CN104372061B - 一种富锌桑黄液体发酵产物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富锌桑黄液体发酵产物的制备方法，包括：将活化的桑黄菌种接种于添加有富锌酵母和分心木提取物的液体种子培养基中，辅以在一定频率和强度的低频超声波中快速培养，再将桑黄液体菌种接入添加有富锌酵母和星油藤叶酶解物的液体发酵培养基中，辅以在一定频率和强度的极低频磁场中培养得富锌桑黄液体发酵产物。本发明通过种子液和发酵两阶段的低频超声波和极低频磁场中物理辅助协同发酵，以及分心木提取物、星油藤叶酶解物等外源添加物的协同作用，大幅度提高了最终桑黄发酵产物中有机锌、锌多糖的含量和活性。

Description

一种富锌桑黄液体发酵产物的制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种富锌桑黄液体发酵产物的制备方法。

背景技术

桑黄(Phellinus igniarius)属担子菌亚门，层孔菌纲，锈革孔菌科，针层孔菌属。桑黄菌提取物在抑制癌细胞转移和防止癌症手术后复发等的临床应用中具有显著效果，是目前国际公认的生物治癌药剂中有效率最高的一种药用真菌。作为目前国际公认的抗癌效果最好的大型药用真菌，桑黄抑制肿瘤的研究主要集中在药理活性成分桑黄多糖上。

锌是微量元素的一种，在人体内的含量以及每天所需摄入量都很少，但对机体的性发育、性功能、生殖细胞的生成却能起到举足轻重的作用，故有“生命的火花”与“婚姻和谐素”之称。人体正常含锌量为2-3克。绝大部分组织中都有极微量的锌分布，其中肝脏、肌肉和骨骼中含量较高。锌是体内数十种酶的主要成分；锌还与大脑发育和智力有关。人体的睾丸、前列腺、精液当中，都含有高浓度的锌。当人体内锌的含量缺乏时，性功能会因此而低下，合成睾丸素酶发生紊乱，男子将会引起阳痿和脸上生长痤疮。锌对激发精子活动有着特殊的作用，缺锌会造成精子活动力的下降。长期处于缺锌状态而未能及时补充，可出现精子数量明显减少、睾丸萎缩，最后导致不育。

据报道，食用菌对锌元素的富集转化作用较强，是锌元素的优良载体生物。目前已有报道，多种食药真菌对锌具有富集作用且富锌后其药理活性增强。

中国专利ZL200810157380.4公开了一种富锌蛹虫草菌丝体的人工培养方法及其培养基，其培养基配方重量比组分为：葡萄糖1.0％-3.0％，蛋白胨0.5％-1.0％，酵母提取物0.1％-1.0％，琼脂粉1.0％-2.0％，水余量，其pH值为5.0-7.5，其人工培养方法包括试管斜面菌种培养(活化)→试管液体菌种培养→三角瓶液体种子培养→种子罐培养→发酵罐培养→板框过滤→粉碎→真空干燥→粉碎→粉末状菌丝体步骤。其操作简单，培养周期短，菌丝体产率高，无污染无废弃物，具有补锌功能，可以进行工厂化生产。

中国专利ZL200610098121.X公开了一种富锌亮菌多糖，由亮菌在富含锌的液体培养基中经静态发酵培养制备的富锌亮菌菌索中提取得到的多糖，为无定形灰色粉末，提取率达14％，其多糖含量75％-80％，有机锌含量105-135mg/g。实验结果表明，本多糖无毒，能促进受辐射损伤的造血系统和免疫系统功能的恢复，具有抗辐射作用，可应用于制备抗辐射药品或保健食品。

上述技术一般仅单一采用液态发酵方式，简单地模仿常规食药用菌菌丝体发酵的方式，以蛋白胨、酵母提取物为氮源，以蔗糖、葡萄糖或玉米粉为主要碳源，在培养基中添加硫酸锌等无机锌为主的锌源。由于食药用菌液体培养时间有限，无机锌等一般不容易被菌丝体吸收，导致发酵液中的有机锌、锌多糖等有效组分含量不高。

目前在生物技术领域的科研与生产上，生活细胞，无论是自养细胞还是异养细胞，其人工培养的控制条件大都集中在培养基组成、温度、通(空)气、酸碱度、氧化还原电位、离子浓度等。利用这些传统的控制因子研究各种生活细胞的培养技术以获得目的次生代谢产物一直是生物技术领域的研究热点。

然而，生活细胞生长与次生代谢的调控因子远远不止这些。大量的科学研究证明：生物细胞的营养生长和次生代谢产物积累都受到特定波长或频率的电磁波等的调节，例如：一定频率和功率的超声波可以激活细胞并对生活细胞生长与代谢具有积极的促进作用、特殊波长的光源会有效地调节生活细胞某些特殊的代谢途径而导致一些生物活性物质的积累、一定强度的磁场可以促进生活细胞的生长与代谢。

对生活细胞具有显著调控效应的这些物理因子可用于提高工业化生产人类需要的生物活性物质或者药物的效率。由于不同波长的电磁波都具备一定的能量和频率，且只能被生活细胞内某些特殊的波敏色素或者其它波敏物质(如某些辅酶或者非酶蛋白质受体)吸收而使基因表达或相应的代谢网络发生变化，由此引起某些特定的次生代谢产物表达量增加。或者超声波引起的机械振动和高速传质而促进细胞代谢和次生代谢产物的分泌。或者磁场引起生物大分子的氢键磁性和能量变化而导致生物大分子(酶)的活性增强。

目前国内外关于以特定低频率磁场和低频率超声波为主辅助提高桑黄发酵富锌产物产量及活性的方法还没有相应的报道。

发明内容

本发明为了解决现有技术所存在的技术问题，提供了一种富锌桑黄液体发酵产物的制备方法，该方法通过外源添加物以及低频率磁场和低频率超声波辅助提高桑黄发酵富锌产物产量及活性，可明显提高有机锌和锌多糖含量和活性，具有安全可靠的特点。

本发明采用的技术方案是：

一种富锌桑黄液体发酵产物的制备方法，包括步骤：

(1)富锌桑黄液体种子液制备：将活化后的桑黄菌种接入液体种子培养基中进行桑黄液体种子培养，在桑黄液体种子培养第1天-第4天，将培养基置于低频超声环境中，超声波频率为10KHz-100KHz，超声波强度控制在0.1W/cm³-0.9W/cm³，22℃-28℃恒温，保持120r/min-150r/min振荡培养1天-8天后，得到富锌桑黄液体种子液；所述的液体种子培养基中含有富锌酵母和分心木提取物；

(2)富锌桑黄的液体发酵培养：将步骤(1)中的富锌桑黄液体种子液按占液体发酵培养基体积5％-20％的用量接入液体发酵培养基中进行桑黄液体发酵培养，在桑黄液体发酵培养第2天-第4天，将液体发酵培养基置于极低频交变磁场环境中，磁场强度0.4mT-5mT，交变磁场频率5Hz-50Hz，22℃-28℃恒温，保持140r/min-160r/min振荡培养2天-5天后，得到富锌桑黄发酵产物；所述的液体发酵培养基中含有富锌酵母和星油藤叶酶解物。

本发明根据药用真菌桑黄的发酵培养和富锌特性，在种子液培养阶段让菌体细胞暴露在一定频率和强度的低频超声波中培养，在发酵阶段让菌体细胞暴露在一定频率和强度的极低频磁场中利于有机锌元素的转化和桑黄锌多糖的合成，通过种子液和发酵两阶段的低频超声波和极低频磁场中物理辅助协同发酵，以及分心木提取物、星油藤叶酶解物等外源添加物的协同作用，大幅度提高了最终桑黄发酵产物中有机锌、锌多糖的含量和活性。

所述的桑黄菌种可采用任意一种桑黄菌种，可采用市售产品。例如桑黄(Phellinus linteus)ACCC51181菌种购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。

为了达到更好的发明效果，进行以下优选：

步骤(1)中，所述的液体种子培养基中基础物质采用液体种子培养基常用的基础物质，如葡萄糖、KH₂PO₄、MgSO₄等。所述的液体种子培养基优选含有富锌酵母0.04％-0.4％和分心木提取物0.05％-0.4％，％为质量百分比。进一步优选，所述的液体种子培养基质量百分比组成为：葡萄糖1％-2％、富锌酵母0.04％-0.4％、分心木提取物0.05％-0.4％、KH₂PO₄0.1％-0.2％、MgSO₄0.05％-0.1％和余量的水。

所述的分心木提取物可以选用市售产品，例如西安昌岳植物化工有限公司生产的分心木提取物等，也可以采用现有制备方法制备，优选采用以下制备方法制备的分心木提取物，包括：称取一定量的分心木，粉碎(优选过40目-100目)，先加占分心木重量10倍量-16倍量的质量百分浓度为60％-80％的乙醇水溶液在60℃-80℃浸提1h-2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅰ；上述醇提后的分心木残渣加入占分心木重量10倍量-20倍量的水在85℃-95℃下浸提1h-2.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积2倍量-5倍量的无水乙醇，离心收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ，合并上述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得分心木提取物。

所述的桑黄液体种子培养的温度为自然环境温度，优选为20℃-30℃。一般1L液体种子培养基中接入2cm²-5cm²大小的活化后的桑黄菌种菌块。

步骤(1)中，桑黄菌种的活化方法为本领域常规的菌种活化方法，包括：将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22℃-30℃，培养时间4天-10天，得到活化后的桑黄菌种。

所述的PDA平板培养基采用本领域种子培养常用的培养基，可采用市售产品。进一步优选，所述的PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g-20g，用水定容至1000mL。

步骤(2)中，所述的液体发酵培养基中基础物质采用液体发酵培养基常用的基础物质，如葡萄糖、KH₂PO₄、MgSO₄等。所述的液体发酵培养基优选含有富锌酵母0.04％-0.4％和星油藤叶酶解物0.05％-0.4％，％为质量百分比。进一步优选，所述的液体发酵培养基质量百分比组成为：葡萄糖1％-2.5％、富锌酵母0.04％-0.4％、星油藤叶酶解物0.05％-0.4％、KH₂PO₄0.1％-0.2％、MgSO₄0.05％-0.1％和余量的水。

所述的桑黄液体发酵培养的温度为自然环境温度，优选为20℃-30℃。

所述的星油藤叶酶解物的制备方法，包括：将星油藤叶加水磨成浆液，灭酶；调节浆液pH4.0-5.5，加入由纤维素酶和果胶酶构成的第一复合酶，在40℃-50℃进行酶解反应0.5小时-1.5小时，灭酶后调节浆液pH5.0-7.0，加入由木瓜蛋白酶和中性蛋白酶构成的第二复合酶，于50℃-60℃进行酶解反应1小时-1.5小时，灭酶后离心，上清液经过滤、浓缩和干燥，得到星油藤叶酶解物。

所述的第一复合酶与星油藤叶的质量比优选为1：30-50。

所述的第二复合酶与星油藤叶的质量比优选为1：25-60。

所述的纤维素酶与果胶酶的质量比优选为1:2至4:1。

所述的木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的质量比优选为1:3至2:1。

所述的中性蛋白酶的酶活力优选为20.0万U/g-30.0万U/g、木瓜蛋白酶的酶活力优选为100.0万U/g-200.0万U/g、果胶酶的酶活力优选为3.0万U/g-5.0万U/g、纤维素酶的酶活力优选为2.0万U/g-3.0万U/g。

将星油藤叶加水磨成浆液的步骤中，星油藤叶与水的重量比优选为1:3-6。所述的星油藤叶可选用采摘后经清洗、真空冷冻干燥后的星油藤叶，也可直接选用市售的干燥星油藤叶。

所述的灭酶的条件依据酶失活的条件，一般为：90℃-95℃下灭酶5分钟-8分钟。

所述的星油藤叶酶解物的制备方法中，优选：上清液用截留分子量为1kDa-3kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，得到星油藤叶酶解物。

本发明所用的培养基均需灭菌、冷却后使用，灭菌的条件采用本领域的常规条件，例如可在120℃-125℃下灭菌20min-30min。

富锌酵母集有机锌生物活性和酵母本身丰富的营养为一体，含有丰富的蛋白质和矿物质等营养因子。所述的富锌酵母可以选用市售产品，例如浙江深友生物技术有限公司生产的富锌酵母等，也可以采用现有制备方法制备，优选采用以下制备方法制备的富锌酵母，包括：将活性的酵母斜面菌种接种到液体培养基中，20℃-28℃发酵培养10h-24h，发酵终止后离心过滤，将沉淀真空冷冻干燥得富锌酵母。其中，所述的液体培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖1％-2.5％、麦芽汁3％-8％、尿素0.1％-0.4％、KH₂PO₄0.1％-0.2％、ZnSO₄0.006％-0.04％和余量的水。即每1kg液体培养基中硫酸锌(ZnSO₄)的用量为60mg-400mg。所述的酵母可采用市售产品，优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 20037购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。

本发明中，所述的富锌酵母中锌含量优选为400mg/kg-1000mg/kg，即每千克富锌酵母中锌含量为400mg-1000mg。

本发明，所述的富锌桑黄发酵产物经过后续的分离处理可以得到桑黄锌多糖。所述的分离处理为本领域常规的分离方法，例如过滤或离心；可包括：将所述的富锌桑黄发酵产物用多层纱布过滤，从过滤所得菌丝体中提取桑黄锌多糖。具体的提取步骤包括：将菌丝体用水冲洗干净，在55℃-65℃干燥至恒重，粉碎得到菌丝体干粉，将菌丝体干粉按料液质量比1:10-15加入水，90℃-95℃浸提3h-3.5h，提取两次，合并提取液过滤收集滤液，50℃-55℃下减压浓缩，向浓缩液中加入占浓缩液体积4倍量-5倍量的无水乙醇，隔夜醇沉，离心，沉淀即为桑黄锌多糖。

分心木(Semen Juglandis.)，为胡桃科植物胡桃JuglansregiaL.果核内的干燥木质隔膜，别名胡桃衣，胡桃夹，胡桃隔，核桃芯。味苦涩，性平，无毒。

星油藤(Plukenetia volubilis L.)，又名南美油藤、印加果、印加花生，为大戟科多年生木质藤本植物，原生长在南美洲安第斯山脉的热带雨林中。星油藤种子含油量为30％-60％，主要由多元不饱和脂肪酸组成，其含量可达90％以上，明显高于其他油料作物。其多元不饱和脂肪酸以Omega(ω)脂肪酸为主，要高于大豆、花生、油菜及亚麻等传统油料作物。其中，亚麻酸含量为45.2％-52.51％，要远远高于大豆油和花生油中亚麻酸的含量。由于星油藤油组成成分优良、营养品质高，被认为是世界上最好的植物油之一。本发明选用星油藤的叶，即星油藤叶。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明根据药用真菌桑黄的发酵培养和富锌特性，在种子培养阶段让菌体细胞暴露在一定频率和强度的低频超声波中培养，在发酵阶段让菌体细胞暴露在一定频率和强度的极低频磁场中利于有机锌元素的转化和桑黄锌多糖的合成，通过种子液和发酵两阶段的低频超声波和极低频磁场中物理辅助协同发酵，以及分心木提取物、星油藤叶酶解物等外源添加物的协同作用，大幅度提高了最终桑黄发酵产物中有机锌、锌多糖的含量和活性。

(2)培养基中的富锌酵母在起到补充氮源的作用同时，还是锌的来源。传统的富锌食药用菌菌丝体在形成过程中，锌的来源是无机态的氧化锌，发酵时要将培养基中的无机锌吸收后转化为有机锌，这个过程中锌不易为菌丝体所吸收。而富锌酵母携带的锌元素是有机锌的形态，又更容易为菌丝体吸收，通过桑黄菌丝细胞内物质的代谢，将底物中的锌结合到大分子上转化为有机锌多糖和锌蛋白，从而发挥锌和桑黄固有的协同生理作用。

具体实施方式

下面结合部分具体实施例对本发明内容进行进一步阐明，但本发明的内容并不仅限于下面的实施例。

桑黄(Phellinus linteus)ACCC51181菌种购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 20037购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。

实施例1

一、材料准备

中性蛋白酶(酶活力为20.0万U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力为100.0万U/g)、果胶酶(酶活力为5.0万U/g)、纤维素酶(酶活力为3.0万U/g)，由广西庞博生物工程有限公司提供。

PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000mL，自然pH，在121℃下灭菌20min。

将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度25℃，培养时间7天，得到活化后的桑黄菌种。

外源添加物的制备：

a.星油藤叶酶解物的制备：将采摘的星油藤叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加500mL水，磨成浆液，95℃灭菌5min，使各种酶失活；调节浆液pH5.0，加入由1g纤维素酶和1g果胶酶构成的复合酶，在45℃进行酶解反应1.0小时，在95℃下灭酶6分钟；然后调节浆液pH6.0，加入由1.75g木瓜蛋白酶和1.75g中性蛋白酶构成的复合酶，于55℃进行酶解反应1.5h，在95℃下灭酶5分钟，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为1kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得星油藤叶酶解物。

b.分心木提取物的制备：称取一定量的分心木，粉碎过40目，先加占分心木重量10倍量的质量百分浓度60％的乙醇水溶液在60℃浸提1.0h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅰ；上述醇提后的分心木残渣加入占分心木重量10倍量的蒸馏水在85℃下浸提1h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积2倍量的无水乙醇，5000rpm离心10min收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ，合并上述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得分心木提取物。

c.富锌酵母的制备：将活性的酵母斜面菌种接种到液体培养基中，25℃发酵培养18h，发酵终止后离心过滤，将沉淀真空冷冻干燥得富锌酵母，富锌酵母中锌含量为1000mg/kg。其中，液体培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖2.5％、麦芽汁3％、尿素0.4％、KH₂PO₄0.1％、ZnSO₄0.04％和余量的水。即每1kg液体培养基中ZnSO₄的用量为400mg。

二、富锌桑黄发酵产物的制备

(1)富锌桑黄液体种子液制备：取2cm²大小活化后的桑黄菌种的菌块接入1L液体种子培养基中于28℃进行桑黄液体种子培养，在桑黄液体种子培养第2天，将培养基置于低频超声环境中，超声波频率为65KHz，超声波强度控制在0.4W/cm³，28℃恒温，保持120r/min振荡培养3天后，得到富锌桑黄液体种子液；

液体种子培养基质量百分比组成为：葡萄糖2％、富锌酵母0.24％、分心木提取物0.1％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄0.05％和余量的水。

(2)富锌桑黄的液体发酵培养：将步骤(1)中的富锌桑黄液体种子液按占液体发酵培养基体积10％的用量接入液体发酵培养基中于28℃进行桑黄液体发酵培养，在桑黄液体发酵培养第3天，将液体发酵培养基置于极低频交变磁场环境中，磁场强度3mT，交变磁场频率5Hz，28℃恒温，保持140r/min振荡培养5天后，得到富锌桑黄发酵产物；

液体发酵培养基质量百分比组成为：葡萄糖2％、富锌酵母0.4％、星油藤叶酶解物0.2％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄0.05％和余量的水。

三、测定

(1)菌丝生物量的测定

富锌桑黄发酵产物经8层纱布过滤，菌丝体用蒸馏水冲洗3次，然后置60℃烘箱中烘干至恒重，称重。

(2)锌多糖含量的测定

称取适量菌丝体干粉，置于烧杯中，按料液比1:10(质量比)加入蒸馏水，90℃浸提3h，提取两次，减压过滤收集滤液，50℃下减压浓缩，浓缩液加入占浓缩液体积4倍量的无水乙醇，隔夜醇沉，3000r/min、20min离心后，沉淀即为粗多糖。将沉淀用蒸馏水定容至50mL，用苯酚-硫酸法测定发酵液中多糖含量，重复测定3次求平均值，即锌多糖含量。

(3)锌的测定方法：参照GB/T5009.14-2003食品中锌的测定方法。

(4)锌多糖对DPPH自由基清除能力的测定

取2mL 5mg/mL待测样品于试管中，加入2mL 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液(用质量百分浓度95％乙醇水溶液配制)，充分摇匀，室温静置35min，在517nm波长处测定吸光值。以维生素C(V_C)为对照，每组做3个重复，求其平均值。计算公式如下:

式中，A₁：加入样品后的吸光值；A₂：样品本底吸光值；A₀：空白吸光值。

(5)锌多糖对超氧阴离子自由基清除能力的测定

采用邻苯三酚自氧化法。取Tris－HCl缓冲溶液4.5mL，在25℃恒温水浴中保温20min，加入邻苯三酚(25℃预热)，快速振荡混匀，在325nm波长下，每隔0.5min记录一次值，连续记录3min。样品在同样条件下测定吸光值。以V_C为对照，每组做3个重复，求其平均值。计算公式如下:

式中，A₁：加入样品后的吸光值；A₂：样品本底吸光值；A₀：空白吸光值。

(6)锌多糖对羟自由基(.OH)清除能力的测定

利用Fenton反应产生的羟基自由基可氧化水杨酸，使水杨酸产生有色物质，在510nm处有强吸收峰。于2mL 5mg/mL待测样品水溶液中加入2mL FeSO₄水溶液(6mmol/L)、2mL H₂O₂(6mmol/L)水溶液，充分摇匀，静置10min。加入6mmol/L的水杨酸水溶液2mL，充分摇匀，静置30min，在510nm处测定其吸光度值。以V_C作阳性对照，每个处理试样均做三个平行实验。

计算公式如下:

式中，A₁：加入样品后的吸光值；A₂：样品本底吸光值；A₀：空白吸光值。

检测结果见表1-表2。

实施例2

一、材料准备

中性蛋白酶(酶活力为30.0万U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力为200.0万U/g)、果胶酶(酶活力为3.0万U/g)、纤维素酶(酶活力为2.0万U/g)，由广西庞博生物工程有限公司提供。

PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂20g，用水定容至1000mL，自然pH，在121℃下灭菌20min。

将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22℃，培养时间10天，得到活化后的桑黄菌种。

外源添加物的制备：

a.星油藤叶酶解物的制备：将采摘的星油藤叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加400mL水，磨成浆液，90℃灭菌8min，使各种酶失活；调节浆液pH4.5，加入由1.1g纤维素酶和2.2g果胶酶构成的复合酶，在40℃进行酶解反应1.5小时，在90℃下灭酶8分钟；然后调节浆液pH5.5，加入由0.56g木瓜蛋白酶和1.68g中性蛋白酶构成的复合酶，于50℃进行酶解反应1.2h，在90℃下灭酶8分钟，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得星油藤叶酶解物。

b.分心木提取物的制备：称取一定量的分心木，粉碎过60目，先加占分心木重量16倍量的质量百分浓度为80％的乙醇水溶液在80℃浸提2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅰ；上述醇提后的分心木残渣加入占分心木重量20倍量的蒸馏水在95℃下浸提2.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积5倍量的无水乙醇，5000rpm离心10min收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ，合并上述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得分心木提取物。

c.富锌酵母的制备：将活性的酵母斜面菌种接种到液体培养基中，20℃发酵培养24h，发酵终止后离心过滤，将沉淀真空冷冻干燥得富锌酵母，富锌酵母中锌含量为700mg/kg。其中，液体培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖1％、麦芽汁8％、尿素0.1％、KH₂PO₄0.15％、ZnSO₄0.02％和余量的水。即每1kg液体培养基中ZnSO₄的用量为200mg。

二、富锌桑黄发酵产物的制备

(1)富锌桑黄的液体种子液制备：取5cm²大小活化后的桑黄菌种的菌块接入1L液体种子培养基中于22℃进行桑黄液体种子培养，在桑黄液体种子培养第3天，将培养基置于低频超声环境中，超声波频率为100KHz，超声波强度控制在0.9W/cm³，22℃恒温，保持150r/min振荡培养6天后，得到富锌桑黄液体种子液；

液体种子培养基质量百分比组成为：葡萄糖1.5％、富锌酵母0.1％、分心木提取物0.05％、KH₂PO₄0.2％、MgSO₄0.1％和余量的水。

(2)富锌桑黄的液体发酵培养：将步骤(1)中的富锌桑黄液体种子液按占液体发酵培养基体积5％的用量接入液体发酵培养基中于28℃进行桑黄液体发酵培养，在桑黄液体发酵培养第2天，将液体发酵培养基置于极低频交变磁场环境中，磁场强度5mT，交变磁场频率50Hz，28℃恒温，保持160r/min振荡培养2天后，得到富锌桑黄发酵产物；

液体发酵培养基质量百分比组成为：葡萄糖2.5％、富锌酵母0.04％、星油藤叶酶解物0.05％、KH₂PO₄0.15％、MgSO₄0.08％和余量的水。

三、测定

测定方法同实施例1。检测结果见表1-表2。

实施例3

一、材料准备

中性蛋白酶(酶活力为25.0万U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力为150.0万U/g)、果胶酶(酶活力为4.0万U/g)、纤维素酶(酶活力为2.0万U/g)，由广西庞博生物工程有限公司提供。

PDA平板培养基，同实施例1。

将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度28℃，培养时间5天，得到活化后的桑黄菌种。

外源添加物的制备：

a.星油藤叶酶解物的制备：将采摘的星油藤叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加600mL水，磨成浆液，92℃灭菌6min，使各种酶失活；调节浆液pH4.0，加入由1.86g纤维素酶和0.62g果胶酶构成的复合酶，在50℃进行酶解反应0.5小时，在93℃下灭酶5分钟；然后调节浆液pH5.0，加入由2.4g木瓜蛋白酶和1.6g中性蛋白酶构成的复合酶，于60℃进行酶解反应1h，在92℃下灭酶6分钟，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为2kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得星油藤叶酶解物。

b.分心木提取物的制备：称取一定量的分心木，粉碎过100目，先加占分心木重量13倍量的质量百分浓度为70％的乙醇水溶液在70℃浸提1.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅰ；上述醇提后的分心木残渣加入占分心木重量15倍量的蒸馏水在90℃下浸提2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积3倍量的无水乙醇，5000rpm离心10min收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ，合并上述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得分心木提取物。

c.富锌酵母的制备：将活性的酵母斜面菌种接种到液体培养基中，28℃发酵培养15h，发酵终止后离心过滤，将沉淀真空冷冻干燥即得富锌酵母，富锌酵母中锌含量为400mg/kg。其中，液体培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖1.75％、麦芽汁5％、尿素0.25％、KH₂PO₄0.2％、ZnSO₄0.006％和余量的水。即每1kg液体培养基中ZnSO₄的用量为60mg。

二、富锌桑黄发酵产物的制备

(1)富锌桑黄的液体种子液制备：取2cm²大小活化后的桑黄菌种的菌块接入1L液体种子培养基中于25℃进行桑黄液体种子培养，在桑黄液体种子培养第4天，将培养基置于低频超声环境中，超声波频率为10KHz，超声波强度控制在0.1W/cm³，25℃恒温，保持130r/min振荡培养8天后，得到富锌桑黄液体种子液；

液体种子培养基质量百分比组成为：葡萄糖1％、富锌酵母0.04％、分心木提取物0.4％、KH₂PO₄0.15％、MgSO₄0.05％和余量的水。

(2)富锌桑黄的液体发酵培养：将步骤(1)中的富锌桑黄液体种子液按占液体发酵培养基体积20％的用量接入液体发酵培养基中于25℃进行桑黄液体发酵培养，在桑黄液体发酵培养第4天，将液体发酵培养基置于极低频交变磁场环境中，磁场强度0.4mT，交变磁场频率30Hz，25℃恒温，保持150r/min振荡培养5天后，得到富锌桑黄发酵产物；

液体发酵培养基质量百分比组成为：葡萄糖1％、富锌酵母0.3％、星油藤叶酶解物0.4％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄0.1％和余量的水。

三、测定

测定方法同实施例1。检测结果见表1-表2。

实施例4

一、材料准备

中性蛋白酶(酶活力为25.0万U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力为150.0万U/g)、果胶酶(酶活力为4.0万U/g)、纤维素酶(酶活力为2.0万U/g)，由广西庞博生物工程有限公司提供。

PDA平板培养基，同实施例1。

将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度30℃，培养时间6天，得到活化后的桑黄菌种。

外源添加物的制备：

a.星油藤叶酶解物的制备：将采摘的星油藤叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加300mL水，磨成浆液，93℃灭菌7min，使各种酶失活；调节浆液pH5.5，加入由2g纤维素酶和0.5g果胶酶构成的复合酶，在50℃进行酶解反应0.5小时，在93℃下灭酶5分钟；然后调节浆液pH7.0，加入由1.33g木瓜蛋白酶和2.67g中性蛋白酶构成的复合酶，于60℃进行酶解反应1h，在92℃下灭酶6分钟，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为2kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得星油藤叶酶解物。

b.分心木提取物同实施例2。

c.富锌酵母的制备：将活性的酵母斜面菌种接种到液体培养基中，28℃发酵培养10h，发酵终止后离心过滤，将沉淀真空冷冻干燥即得富锌酵母，富锌酵母中锌含量为750mg/kg。其中，液体培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖2.5％、麦芽汁8％、尿素0.3％、KH₂PO₄0.1％、ZnSO₄0.03％和余量的水。即每1kg液体培养基中ZnSO₄的用量为300mg。

二、富锌桑黄发酵产物的制备

(1)富锌桑黄的液体种子液制备：取2cm²大小活化后的桑黄菌种的菌块接入1L液体种子培养基中于25℃进行桑黄液体种子培养，在桑黄液体种子培养第1天，将培养基置于低频超声环境中，超声波频率为90KHz，超声波强度控制在0.6W/cm³，25℃恒温，保持120r/min振荡培养1天后，得到富锌桑黄液体种子液；

液体种子培养基质量百分比组成为：葡萄糖1％、富锌酵母0.4％、分心木提取物0.1％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄0.05％和余量的水。

(2)富锌桑黄的液体发酵培养：将步骤(1)中的富锌桑黄液体种子液按占液体发酵培养基体积15％的用量接入液体发酵培养基中于25℃进行桑黄液体发酵培养，在桑黄液体发酵培养第2天，将液体发酵培养基置于极低频交变磁场环境中，磁场强度4mT，交变磁场频率25Hz，25℃恒温，保持150r/min振荡培养2天后，得到富锌桑黄发酵产物；

液体发酵培养基质量百分比组成为：葡萄糖1％、富锌酵母0.1％、星油藤叶酶解物0.3％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄0.05％和余量的水。

三、测定

测定方法同实施例1。检测结果见表1-表2。

实施例5

一、材料准备

中性蛋白酶(酶活力为25.0万U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力为150.0万U/g)、果胶酶(酶活力为4.0万U/g)、纤维素酶(酶活力为2.0万U/g)，由广西庞博生物工程有限公司提供。

PDA平板培养基，同实施例1。

将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度23℃，培养时间4天，得到活化后的桑黄菌种。

外源添加物的制备：

a.星油藤叶酶解物的制备：将采摘的星油藤叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加600mL水，磨成浆液，93℃灭菌7min，使各种酶失活；调节浆液pH5.5，加入由1g纤维素酶和1g果胶酶构成的复合酶，在50℃进行酶解反应0.5小时，在93℃下灭酶5分钟；然后调节浆液pH7.0，加入由1.12g木瓜蛋白酶和0.56g中性蛋白酶构成的复合酶，于60℃进行酶解反应1h，在92℃下灭酶6分钟，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为2kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得星油藤叶酶解物。

b.分心木提取物，购于西安昌岳植物化工有限公司。

c.富锌酵母，购于浙江深友生物技术有限公司。

二、富锌桑黄发酵产物的制备

(1)富锌桑黄的液体种子液制备：取2cm²大小活化后的桑黄菌种的菌块接入1L液体种子培养基中于25℃进行桑黄液体种子培养，在桑黄液体种子培养第3天，将培养基置于低频超声环境中，超声波频率为70KHz，超声波强度控制在0.8W/cm³，25℃恒温，保持120r/min振荡培养3天后，得到富锌桑黄液体种子液；

液体种子培养基质量百分比组成为：葡萄糖1％、富锌酵母0.4％、分心木提取物0.1％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄0.05％和余量的水。

(2)富锌桑黄的液体发酵培养：将步骤(1)中的富锌桑黄液体种子液按占液体发酵培养基体积10％的用量接入液体发酵培养基中于22℃进行桑黄液体发酵培养，在桑黄液体发酵培养第3天，将液体发酵培养基置于极低频交变磁场环境中，磁场强度2.5mT，交变磁场频率20Hz，22℃恒温，保持150r/min振荡培养2天后，得到富锌桑黄发酵产物；

液体发酵培养基质量百分比组成为：葡萄糖1％、富锌酵母0.1％、星油藤叶酶解物0.3％、KH₂PO₄0.2％、MgSO₄0.05％和余量的水。

三、测定

测定方法同实施例1。检测结果见表1-表2。

对比例1

(1)摇瓶种子培养

1L液体种子培养基：葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄0.5g/L和余量的水。pH自然，在121℃下灭菌20min。

培养方法：取2cm²大小实施例4中活化后的桑黄菌种菌块接入1L灭菌后液体种子培养基中，25℃，120r/min下摇床培养3天，得到培养好的种子液。

(2)液体发酵培养：将培养好的种子液按占液体培养基体积15％的用量接入液体培养基中，液体培养基组成为葡萄糖10g/L、硫酸锌3g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄0.5g/L和余量的水。pH自然，在121℃下灭菌20min。在25℃，120r/min摇床中培养8天，得到发酵产物。每个试验设3个平行。

测定方法同实施例1。检测结果见表1-表2。

对比例2

除了“二、富锌桑黄发酵产物的制备(1)富锌桑黄的液体种子液制备：取2cm²大小活化后的桑黄菌种的菌块接入1L液体种子培养基中进行桑黄液体种子培养，25℃恒温，保持130r/min振荡培养8天后，得到桑黄液体种子液；液体种子培养基质量百分比组成为：葡萄糖1％、富锌酵母0.04％、分心木提取物0.4％、KH₂PO₄0.15％、MgSO₄0.05％和余量的水。(2)富锌桑黄的液体发酵培养：将步骤(1)中的富锌桑黄液体种子液按占液体发酵培养基体积20％的用量接入液体发酵培养基中进行桑黄液体发酵培养，在25℃恒温，保持150r/min振荡培养8天后，得到桑黄发酵产物；液体发酵培养基质量百分比组成为：葡萄糖1％、富锌酵母0.3％、星油藤叶酶解物0.4％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄0.1％和余量的水。”之外，其余操作同实施例3。

检测结果见表1-表2。

对比例3

除了“二、富锌桑黄发酵产物的制备(1)富锌桑黄的液体种子液制备：取2cm²大小活化后的桑黄菌种的菌块接入1L液体种子培养基中于25℃进行桑黄液体种子培养，在桑黄液体种子培养第4天，将培养基置于低频超声环境中，超声波频率为10KHz，超声波强度控制在0.1W/cm³，25℃恒温，保持130r/min振荡培养8天后，得到富锌桑黄液体种子液；1L液体种子培养基：葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄0.5g/L和余量的水。pH自然，在121℃下灭菌20min。(2)富锌桑黄的液体发酵培养：将步骤(1)中的富锌桑黄液体种子液按占液体发酵培养基体积20％的用量接入液体发酵培养基中于25℃进行桑黄液体发酵培养，在桑黄液体发酵培养第4天，将液体发酵培养基置于极低频交变磁场环境中，磁场强度0.4mT，交变磁场频率25Hz，25℃恒温，保持150r/min振荡培养5天后，得到富锌桑黄发酵产物；液体发酵培养基质量百分比组成为：葡萄糖1％、富锌酵母0.3％、酵母粉0.4％、蛋白胨0.3％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄0.1％和余量的水。”之外，其余操作同实施例3。

检测结果见表1-表2。

表1富锌桑黄发酵代谢产物产量检测结果

注：与对比例1比较，Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01。

表2桑黄锌多糖抗氧化检测结果

注：与对比例1比较，Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01。

表1-表2的数据显示：

本发明根据药用真菌桑黄的发酵培养和富锌特性，在种子培养阶段让菌体细胞暴露在一定频率和强度的低频超声波中快速培养，在发酵阶段让菌体细胞暴露在一定频率和强度的极低频磁场利于有机锌元素的转化和桑黄锌多糖的合成，通过种子液和发酵两阶段的物理辅助协同发酵，以及分心木提取物、星油藤叶酶解物等外源添加物的协同作用，大幅度提高了最终桑黄发酵产物中有机锌、锌多糖的含量和活性。与常规培养方法相比，采用本发明方法液体发酵培养的桑黄代谢产物中锌多糖产量提高了52.8％-63.8％，有机锌含量提高了47.0％-62.5％，锌多糖抗氧化活性提高了37.5％-56.1％。

在本发明制备方法限定的范围内各参数的变化并不影响富锌桑黄发酵代谢产物产量及产物活性的提高，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现富锌桑黄发酵代谢产物产量及产物活性的提高。在此不再赘述。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种富锌桑黄液体发酵产物的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(1)富锌桑黄液体种子液制备：将活化后的桑黄菌种接入液体种子培养基中进行桑黄液体种子培养，在桑黄液体种子培养第1天-第4天，将培养基置于低频超声环境中，超声波频率为10KHz-100KHz，超声波强度控制在0.1W/cm³-0.9W/cm³，22℃-28℃恒温，保持120r/min-150r/min振荡培养1天-8天后，得到富锌桑黄液体种子液；所述的液体种子培养基中含有富锌酵母0.04％-0.4％和分心木提取物0.05％-0.4％，％为质量百分比；

(2)富锌桑黄的液体发酵培养：将步骤(1)中的富锌桑黄液体种子液按占液体发酵培养基体积5％-20％的用量接入液体发酵培养基中进行桑黄液体发酵培养，在桑黄液体发酵培养第2天-第4天，将液体发酵培养基置于极低频交变磁场环境中，磁场强度0.4mT-5mT，交变磁场频率5Hz-50Hz，22℃-28℃恒温，保持140r/min-160r/min振荡培养2天-5天后，得到富锌桑黄发酵产物；所述的液体发酵培养基中含有富锌酵母0.04％-0.4％和星油藤叶酶解物0.05％-0.4％，％为质量百分比；

所述的分心木提取物的制备方法包括：称取一定量的分心木，粉碎，先加占分心木重量10倍量-16倍量的质量百分浓度为60％-80％的乙醇水溶液在60℃-80℃浸提1h-2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅰ；上述醇提后的分心木残渣加入占分心木重量10倍量-20倍量的水在85℃-95℃下浸提1h-2.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积2倍量-5倍量的无水乙醇，离心收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ，合并上述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得分心木提取物；

所述的星油藤叶酶解物的制备方法，包括：将星油藤叶加水磨成浆液，灭酶；调节浆液pH4.0-5.5，加入由纤维素酶和果胶酶构成的第一复合酶，在40℃-50℃进行酶解反应0.5小时-1.5小时，灭酶后调节浆液pH5.0-7.0，加入由木瓜蛋白酶和中性蛋白酶构成的第二复合酶，于50℃-60℃进行酶解反应1小时-1.5小时，灭酶后离心，上清液经过滤、浓缩和干燥，得到星油藤叶酶解物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的液体种子培养基质量百分比组成为：葡萄糖1％-2％、富锌酵母0.04％-0.4％、分心木提取物0.05％-0.4％、KH₂PO₄0.1％-0.2％、MgSO₄ 0.05％-0.1％和余量的水。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液体发酵培养基质量百分比组成为：葡萄糖1％-2.5％、富锌酵母0.04％-0.4％、星油藤叶酶解物0.05％-0.4％、KH₂PO₄0.1％-0.2％、MgSO₄ 0.05％-0.1％和余量的水。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一复合酶与星油藤叶的质量比为1：30-50；所述的第二复合酶与星油藤叶的质量比为1：25-60。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纤维素酶与果胶酶的质量比为1:2至4:1；所述的木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的质量比为1:3至2:1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的富锌酵母中锌含量为400mg/kg-1000mg/kg。