH6.0；诱导表达培养基BMMY：含酵母提取物10g／L，蛋白胨20g/L，酵母氮源13.4g／L，生物素4×10-4g／L，甲醇5g／L，100mM磷酸钾缓冲液调节pH6.0。 
摇瓶培养：按照5％接种量(菌液浓度1×108个／ml)将菌种接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，30℃，200r／min培养60～72h。 
本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。 
实施例一：提高基因工程菌C102产酶能力的方法 
通过单因素试验考察培养基中酵母氮源含量、pH值、甘油含量和甲醇含量对酶活的影响，确定以酵母氮源含量、pH值和甲醇含量作为响应面优化的基本条件。利用Design-Expert软件，以低温脂肪酶酶活为响应值，对培养基的组成和产酶条件进行了优化，得出优化产低温脂肪酶的条件： 
在30℃，200r／min条件下培养工程菌Cl02进行72h，培养基的碳源采用甘油含量分别为10.0g／L，氮源采用酵母氮源含量为5-9g／L，甲醇含量为7-11g／L，pH值为5.5-6.5，其他发酵培养条件都为本领域常见工序和技术参数，对基因工程菌C102产低温脂肪酶活性的影响最大。 
进一步，本发明提供一种采用响应面法提高基因工程菌Cl02产酶能力的方法，在30℃，200r／min条件下培养工程菌C102进行72h，培养基的碳源采用甘油含量分别为10.0g／L，氮源采用酵母氮源含量为7.3g／L，甲醇含量为9.1g／L，pH值为6.0，其他发酵培养条件都为本领域常见工序和技术参数，在此培养条件下，低温脂肪酶酶活达到42.25IU／ml，比优化前产酶活力28.0IU／ml提高了50.9％，从而表明了上述因素对基因工程菌Cl02产低温脂肪酶活性的影响最大，使用响应面法优化发酵条件可显著提高基因工程菌株Cl02的产低温脂肪酶的产酶能力，此结果为规模化生产低温脂肪酶奠定了基础。 
实施例二：工程菌产低温脂肪酶条件的优化 
1.工程菌产低温脂肪酶条件的优化 
(1)单因素试验：在30℃，200r／min条件下培养工程菌72h，探讨培养基的碳源(甘油含量分别为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5g／L)、氮源(酵母氮源含量分别为3、5、7、9、115-9g／L)、甲醇含量(分别为3、5、7、9、 117-11g／L)和pH值(5.5-6.55.0、5.5、6.0、6.5、7.0)对基因工程菌的低温脂肪酶活性的影响，以确定各因素的合适范围。 
(2)单因素试验结果： 
甘油含量的优化：检测结果显示，甘油含量超过5g／L，其含量继续增加对低温脂肪酶酶活的影响不明显，甘油含量达10g／L时，酶活达最高，为29.0IU／ml，参见附图1。因此确定培养基的甘油含量为10g／L。相对于其他因素，甘油含量对低温脂肪酶酶活的影响并不显著。 
酵母氮源含量的优化：检测结果显示，随着酵母氮源含量的上升，低温脂肪酶酶活逐渐升高，当酵母氮源含量达7g／L时，酶活达最高，为33.5IU／ml，参见附图2。因此确定进一步试验的酵母氮源含量的范围为5-9g／L。 
甲醇含量的优化：检测结果显示，随着甲醇含量的上升，低温脂肪酶酶活逐渐提高，当甲醇含量达9g／L时，酶活达最高，为34.1IU／ml，参见附图3。因此确定进一步试验的甲醇含量的范围为7-11g／L。 
pH值的优化：检测结果显示，低温脂肪酶酶活在pH为6时达最高，为28.0IU／ml，参见附图4。因此确定进一步试验的pH值范围为5.5-6.5。 
实施例三：工程菌产低温脂肪酶条件的优化 
1.响应面试验：综合甘油含量、酵母氮源含量、pH值和甲醇含量对低温脂肪酶酶活的影响，选取3个主要因素(酵母氮源含量、pH值和甲醇含量)进行响应面试验，以低温脂肪酶酶活为指标，采用统计软件Des ign-Expert7.1中关于响应面(Response surface methodology，RSM)的部分对试验进行设计、分析和培养条件的优化。根据Box-Benheken中心组合试验设计原理，试验设计因素和水平见表1。以低温脂肪酶酶活为响应值，自变量取值为 试验设计水平中值的为中心点试验，其他为非中心点试验，中心点试验重复5次，以估计试验误差。见表1 
表1响应面分析因素与水平 
Figure BSA0000098655740000071
2.响应面分析：通过统计软件Design-Expert对试验结果的分析绘制响应面曲线图和等高线图，从图中可以直观分析各变量之间的交互作用对响应值的影响。其中响应面曲线图是在3个试验因素中固定一个变量(取0水平，即酵母氮源含量7g／L，pH6.0，甲醇含量9g／L)进行降维分析，做出相应的三维曲面图，图形的顶点标示出回归方程在所选范围的极大值。还可以从等高线图的形状，判断相应两个变量之间的交互作用是否显著。 
3.响应面优化的验证：按照响应面试验得到的优化条件组合，做3次平行试验，比较平行试验所产低温脂肪酶酶活与响应面优化的理论预测值的误差，验证响应面优化的可行性。 
4.响应面试验结果：根据表2的响应面试验结果，利用Design-Expert7.1软件对试验结果进行多元回归拟合，得到低温脂肪酶酶活对酵母氮源含量(A)、pH值(B)和甲醇含量(C)的二次多项回归模拟方程为：y＝41.98+3.4A+0.68B+1.18C+1.02AB-1.59AC-0.095BC-11.06A2-5.14B2-8.96C2。 
对试验结果进行统计分析，得到的方差结果见表3。由方差分析结果可知，低温脂肪酶酶活模型的显著水平(<0.0001)小于0.05且失拟误差(0.6594)大于0.1，表明此回归模型能够对基因工程菌C102产生的低温脂肪酶酶活力进行准确的预测和分析。由表3可知，模型中酵母氮源含量、甲 醇含量和pH值的一次项和二次项均具有显著性，说明各试验因子均对低温脂肪酶酶活力影响显著，方程对试验拟合良好，可用此回归模型对试验结果进行分析。见表2和表3 
表2响应面试验方案及结果 
注：表中试验号8、10、13、15、17为中心点试验重复5次。 
表3试验结果的方差分析 
Figure BSA0000098655740000082
Figure BSA0000098655740000091
注：*表示P<005(显著)；P>0.1表示不显著。 
5.响应面分析：酵母氮源含量(A)、pH(B)和醇含量(C)交互作用的响应面曲线图见参见附图5、附图7、附图9。 
参见附图5表示在甲醇含量为9g／L时，酵母氮源含量和pH值对低温脂肪酶酶活的影响。由响应曲面图可知，酵母氮源含量和pH值的影响极为显著，响应值变化幅度较大，曲线也较陡。低温脂肪酶酶活随酵母氮源含量的上升而先上升后下降，说明在此代谢过程中维持适宜的碳氮比和pH环境对酶活的重要性。 
参见附图7表示在pH值为6.0时，酵母氮源含量和甲醇含量对低温脂肪酶酶活的影响。由响应曲面参见附图7可知，甲醇含量与酵母氮源含量具有相似的显著影响。当其浓度过高时导致酶活明显下降可能是由于甲醇浓度过高会对菌体细胞的通透性造成很大的影响。 
通过比较参见附图6、附图8、附图10可以看出，表示在酵母氮源含量为7g／L时，pH值和甲醇含量对低温脂肪酶酶活的影响。pH值和甲醇含量对低温脂肪酶酶活的交互作用明显不同于两因素交互作用，结合表3试验结果方差分析表中的显著性分析数据，可以确认酵母氮源含量和pH值以及酵母氮源含量和甲醇含量的交互作用对低温脂肪酶酶活影响更显著。 
6.响应面结果的优化分析和条件验证 
为了确定最佳的培养条件，对响应面试验结果利用Design-Expert软件进一步进行优化，在试验因素水平范围内，以低温脂肪酶酶活最高为指标，得出酵母氮源含量、pH值和甲醇含量3个因素的最佳组合为：酵母氮源含量7.31g／L、pH值6.04、甲醇含量9.1g／L，相应的响应面二次模型预测低温脂肪酶酶活的极大值为42.304IU／ml。根据试验实际的需要，调整为酵母氮源含量7.3g／L、pH值6.0、甲醇含量9.1g／L，作为优化条件组合，做3次平行试验，得到的低温脂肪酶酶活为42.25IU／ml，与理论预测值的误差在1％以内，证明响应面优化的参数可行。 
实施例四：低温脂肪酶活力的检测 
低温脂肪酶活力的检测采用标准GB／T1803-93(2002)，工业酶制剂通用试验方法[14]。取4个100mL三角瓶，每瓶加入5mL0.025mol／L磷酸缓冲液和4mL的橄榄油乳化液，37℃水浴保温5min；在其中2个100mL三角瓶中各加1mL离心上清酶液(10000r／min，5min)，从加入酶液开始精确记时，37℃保温15min；取出，立即加入95％的乙醇15mL终止酶的作用，再加入3滴酚酞指示剂，用0.05mol／L NaOH滴定溶液至呈粉红色。在反应条件下，每分钟催化脂肪水解产生1μmol脂肪酸的脂肪酶量定义为1个脂肪酶国际单位(IU)。酶活取平均值。 
脂肪酶活力(IU)=(V1-V2)×0.05×1000／15 
式中V1为待测溶液滴定值；V2为不加酶对照滴定值； 
0.05为标准NaOH摩尔量(mol／L)；15为酶活反应时间(15min)。 
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Claims (2)

1.一种采用响应面法提高基因工程菌C102产酶能力的方法，其特征在于，在30℃，200r／min条件下培养工程菌C102进行72h，培养基的碳源采用甘油含量分别为10.0g／L，氮源采用酵母氮源含量为5-9g／L，甲醇含量为7-11g／L，pH值为5.5-6.5。
2.如权利要求1所述采用响应面法提高基因工程菌C102产酶能力的方法，其特征在于，在30℃，200r／min条件下培养工程菌C102进行72h，培养基的碳源采用甘油含量分别为10.0g／L，氮源采用酵母氮源含量为7.3g／L，甲醇含量为9.1g／L，pH值为6.0。
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