CN101570768A - 一种深层液体发酵法制备富硒茶树菇粗多糖粉的方法 - Google Patents
一种深层液体发酵法制备富硒茶树菇粗多糖粉的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种深层液体发酵法生产富硒茶树菇粗多糖粉的方法。主要包括菌种的组织分离，培养基的组成，发酵条件，硒元素的转化，菌丝体的收集，粉碎，水浸提，醇提后冷冻干燥得到富硒茶树菇胞内粗多糖粉；另外将发酵液浓缩，将浓缩液醇提后冷冻干燥得到富硒茶树菇胞外粗多糖粉；二者合并后得到富硒茶树菇粗多糖粉。每克粗多糖粉中有机硒含量达10微克/克以上。富硒茶树菇粗多糖粉有抗肿瘤，增强免疫力，抗疲劳，等保健生理活性。可应用于制备具有抗肿瘤，增强免疫力，抗疲劳功能的保健品。
Description
技术领域
本发明涉及一种深层液体发酵法生产富硒茶树菇粗多糖粉的方法。属生物工程技术领域。
背景技术
茶树菇属担子菌纲，粪锈伞科，田菇属，又名茶菇、油茶菇、神菇。是近年来发展起来的一种食用菌新品种。茶树菇营养丰富，蛋白质含量高，含有人体必需的氨基酸，并且有丰富的B族维生素和钾、钠、钙、镁、铁、锌等矿质元素。中医认为该菇性平、甘温、无毒，具有较高的药用价值，有清热、平肝、明目、健脾的功效。其提取物多糖对小白鼠肉瘤S-180和艾氏腹水癌的抑制率高达80-90％，是一种集营养、保健、理疗于一身的绿色食品。研究表明，茶树菇深层发酵获得的菌丝体所含的主要营养成分以及氨基酸与人工栽培的子实体相似。为深层发酵茶树菇产多糖提供了理论依据。
硒是人体必需的微量元素之一，它的生物学作用主要有：①硒是谷胱甘肽过氧化物酶必需的组成成分，对免疫系统的影响可能与谷胱甘肽过氧化物酶参与花生四烯酸的代谢，进而影响到前列腺素和白三烯的合成有关。硒化合物又是自由基的捕获剂，后者会导致生化紊乱从而引起癌变和衰老。②硒有调节氧化还原反应速度，强化某些酶系统的活性及调节维生素A、C、E、K在体内的吸收和消耗的功能。③硒对汞、镉有解毒作用。研究表明，茶树菇菌丝体及发酵液中微量元素含量的多少易受培养基成分的影响，因此可以考虑在培养基中添加硒元素来培养茶树菇，从而得到茶树菇富硒粗多糖粉。
目前，人们获得真菌多糖的途径主要是从真菌子实体提取而得，但随着需求量的增大，野生资源有限，人工栽培周期长且容易污染杂菌，受病虫害侵蚀，而菌丝体培养周期短，染菌少，故应该探索在生物反应器内进行液体深层发酵以获取多糖的途径，为开辟工业化液体深层发酵生产真菌多糖提供可靠依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种深层液体发酵制备富硒茶树菇粗多糖粉的方法。
本发明的技术方案为：将茶树菇子实体通过组织分离法接入固体斜面培养基上培养，待长好后移至摇瓶种子液体培养基中培养，将培养好的种子液接入摇瓶发酵液体培养基培养。在发酵液体培养基中加入一定浓度无机硒，使茶树菇菌丝体中积累高浓度的有机硒，同时发酵液有效成分中也有一定浓度的硒元素。发酵结束后，收集菌丝体，匀浆，热水浸提，浸提液浓缩后醇析，冷冻干燥得到富硒茶树菇胞内粗多糖粉；另外将发酵液浓缩，将浓缩液醇析后冷冻干燥得到富硒茶树菇胞外粗多糖粉；二者合并后得到富硒茶树菇粗多糖粉。
本发明提出的深层液体发酵制备富硒茶树菇粗多糖粉的具体操作步骤如下：
(1)菌种培养
出发菌种为市售茶树菇(Agrocybe aegirit)；
①组织分离法
斜面培养基：PDA培养基，含1.5％～2.0％琼脂，pH自然；
组织分离方法：将子实体外表用酒精进行表面消毒后，放入超净工作台上，用消毒过的刀片与镊子切取菌柄与菌盖交界处组织块接入斜面培养基上，pH自然，置于25℃温度下暗培养，5d后菌丝开始萌发，每隔2d检查1次，除去污染，选择菌丝生长速度快和长势强的试管作为纯母种；
②摇瓶种子培养
摇瓶种子培养基：PDA1L加磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，牛肉膏2g，蛋白胨1g，pH6.0；
培养方法：从斜面菌种中取3～4块黄豆大小相同的菌块，接种于摇瓶种子培养基中，250mL三角瓶装培养基100mL于25℃，150r/min，振荡培养7d；
③摇瓶发酵培养
发酵培养基：玉米粉2g/100mL、酵母粉0.3g/100mL、磷酸二氢钾0.2g/100mL、硫酸镁0.05g/100mL、亚硒酸钠6μg/100mL
培养方法：将培养好的种子以15％的接种量接入摇瓶发酵培养基中25℃，150r/min，振荡培养7d；
(2)富硒粗多糖的提取：离心分离收集发酵液和菌丝体；
①胞内粗多糖的提取：将湿菌丝体匀浆，80℃-90℃热水浸提，加水量为4倍体积湿菌丝体，总提取时间为10h，提取3次，合并提取液，浓缩后加入3倍体积95％乙醇在4℃醇析12h，8000rpm离心得沉淀物，沉淀物用蒸馏水复溶后冷冻干燥，粉碎后得到茶树菇胞内粗多糖粉；
②胞外粗多糖提取：将发酵液浓缩后调PH值为5.5，添加4倍体积发酵液的95％乙醇，4℃醇析17h，8000rpm离心得沉淀物，沉淀物用蒸馏水复溶后冷冻干燥，粉碎后得到茶树菇胞外粗多糖粉；
(3)产品的获得：将茶树菇胞内粗多糖粉与茶树菇胞外粗多糖粉合并，得到茶树菇粗多糖粉；
(4)检测结果：茶树菇发酵菌丝体、发酵液均含有17种氨基酸，以谷氨酸和天冬氨酸含量最高，这说明了茶树菇有较强的鲜味。用苯酚硫酸法测定多糖含量分别为：胞内粗多糖中多糖含量11.2％，胞外粗多糖中多糖含量20.3％。单糖组成分析结果表明，茶树菇胞内多糖和胞外多糖各主要单糖组成及质量分数分别为阿拉伯单糖0.74％，1.10％；木糖1.41％，0.62％；甘露糖0.96％，1.30％；葡萄糖22.3％，26.3％；半乳糖2.97％，3.15％。分别测样品中总硒及游离硒的含量，两者之差为样品中有机硒含量，含量为15微克/克以上。
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实例1：各种培养基的组成配方
斜面培养基：PDA培养基(200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000mL煮沸0.5h或高压蒸煮20min，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，121℃灭菌15-20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用)，pH自然。
摇瓶种子培养基：PDA1L加磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，牛肉膏2g，蛋白胨1g，pH6.0。
摇瓶发酵培养基：玉米粉20g、酵母粉3g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.5g、亚硒酸钠40μg，用水稀释至1L，PH6.0。
实例2：菌种培养
出发菌种为市售茶树菇(Agrocybe aegirit)，将子实体外表用75％酒精进行表面消毒后，放入超净工作台上，用消毒过的刀片与镊子切取菌柄与菌盖交界处组织块接入实例1中斜面培养基上，pH自然，置于25℃温度下暗培养，5d后菌丝开始萌发，每隔2d检查1次，除去污染，选择菌丝生长速度快和长势强的试管作为纯母种；从斜面母种中取3～4块黄豆大小相同的菌块，接种于实例1已灭菌的摇瓶种子培养基中，装液量100mL/250mL三角瓶，于25℃，150r/min，振荡培养7d，三角瓶包八层纱布；将培养好的种子以15％的接种量接入实例1已灭菌的摇瓶发酵培养基中25℃，150r/min，振荡培养7d。
实例3：富硒粗多糖的提取
1、胞内粗多糖的提取：将上述发酵液4000rpm离心10min，收集菌丝体，将湿菌丝体匀浆，加入4倍体积湿菌丝体的水在80℃水浴锅中浸提，，总提取时间为10h，提取3次，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩至原体积1/5后加入3倍体积95％乙醇，放入4℃冰箱醇沉12h，取出后8000rpm离心5min得沉淀物，沉淀物用蒸馏水复溶后冷冻干燥，粉碎后得到富硒茶树菇胞内粗多糖粉80mg。
2、胞外粗多糖提取：将上述发酵液4000rpm离心10min，收集上清液，用旋转蒸发仪浓缩至原体积1/5后调PH值为5.5，加入4倍体积95％乙醇，放入4℃冰箱醇沉17h，取出后8000rpm离心5min得沉淀物，沉淀物用蒸馏水复溶后冷冻干燥，粉碎后得到富硒茶树菇胞外粗多糖粉576mg。
3、产品的获得：将茶树菇胞内粗多糖粉与茶树菇胞外粗多糖粉合并，得到富硒茶树菇粗多糖粉656mg。
实例4：检测结果
对茶树菇发酵菌丝体、发酵液样品进行了氨基酸组成的测定，测定结果表明，两者均含有17种氨基酸，以谷氨酸和天冬氨酸含量最高。用苯酚硫酸法测定茶树菇胞内和胞外多糖含量分别为：11.2％和20.3％。单糖组成分析结果表明，茶树菇胞内多糖和胞外多糖各主要单糖组成及质量分数分别为阿拉伯单糖0.74％，1.10％；木糖1.41％，0.62％；甘露糖0.96％，1.30％；葡萄糖22.3％，26.3％；半乳糖2.97％，3.15％。测定了茶树菇富硒粗多糖中总硒及游离硒的含量，两者之差为样品中有机硒含量，含量为10微克/克以上。茶树菇发酵菌丝体、发酵滤液的氨基酸组成及含量见表1，茶树菇胞内多糖和胞外多糖各主要单糖组成及质量分数见表2。
表1 茶树菇发酵菌丝体、发酵滤液的氨基酸组成及含量
表2 茶树菇胞内多糖和胞外多糖各主要单糖组成及质量分数
Claims (1)
1、一种深层液体发酵法制备富硒茶树菇粗多糖粉的方法，其特征是将茶树菇子实体通过组织分离法接入固体斜面培养基上培养，待长好后移至摇瓶种子液体培养基中培养，将培养好的种子液接入摇瓶发酵液体培养基培养。在发酵液体培养基中加入一定浓度无机硒，使茶树菇菌丝体中积累高浓度的有机硒，同时发酵液有效成分中也有一定浓度的硒元素。发酵结束后，收集菌丝体，匀浆，热水浸提，浸提液浓缩后醇析，冷冻干燥得到富硒茶树菇胞内粗多糖粉；另外将发酵液浓缩，将浓缩液醇析后冷冻干燥得到富硒茶树菇胞外粗多糖粉；二者合并后得到富硒茶树菇粗多糖粉。步骤为：
(1)菌种培养
出发菌种为市售茶树菇(Agrocybe aegirit)；
①组织分离法
斜面培养基：PDA培养基，含1.5％～2.0％琼脂，pH自然；
组织分离方法：将子实体外表用酒精进行表面消毒后，放入超净工作台上，用消毒过的刀片与镊子切取菌柄与菌盖交界处组织块接入斜面培养基上，pH自然，置于25℃温度下暗培养，5d后菌丝开始萌发，每隔2d检查1次，除去污染，选择菌丝生长速度快和长势强的试管作为纯母种；
②摇瓶种子培养
摇瓶种子培养基：PDA1L加磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，牛肉膏2g，蛋白胨1g，pH6.0；
培养方法：从斜面菌种中取3～4块黄豆大小相同的菌块，接种于摇瓶种子培养基中，250mL三角瓶装培养基100mL于25℃，150r/min，振荡培养7d；
③摇瓶发酵培养
发酵培养基：玉米粉2g/100mL、酵母粉0.3g/100mL、磷酸二氢钾0.2g/100mL、硫酸镁0.05g/100mL、亚硒酸钠4μg/100mL
培养方法：将培养好的种子以15％的接种量接入摇瓶发酵培养基中25℃，150r/min，振荡培养7d；
(2)富硒粗多糖的提取：离心分离收集发酵液和菌丝体；
①胞内粗多糖的提取：将湿菌丝体匀浆，80℃-90℃热水浸提，加水量为4倍体积湿菌丝体，总提取时间为10h，提取3次，合并提取液，浓缩后加入3倍体积95％乙醇在4℃醇析12h，8000rpm离心得沉淀物，沉淀物用蒸馏水复溶后冷冻干燥，粉碎后得到富硒茶树菇胞内粗多糖粉；
②胞外粗多糖提取：将发酵液浓缩后调PH值为5.5，添加4倍体积发酵液的95％乙醇，4℃醇析17h，8000rpm离心得沉淀物，沉淀物用蒸馏水复溶后冷冻干燥，粉碎后得到富硒茶树菇胞外粗多糖粉；
(3)产品的获得：将茶树菇胞内粗多糖粉与茶树菇胞外粗多糖粉合并，得到富硒茶树菇粗多糖粉；
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