CN104256575A - 一种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法，包括：将活化的桑黄和灵芝菌种接种于添加黄连木提取物的液体种子培养基中培养制得桑黄和灵芝液体菌种；先将桑黄液体菌种接入添加有胡萝卜、大麦的固体培养基中培养，培养产物干燥粉碎后得固体培养物Ⅰ；再将灵芝液体菌种接入添加有固体培养物Ⅰ和甘蓝酶解物的液体发酵培养基中培养，培养一段时间再接入乳酸菌菌种进行培养得到发酵产物。本发明根据胡萝卜、甘蓝传统富含叶酸果蔬原料特点及食药真菌桑黄、灵芝的发酵特性，通过采用先食药真菌发酵，后乳酸菌发酵的两阶段发酵，提高了最终发酵产物中叶酸的含量，是一种极具工业化前景的生产方法。

Description

一种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法。
背景技术
桑黄(Phellinus igniarius)属担子菌亚门，层孔菌纲，锈革孔菌科，针层孔菌属。桑黄菌提取物在抑制癌细胞转移和防止癌症手术后复发等的临床应用中具有显著效果，是目前国际公认的生物治癌药剂中有效率最高的一种食药真菌。
由于受生理状态的特殊性和复杂性以及外部环境的制约，造成桑黄在自然界中形成子实体稀少，特别是形成可用子实体需要多年。而且人工栽培极其困难，培养条件苛刻，且生长周期长达3-4年，难以满足日益膨胀的市场需要。采用桑黄液体发酵的方法生产桑黄药用活性成分因为具有生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。目前，国内外对桑黄菌丝体培养生产活性药用成分研究和工艺应用主要集中在发酵条件及产物提取分离等层面上，整体发酵水平不高。
叶酸(folate)属于水溶性维生素B族，是具有蝶酰谷氨酸分子结构的一类化合物的总称，又名蝶酰谷氨酸，维生素Bc、维生素M、维生素B11。叶酸的重要生理功用是作为一碳化合物的载体参加代谢活动。叶酸转化为四氢叶酸衍生物以辅酶形式作为一碳单位的载体，对转移甲基和利用甲酸基及甲醛都有重要功用。叶酸在核酸和蛋白质生物合成过程中也具有重要作用。由于人体内无法自主合成叶酸，几乎完全依赖于食物摄入，因此当摄入量不足或利用率降低时，体内便会出现叶酸缺乏的症状。近年的研究表明，叶酸缺乏与巨幼红细胞性贫血有关，还与儿童智力低下、神经管畸形、心脑血管疾病、某些癌症(如子宫颈癌、结肠癌、支气管癌和食管癌)等有关。叶酸缺乏可导致胎儿神经管畸形、巨幼红细胞性贫血，且与心血管疾病、老年性痴呆、直肠癌及子宫颈癌密切相关。膳食叶酸对人类至关重要，这是因为哺乳动物细胞不能合成叶酸，但组织的生长需要大量叶酸。植物和微生物可以合成叶酸，是膳食叶酸的重要来源，如植物中的甘蓝、柑橘、大麦、扁豆等。
基于叶酸对人体健康的重要程度不断增加，叶酸的开发与应用成为当今世界强化食品研究与开发的新热点。天然叶酸的主要来源是绿色植物的叶子、动物肝脏、蛋黄、大豆、小麦和以叶酸发酵产生的早餐谷物类及酵母当中。市售的叶酸以化学合成为主，但化学合成的叶酸和天然叶酸在人体内的代谢不尽相同，摄入过多的人工叶酸，会引起不良作用，比如减弱巨噬细胞的吞噬作用，甚至会促进部分癌细胞的生长。而微生物发酵产生的叶酸质量安全，不会给人体带来副作用。
发明内容
本发明提供了一种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法，该方法操作容易，转化率高，可明显提高发酵产物中叶酸含量。
本发明采用的技术方案是：
一种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法，包括步骤：
(1)食药真菌液体种子液制备：取活化后的桑黄菌种接种于添加黄连木提取物的桑黄液体种子培养基中培养3天-10天，得到桑黄液体菌种；取活化后的灵芝菌种接种于添加黄连木提取物的灵芝液体种子培养基中培养3天-10天，得到灵芝液体菌种；
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中的桑黄液体菌种按占胡萝卜固体发酵培养基体积8％-20％的用量接入胡萝卜固体发酵培养基中，在22℃-30℃下培养3天-15天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得胡萝卜固体培养物Ⅰ；所述的胡萝卜固体发酵培养基中含有胡萝卜和大麦；
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中的灵芝液体菌种按占液体发酵培养基体积4％-15％的用量先接入液体发酵培养基中，在22℃-28℃下培养1天-6天后，调pH值为4.0-6.8，升温至35℃-37℃并保持在该温度下2h-2.5h后，再接入占液体发酵培养基体积2％-12％的乳酸菌液体菌种培养6h-48h，终止发酵后，得到富含叶酸的食药真菌发酵产物；所述的液体发酵培养基含有胡萝卜固体培养物Ⅰ和甘蓝酶解物。
本发明根据胡萝卜、甘蓝传统富含叶酸果蔬原料特点及食药真菌桑黄、灵芝的发酵特性，利用食药真菌具有降解纤维素、果胶、淀粉等物质的酶系，可将纤维素、果胶等分解为更易被微生物利用的小分子碳源，提高了最终发酵产物中叶酸的含量。
所述的桑黄菌种可采用任意一种桑黄菌种，可采用市售产品。例如桑黄(Phellinus linteus)ACCC51181菌种，来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
所述的灵芝菌种可采用任意一种灵芝菌种，可采用市售产品。例如灵芝(Ganoderma lucidium)ACCC 51515菌种，来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
步骤(1)中，每升桑黄液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为1g-10g；每升灵芝液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为1g-10g。
所述的黄连木提取物可以选用市售产品，也可以采用现有方法制备；优选以黄连木树叶为原料制备的黄连木提取物，进一步优选由黄连木树叶乙醇提取物和黄连木树叶水提取物组成的黄连木提取物，可采用以下制备方法制备的黄连木提取物，包括：称取一定量的黄连木树叶，粉碎(优选过40目-100目)，先加占黄连木树叶重量10倍量-16倍量的质量百分浓度为60％-80％的乙醇水溶液在60℃-80℃浸提1h-2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅱ；上述醇提后的黄连木树叶残渣加入占黄连木树叶重量10倍量-20倍量的水在85℃-95℃下浸提1h-2.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积2倍量-5倍量的无水乙醇，离心收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅲ，合并上述提取物Ⅱ和提取物Ⅲ得黄连木提取物。
步骤(1)中，所述的活化后的桑黄菌种、活化后的灵芝菌种在添加黄连木提取物的液体种子培养基中培养的温度为自然环境温度，优选为20℃-30℃。一般1L添加黄连木提取物的液体种子培养基中接入1cm2-4cm2大小的活化后的桑黄菌种菌块或活化后的灵芝菌种菌块。
步骤(1)中，桑黄菌种、灵芝菌种的活化方法为本领域常规的菌种活化方法，包括：将斜面保藏的桑黄菌种、灵芝菌种分别接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22℃-30℃，培养时间3天-10天，分别得到活化后的桑黄菌种、活化后的灵芝菌种。
所述的PDA平板培养基和液体种子培养基均采用本领域种子培养常用的培养基，可采用市售产品。进一步优选，所述的PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g-20g，用水定容至1000mL。进一步优选，所述的桑黄液体种子培养基：葡萄糖5g-20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、KH2PO41g和MgSO40.5g，用水定容至1000mL。所述的灵芝液体种子培养基：葡萄糖8g-25g、酵母粉6g、蛋白胨6g、KH2PO41g和MgSO40.5g，用水定容至1000mL。
步骤(2)中，所述的胡萝卜固体发酵培养基优选由以下质量百分比的组分组成：K2HPO40.1％-0.2％、MgSO40.05％-0.1％、水40％-65％和余量的营养物质。所述的营养物质优选由以下质量百分比的组分组成：胡萝卜70％-90％和大麦10％-30％。
所述的胡萝卜固体发酵培养基的制备方法，包括：将新鲜胡萝卜在自来水下冲洗干净，晾干，切分为1cm-2cm长的片状或小块；将K2HPO4、MgSO4和营养物质充分搅拌均匀，加水，使固体培养基中水的质量百分比达到40％-65％，pH值自然，得到胡萝卜固体发酵培养基。
步骤(2)中，所述的固体发酵培养的温度为自然环境温度，优选为22℃-28℃。
步骤(3)中，所述的液体发酵培养基中含有2％-6％的胡萝卜固体培养物Ⅰ和0.05％-0.4％的甘蓝酶解物，％为质量百分比。进一步优选，所述的液体发酵培养基由以下质量百分比的组分组成：胡萝卜固体培养物Ⅰ2％-6％、葡萄糖1％-2％、甘蓝酶解物0.05％-0.4％、K2HPO40.1％-0.2％、MgSO40.05％-0.1％和余量的水。
所述的甘蓝酶解物优选甘蓝叶酶解物。所述的甘蓝叶酶解物的制备方法，包括：将甘蓝叶加水磨成浆液，灭酶；调节浆液pH至4.0-6.5，加入纤维素酶在45℃-55℃进行酶解反应0.5小时-1.5小时，灭酶后调节浆液pH至5.5-7.5，加入果胶酶在45℃-65℃进行酶解反应0.5小时-1.5小时，灭酶后离心，上清液经过滤、浓缩和干燥，得到甘蓝叶酶解物。
所述的纤维素酶与甘蓝叶的质量比优选为1：30-100。
所述的果胶酶与甘蓝叶的质量比优选为1：25-70。
所述的果胶酶的酶活力优选为3.0万U/g-5.0万U/g、纤维素酶的酶活力优选为2.0万U/g-3.0万U/g。
将甘蓝叶加水磨成浆液的步骤中，甘蓝叶与水的重量比优选为1:8至1:15。所述的甘蓝叶可选用采摘后经清洗、真空冷冻干燥后的甘蓝叶，也可直接选用市售的干燥甘蓝叶。
所述的灭酶的条件依据酶失活的条件，一般为：90℃-95℃下灭酶5分钟-8分钟。
所述的甘蓝叶酶解物的制备方法中，优选：上清液用截留分子量为1kDa-3.5kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，得到甘蓝叶酶解物。
所述的乳酸菌液体菌种可采用乳酸菌菌种在液体MRS培养基中于35℃-37℃静置培养6h-15h获得。所述的乳酸菌菌种可采用任意一种乳酸菌菌种，可采用市售产品；优选乳酸乳球菌乳亚种，如乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis)ACCC10535菌种，购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
所述的液体MRS培养基为乳酸菌培养常用的培养基，可采用市售产品，也可采用现有配制方法配制。一般液体MRS培养基的组成为：蛋白胨10.0g、牛肉浸膏10.0g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温-801.0ml、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g和蒸馏水1.0升。
本发明，调节pH值所用的pH值调节剂采用本领域常用的pH值调节剂，如1mol/L的HCl水溶液或1mol/L的磷酸水溶液。
本发明，所述的富含叶酸的食药真菌发酵产物经过后续的分离处理后可以测定叶酸含量。所述的分离处理为本领域常规的分离方法，例如离心或者过滤等分离方法。
本发明所用的培养基均需灭菌后使用，灭菌的条件采用本领域的常规条件，例如可在120℃-125℃下灭菌20min-30min。
黄连木(Pistacia chinensis Bunge)属于漆树科黄连木属落叶乔木，是一种兼具药用、材用、绿化及观赏价值的优良树种，也是一种极具开发潜力的能源植物。黄连木中的活性成分主要分为单宁、黄酮类、萜类、甾醇类及多不饱和脂肪酸等，这些成分多具有药用和营养价值。本发明优选黄连木的树叶。
胡萝卜(Daucus carota)是伞形科二年生草本植物的呈肉质的根，别名黄萝卜、丁香萝卜、葫芦菔金，又被称为胡芦菔、红菜头、黄萝卜等。
大麦(Hordeum vulgare L.)别名牟麦、饭麦、赤膊麦，为禾本科植物大麦的果实。
甘蓝(Brassica oleracea L.)为十字花科芸苔属的一年生或两年生草本植物。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1.通过微生物发酵生产叶酸，生产过程安全，有利于保护环境，且不受季节限制，可规模化生产；制成的叶酸产品，吸收利用率高，其生物效价高，可开发成叶酸功能食品(如口服液)等，营养丰富。
2.本发明根据胡萝卜、甘蓝传统富含叶酸果蔬原料特点及食药真菌桑黄、灵芝的发酵特性，利用食药真菌具有降解纤维素、果胶、淀粉等物质的酶系，可将纤维素、果胶等分解为更易被微生物利用的小分子碳源，通过采用先食药真菌发酵，后乳酸菌发酵的两阶段发酵，提高了最终发酵产物中叶酸的含量和活性。
3.本发明以来源广泛、价廉且富含叶酸的胡萝卜、甘蓝为主要培养原料，使其中的有益成分得到较好的转化，有利于叶酸的生成，是一种极具工业化前景的生产方法。
具体实施方式
下面结合部分具体实施例对本发明内容进行进一步阐明，但本发明的内容并不仅限于下面的实施例。
桑黄(Phellinus linteus)ACCC51181菌种购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
灵芝(Ganoderma lucidium)ACCC 51515菌种购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis)ACCC10535菌种购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
一、材料准备
果胶酶(酶活力为5.0万U/g)、纤维素酶(酶活力为3.0万U/g)，由广西庞博生物工程有限公司提供。
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
乳酸菌液体菌种采用乳酸乳球菌乳亚种菌种在液体MRS培养基中于37℃静置培养15h获得。
液体MRS培养基的组成为：蛋白胨10.0g、牛肉浸膏10.0g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温-801.0ml、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g和蒸馏水1.0升。
1L桑黄液体种子培养基组成为：葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。
1L灵芝液体种子培养基组成为：葡萄糖15g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。
a.甘蓝叶酶解物的制备，包括：将甘蓝叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加800mL水，磨成浆液，95℃灭酶5min，使各种酶失活；调节浆液pH5.5，加入1g纤维素酶在50℃进行酶解反应1.5小时，在95℃下灭酶5分钟；然后调节浆液pH6.5，加入1.5g果胶酶于55℃进行酶解反应1.5h，在95℃下灭酶5min，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为2kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得甘蓝叶酶解物。
b.黄连木提取物的制备，包括：称取一定量的黄连木树叶，粉碎过100目，先加占黄连木树叶重量13倍量的质量百分浓度为70％的乙醇水溶液在60℃浸提1.0h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅱ；上述醇提后的黄连木树叶残渣加入占黄连木树叶重量10倍量的蒸馏水在85℃下浸提1h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积2倍量的无水乙醇，5000rpm离心10min收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅲ，合并上述提取物Ⅱ和提取物Ⅲ得黄连木提取物。
c.将斜面保藏的桑黄菌种、灵芝菌种分别接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度25℃，培养时间8天，分别得到活化后的桑黄菌种、活化后的灵芝菌种。
二、富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法
(1)食药真菌液体种子液制备：取2cm2大小活化后的桑黄菌种菌块接种于1L添加黄连木提取物的桑黄液体种子培养基中，每升桑黄液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为8g，25℃培养4天，制备桑黄液体菌种。
取2cm2大小活化后的灵芝菌种菌块接种于1L添加黄连木提取物的灵芝液体种子培养基中，每升灵芝液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为6g，26℃培养5天，制备灵芝液体菌种。
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中的桑黄液体菌种按占胡萝卜固体发酵培养基体积15％的用量接入胡萝卜固体发酵培养基中，在25℃下培养12天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得胡萝卜固体培养物Ⅰ；
胡萝卜固体发酵培养基由以下质量百分比的组分组成：K2HPO40.15％、MgSO40.05％、水55％和余量的营养物质；营养物质由以下质量百分比的组分组成：胡萝卜80％和大麦20％。
胡萝卜固体发酵培养基的制备方法，包括：将新鲜胡萝卜在自来水下冲洗干净，晾干，切分为1cm-2cm长的片状或小块；将K2HPO4、MgSO4和营养物质充分搅拌均匀，加水，使固体培养基中水的质量百分比达到55％，pH值自然，得到胡萝卜固体发酵培养基。
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中的灵芝液体菌种按占液体发酵培养基体积10％的用量先接入液体发酵培养基中，25℃下培养3天后，用1mol/L的HCl水溶液将pH值调为5.5，升温至37℃并保持在该温度下2h后，再接入占液体发酵培养基体积8％的乳酸菌液体菌种培养24h，终止发酵后，得到富含叶酸的食药真菌发酵产物；
液体发酵培养基由以下质量百分比的组分组成：胡萝卜固体培养物Ⅰ4％、葡萄糖1.5％、甘蓝叶酶解物0.2％、K2HPO40.1％、MgSO40.05％和余量的水。
三、测定
叶酸含量的测定(高效液相色谱法)：将步骤(3)获得的食药真菌发酵产物经8000r/min离心10min得到上层澄清的发酵液，取上述10mL澄清的发酵液加入0.5mL缓冲液(浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液中加入质量分数为1％抗坏血酸钠)，50℃，搅拌提取1h；8000r/min离心10min；取上清液经0.45μm膜过滤，进行高效液相色谱分析。对照叶酸纯品的高效液相色谱标准曲线，计算叶酸含量。
HPLC色谱条件：C18柱(4.6mm×250mm)；流动相:甲醇:水(Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH 7.6)＝10:90，体积比；流速:1.5mL/min；柱温:25℃；检测波长:280nm；进样量:20μL。
检测结果见表1。
实施例2
一、材料准备
果胶酶(酶活力为4.0万U/g)、纤维素酶(酶活力为2.0万U/g)，由广西庞博生物工程有限公司提供。
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂20g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
乳酸菌液体菌种同实施例1。
1L桑黄液体种子培养基组成为：葡萄糖15g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。
1L灵芝液体种子培养基组成为：葡萄糖20g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。
a.甘蓝叶酶解物的制备，包括：将甘蓝叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加1000mL水，磨成浆液，90℃灭酶8min，使各种酶失活；调节浆液pH6.0，加入2g纤维素酶在55℃进行酶解反应1小时，在90℃下灭酶8分钟；然后调节浆液pH7.0，加入2g果胶酶于60℃进行酶解反应1h，在90℃下灭酶8min，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得甘蓝叶酶解物。
b.黄连木提取物的制备，包括：称取一定量的黄连木树叶，粉碎过60目，先加占黄连木树叶重量16倍量的质量百分浓度为80％的乙醇水溶液在80℃浸提2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅱ；上述醇提后的黄连木树叶残渣加入占黄连木树叶重量20倍量的蒸馏水在95℃下浸提2.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积5倍量的无水乙醇，5000rpm离心10min收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅲ，合并上述提取物Ⅱ和提取物Ⅲ得黄连木提取物。
c.将斜面保藏的桑黄菌种、灵芝菌种分别接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度28℃，培养时间6天，分别得到活化后的桑黄菌种、活化后的灵芝菌种。
二、富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法
(1)食药真菌液体种子液制备：取3cm2大小活化后的桑黄菌种菌块接种于1L添加黄连木提取物的桑黄液体种子培养基中，每升桑黄液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为7g，28℃培养8天，制备桑黄液体菌种。
取3cm2大小活化后的灵芝菌种菌块接种于1L添加黄连木提取物的灵芝液体种子培养基中，每升灵芝液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为7g，28℃培养8天，制备灵芝液体菌种。
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中的桑黄液体菌种按占胡萝卜固体发酵培养基体积12％的用量接入胡萝卜固体发酵培养基中，在28℃下培养10天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得胡萝卜固体培养物Ⅰ；
胡萝卜固体发酵培养基由以下质量百分比的组分组成：K2HPO40.15％、MgSO40.08％、水50％和余量的营养物质；营养物质由以下质量百分比的组分组成：胡萝卜80％和大麦20％。
胡萝卜固体发酵培养基的制备方法，包括：将新鲜胡萝卜在自来水下冲洗干净，晾干，切分为1cm-2cm长的片状或小块；将K2HPO4、MgSO4和营养物质充分搅拌均匀，加水，使固体培养基中水的质量百分比达到50％，pH值自然，得到胡萝卜固体发酵培养基。
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中的灵芝液体菌种按占液体发酵培养基体积8％的用量先接入液体发酵培养基中，28℃下培养5天后，用1mol/L的HCl水溶液将pH值调为6.0，升温至36℃并保持在该温度下2h后，再接入占液体发酵培养基体积6％的乳酸菌液体菌种培养30h，终止发酵后，得到富含叶酸的食药真菌发酵产物；
液体发酵培养基由以下质量百分比的组分组成：胡萝卜固体培养物Ⅰ5％、葡萄糖1.5％、甘蓝叶酶解物0.3％、K2HPO40.15％、MgSO40.08％和余量的水。
三、测定，同实施例1。
检测结果见表1。
实施例3
一、材料准备
果胶酶(酶活力为3.0万U/g)、纤维素酶(酶活力为3.0万U/g)，由广西庞博生物工程有限公司提供。
PDA平板培养基：同实施例1。
乳酸菌液体菌种采用乳酸乳球菌乳亚种菌种在液体MRS培养基中于35℃静置培养10h获得。液体MRS培养基同实施例1。
1L桑黄液体种子培养基组成为：葡萄糖20g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。
1L灵芝液体种子培养基组成为：葡萄糖25g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。
a.甘蓝叶酶解物的制备，包括：将甘蓝叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加1200mL水，磨成浆液，95℃灭酶8min，使各种酶失活；调节浆液pH5.0，加入1.5g纤维素酶在45℃进行酶解反应0.5小时，在90℃下灭酶8分钟；然后调节浆液pH6.0，加入3g果胶酶于45℃进行酶解反应0.5h，在90℃下灭酶8min，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为3.5kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得甘蓝叶酶解物。
b.黄连木提取物的制备，包括：称取一定量的黄连木树叶，粉碎过40目，先加占黄连木树叶重量10倍量的质量百分浓度为60％的乙醇水溶液在70℃浸提1.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅱ；上述醇提后的黄连木树叶残渣加入占黄连木树叶重量15倍量的蒸馏水在90℃下浸提1.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积4倍量的无水乙醇，5000rpm离心10min收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅲ，合并上述提取物Ⅱ和提取物Ⅲ得黄连木提取物。
c.将斜面保藏的桑黄菌种、灵芝菌种分别接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22℃，培养时间10天，分别得到活化后的桑黄菌种、活化后的灵芝菌种。
二、富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法
(1)食药真菌液体种子液制备：取4cm2大小活化后的桑黄菌种菌块接种于1L添加黄连木提取物的桑黄液体种子培养基中，每升桑黄液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为10g，22℃培养10天，制备桑黄液体菌种。
取4cm2大小活化后的灵芝菌种菌块接种于1L添加黄连木提取物的灵芝液体种子培养基中，每升灵芝液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为1g，30℃培养3天，制备灵芝液体菌种。
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中的桑黄液体菌种按占胡萝卜固体发酵培养基体积18％的用量接入胡萝卜固体发酵培养基中，在22℃下培养7天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得胡萝卜固体培养物Ⅰ；
胡萝卜固体发酵培养基由以下质量百分比的组分组成：K2HPO40.2％、MgSO40.1％、水40％和余量的营养物质；营养物质由以下质量百分比的组分组成：胡萝卜90％和大麦10％。
胡萝卜固体发酵培养基的制备方法，包括：将新鲜胡萝卜在自来水下冲洗干净，晾干，切分为1cm-2cm长的片状或小块；将K2HPO4、MgSO4和营养物质充分搅拌均匀，加水，使固体培养基中水的质量百分比达到40％，pH值自然，得到胡萝卜固体发酵培养基。
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中的灵芝液体菌种按占液体发酵培养基体积12％的用量先接入液体发酵培养基中，22℃下培养6天后，用1mol/L的HCl水溶液将pH值调为5.0，升温至35℃并保持在该温度下2.5h后，再接入占液体发酵培养基体积10％的乳酸菌液体菌种培养40h，终止发酵后，得到富含叶酸的食药真菌发酵产物；
液体发酵培养基由以下质量百分比的组分组成：胡萝卜固体培养物Ⅰ6％、葡萄糖1％、甘蓝叶酶解物0.4％、K2HPO40.2％、MgSO40.1％和余量的水。
三、测定，同实施例1。
检测结果见表1。
实施例4
一、材料准备
果胶酶、纤维素酶和PDA平板培养基，均同实施例1。
乳酸菌液体菌种采用乳酸乳球菌乳亚种菌种在液体MRS培养基中于36℃静置培养6h获得。液体MRS培养基同实施例1。
1L桑黄液体种子培养基组成为：葡萄糖5g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。
1L灵芝液体种子培养基组成为：葡萄糖8g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。
a.甘蓝叶酶解物的制备，包括：将甘蓝叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加1500mL水，磨成浆液，95℃灭酶8min，使各种酶失活；调节浆液pH6.5，加入2.5g纤维素酶在50℃进行酶解反应1小时，在90℃下灭酶8分钟；然后调节浆液pH7.5，加入4g果胶酶于65℃进行酶解反应1h，在90℃下灭酶8min，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为1kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得甘蓝叶酶解物。
b.黄连木提取物同实施例1。
c.将斜面保藏的桑黄菌种、灵芝菌种分别接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度30℃，培养时间3天，分别得到活化后的桑黄菌种、活化后的灵芝菌种。
二、富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法
(1)食药真菌液体种子液制备：取1cm2大小活化后的桑黄菌种菌块接种于1L添加黄连木提取物的桑黄液体种子培养基中，每升桑黄液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为1g，30℃培养3天，制备桑黄液体菌种。
取1cm2大小活化后的灵芝菌种菌块接种于1L添加黄连木提取物的灵芝液体种子培养基中，每升灵芝液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为10g，22℃培养10天，制备灵芝液体菌种。
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中的桑黄液体菌种按占胡萝卜固体发酵培养基体积20％的用量接入胡萝卜固体发酵培养基中，在30℃下培养3天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得胡萝卜固体培养物Ⅰ；
胡萝卜固体发酵培养基由以下质量百分比的组分组成：K2HPO40.1％、MgSO40.1％、水65％和余量的营养物质；营养物质由以下质量百分比的组分组成：胡萝卜70％和大麦30％。
胡萝卜固体发酵培养基的制备方法，包括：将新鲜胡萝卜在自来水下冲洗干净，晾干，切分为1cm-2cm长的片状或小块；将K2HPO4、MgSO4和营养物质充分搅拌均匀，加水，使固体培养基中水的质量百分比达到65％，pH值自然，得到胡萝卜固体发酵培养基。
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中的灵芝液体菌种按占液体发酵培养基体积15％的用量先接入液体发酵培养基中，28℃下培养1天后，用1mol/L的HCl水溶液将pH值调为6.8，升温至37℃并保持在该温度下2.5h后，再接入占液体发酵培养基体积12％的乳酸菌液体菌种培养48h，终止发酵后，得到富含叶酸的食药真菌发酵产物；
液体发酵培养基由以下质量百分比的组分组成：胡萝卜固体培养物Ⅰ2％、葡萄糖2％、甘蓝叶酶解物0.1％、K2HPO40.2％、MgSO40.1％和余量的水。
三、测定，同实施例1。
检测结果见表1。
实施例5
一、材料准备
果胶酶、纤维素酶、PDA平板培养基、乳酸菌液体菌种、桑黄液体种子培养基和灵芝液体种子培养基，均同实施例4。
a.甘蓝叶酶解物的制备，包括：将甘蓝叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加1500mL水，磨成浆液，95℃灭酶8min，使各种酶失活；调节浆液pH4.0，加入3.3g纤维素酶在50℃进行酶解反应1小时，在90℃下灭酶8分钟；然后调节浆液pH5.5，加入4g果胶酶于50℃进行酶解反应1h，在90℃下灭酶8min，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为2kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得甘蓝叶酶解物。
b.黄连木提取物同实施例1。
c.活化后的桑黄菌种、活化后的灵芝菌种，同实施例4。
二、富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法
(1)食药真菌液体种子液制备：取2cm2大小活化后的桑黄菌种菌块接种于1L添加黄连木提取物的桑黄液体种子培养基中，每升桑黄液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为2g，20℃培养9天，制备桑黄液体菌种。
取3cm2大小活化后的灵芝菌种菌块接种于1L添加黄连木提取物的灵芝液体种子培养基中，每升灵芝液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为9g，20℃培养6天，制备灵芝液体菌种。
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中的桑黄液体菌种按占胡萝卜固体发酵培养基体积8％的用量接入胡萝卜固体发酵培养基中，在22℃下培养15天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得胡萝卜固体培养物Ⅰ；
胡萝卜固体发酵培养基，同实施例4。
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中的灵芝液体菌种按占液体发酵培养基体积4％的用量先接入液体发酵培养基中，26℃下培养2天后，用1mol/L的磷酸水溶液将pH值调为4.0，升温至37℃并保持在该温度下2h后，再接入占液体发酵培养基体积2％的乳酸菌液体菌种培养6h，终止发酵后，得到富含叶酸的食药真菌发酵产物；
液体发酵培养基由以下质量百分比的组分组成：胡萝卜固体培养物Ⅰ2％、葡萄糖2％、甘蓝叶酶解物0.05％、K2HPO40.2％、MgSO40.1％和余量的水。
三、测定，同实施例1。
检测结果见表1。
对照例
乳酸菌液体菌种同实施例1。
(1)摇瓶种子培养
1L液体种子培养基：葡萄糖15g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量为水。pH自然，在121℃下灭菌20min。
将实施例1中活化后的灵芝菌种取2cm2大小的菌块接入灭菌后1L液体种子培养基中，26℃，120r/min下摇床培养5天，得到培养好的灵芝液体菌种。
(2)液体发酵培养：将步骤(1)中的灵芝液体菌种按占灵芝液体发酵培养基体积10％的接种量接入灵芝液体发酵培养基中，在25℃，120r/min摇床中培养3天后，用1mol/L的HCl水溶液将pH值调为5.5，升温至37℃并保持在该温度下2h后，接入占灵芝液体发酵培养基体积8％的乳酸菌液体菌种培养24h，终止发酵后，得到食药真菌发酵产物；
1L灵芝液体发酵培养基组成为：葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然，在121℃下灭菌20min。
检测结果见表1。
表1发酵液中叶酸含量检测结果
注：与对照例比较，Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01。
本发明根据胡萝卜、甘蓝传统富含叶酸果蔬原料特点及食药真菌桑黄、灵芝的发酵特性，利用食药真菌具有降解纤维素、果胶、淀粉等物质的酶系，可将纤维素、果胶等分解为更易被微生物利用的小分子碳源，通过采用先食药真菌发酵，后乳酸菌发酵的两阶段发酵，提高了最终发酵产物中叶酸的含量。
与对照例相比，采用本发明方法发酵培养的代谢产物中叶酸产量提高了39.9％-43.9％。
在本发明制备方法限定的范围内各参数的变化并不影响富含叶酸发酵产物中叶酸的产量，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现富含叶酸食药真菌发酵产物中叶酸含量的提高。在此不再赘述。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种富含叶酸食药真菌发酵产物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)食药真菌液体种子液制备：取活化后的桑黄菌种接种于添加黄连木提取物的桑黄液体种子培养基中培养3天-10天，得到桑黄液体菌种；取活化后的灵芝菌种接种于添加黄连木提取物的灵芝液体种子培养基中培养3天-10天，得到灵芝液体菌种；
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中的桑黄液体菌种按占胡萝卜固体发酵培养基体积8％-20％的用量接入胡萝卜固体发酵培养基中，在22℃-30℃下培养3天-15天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得胡萝卜固体培养物Ⅰ；所述的胡萝卜固体发酵培养基中含有胡萝卜和大麦；
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中的灵芝液体菌种按占液体发酵培养基体积4％-15％的用量先接入液体发酵培养基中，在22℃-28℃下培养1天-6天后，调pH值为4.0-6.8，升温至35℃-37℃并保持在该温度下2h-2.5h后，再接入占液体发酵培养基体积2％-12％的乳酸菌液体菌种培养6h-48h，终止发酵后，得到富含叶酸的食药真菌发酵产物；所述的液体发酵培养基含有胡萝卜固体培养物Ⅰ和甘蓝酶解物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，每升桑黄液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为1g-10g；每升灵芝液体种子培养基中黄连木提取物的添加量为1g-10g。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的黄连木提取物为以黄连木树叶为原料制备的黄连木提取物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的黄连木提取物由黄连木树叶醇提取物和黄连木树叶水提取物组成。
5.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，所述的黄连木提取物的制备方法，包括：称取一定量的黄连木树叶，粉碎，先加占黄连木树叶重量10倍量-16倍量的质量百分浓度为60％-80％的乙醇水溶液在60℃-80℃浸提1h-2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅱ；上述醇提后的黄连木树叶残渣加入占黄连木树叶重量10倍量-20倍量的水在85℃-95℃下浸提1h-2.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积2倍量-5倍量的无水乙醇，离心收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅲ，合并上述提取物Ⅱ和提取物Ⅲ得黄连木提取物。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的胡萝卜固体发酵培养基由以下质量百分比的组分组成：K2HPO40.1％-0.2％、MgSO40.05％-0.1％、水40％-65％和余量的营养物质；所述的营养物质由以下质量百分比的组分组成：胡萝卜70％-90％和大麦10％-30％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的液体发酵培养基中含有2％-6％的胡萝卜固体培养物Ⅰ和0.05％-0.4％的甘蓝酶解物，％为质量百分比。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的液体发酵培养基由以下质量百分比的组分组成：胡萝卜固体培养物Ⅰ2％-6％、葡萄糖1％-2％、甘蓝酶解物0.05％-0.4％、K2HPO40.1％-0.2％、MgSO40.05％-0.1％和余量的水。
9.根据权利要求1或7所述的制备方法，其特征在于，所述的甘蓝酶解物为甘蓝叶酶解物。
10.根据权利要求1或7所述的制备方法，其特征在于，所述的甘蓝酶解物的制备方法，包括：将甘蓝叶加水磨成浆液，灭酶；调节浆液pH至4.0-6.5，加入纤维素酶在45℃-55℃进行酶解反应0.5小时-1.5小时，灭酶后调节浆液pH至5.5-7.5，加入果胶酶在45℃-65℃进行酶解反应0.5小时-1.5小时，灭酶后离心，上清液经过滤、浓缩和干燥，得到甘蓝叶酶解物。
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