CN111504996A - 一种茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法，包括以下步骤：S1：培养，所述培养包括：种子液培养和固体发酵培养；S2：测定，所述测定包括：固体发酵样品茶皂素降解率的测定和茶皂素降解率的计算，茶皂素降解率=（发酵后茶皂素浓度/发酵前茶皂素浓度）×100%；S3：固体发酵培养基的优化；S4：固体发酵条件的优化，通过改变影响发酵的条件,测定发酵前后茶籽饼中茶皂素浓度，以茶皂素降解率为指标。本发明为微生物发酵茶粕饲料提供了发酵工艺条件，为使茶籽饼成为一种优良的蛋白饲料资源打下坚实的基础。

Description

一种茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法

技术领域

本发明涉及茶籽饼生物脱毒技术领域，尤其涉及一种茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法。

背景技术

茶籽饼，又称为茶粕、茶枯，是油茶果实榨油后剩下的渣滓。据国家统计局统计，2010年我国油茶种植面积达到3000多万亩，年产油茶籽 109万吨，油茶籽粕70多万吨。但是由于茶籽饼粕中含有茶皂素等毒性物质以及单宁、粗纤维等抗营养成分，限制了其在动物饲料中的应用范围。目前主要利用物理法、化学法、微生物发酵法以及综合法，对茶籽饼粕进行脱毒处理，常用的方法有化学法与微生物发酵法。

其中茶籽饼粕微生物发酵脱毒国内外进行了许多研究。丁丽霞等以油茶粕为研究对象，以茶皂素含量为指标，利用黑曲霉对油茶粕进行固态发酵降解茶皂素，在最优工艺条件下降解率达到89.99％。

练杰等利用黑曲霉、枯草芽孢杆菌的混合菌对茶籽饼粕进行固态发酵，在最优工艺条件下可使茶籽粕的茶皂素降解率达93.28％左右。

黄浦等利用混菌液态发酵降解茶皂素的试验研究，在最佳的条件下进行混菌液态发酵实验,得到混菌降解茶皂素的降解率为(73.76±0.63)％。

王小姣等对饲用嗜酸小球菌液体生料发酵工艺研究，研究结果显示了液体生料发酵技术适合于饲用嗜酸小球菌的生产。

但是现有的检测方法具有一定的局限性，因此急需提出一种茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法，为微生物发酵茶粕饲料提供了发酵工艺条件，为使茶籽饼成为一种优良的蛋白饲料资源打下坚实的基础，可以有效解决背景技术中的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供一种茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法，包括以下步骤：

S1：培养，所述培养包括：

种子液培养：将斜面菌种接种于种子液培养基中，于30℃﹑ 160r/min条件下培养24h，备用，嗜酸小球菌接种于MRS培养基中，在培养温度为37℃的恒温培养箱中静置培养24h，备用；

固体发酵培养：在250mL三角瓶中装入50g固体发酵培养基，以干基计，采用接种量为10％质量浓度，将培养好的种子液接入基础固体发酵培养基中，32℃恒温培养5d；

S2：测定，所述测定包括：

固体发酵样品茶皂素降解率的测定：采用香草醛-浓硫酸法测定；

茶皂素降解率的计算，茶皂素降解率＝(发酵后茶皂素浓度/发酵前茶皂素浓度)×100％；

S3：固体发酵培养基的优化，保持基础培养基其它组成不变,采用单因素试验法，依次改变培基的茶籽饼与麦麸的比例、葡萄糖添加量、 KH₂PO₄添加量、MgSO₄·7H₂O添加量，等量接种种子液培养液于固体发酵培养基中进行固体发酵，测定发酵前后茶籽饼中茶皂素浓度，以茶皂素降解率为指标，优化筛选不同茶籽饼与麦麸的比例、葡萄糖添加量、KH₂PO₄添加量、MgSO₄·7H₂O添加量等对菌种降解茶皂素的影响，每处理三个平行；

S4：固体发酵条件的优化，通过改变影响发酵的条件,测定发酵前后茶籽饼中茶皂素浓度，以茶皂素降解率为指标。

作为一种优选方案，步骤S3中，依次改变培基的茶籽饼与麦麸的比例为95:5、90:10、85:15、80:20、75:25，葡萄糖添加量的比例为2％、3％、4％、5％、6％，KH₂PO₄添加量的比例为0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、 0.25％，MgSO₄·7H₂O添加量的比例为0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％。

作为一种优选方案，步骤S3中，所述MRS培养基为：蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、葡萄糖2％、吐温80 0.1mL、K₂HPO₄ 0.2％、醋酸钠0.5％、柠檬酸二铵0.2％、MgSO₄·7H₂O 0.058％、MnSO₄·4H₂O 0.025％、蒸馏水100mL，pH值6.2～6.6，115℃灭菌25min。

作为一种优选方案，基础固体发酵培养基：茶籽饼粕90％、麦麸10％、葡萄糖4％﹑KH₂PO₄0.15％、MgSO₄·7H₂O 0.1％、NaCl 3％、pH值7.5、固水比为1:0.5。

本发明中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或者优点：

在茶籽饼脱毒过程中，含水量与初始pH值是影响茶皂素降解率的关键性因素，茶籽饼与麦麸比值为85:15、葡萄糖3％、KH2PO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.15％、含水量70％，培养条件为初始pH值为6.0、接种量为20％、种龄为24h、发酵时间为5d、发酵温度为32℃。在此条件下茶皂素降解率为68.42％。在此工艺条件下，固态发酵培养基配制完成后无需灭菌，这在一定程度上降低了能耗，且操作简单，对设备要求低，降低了生产成本，为茶籽饼生物脱毒技术的推广提供了技术支持。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

在附图中：

图1是本发明实施例中茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法正交实验因素水平表。

图2是本发明实施例中茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法茶皂素标准曲线。

图3是本发明实施例中茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法茶籽饼与麦麸比例图。

图4是本发明实施例中茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法葡萄糖添加量对茶皂素降解率的影响图。

图5是本发明实施例中茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法KH₂PO₄添加量对茶皂素降解率的影响图。

图6是本发明实施例中茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法MgSO₄·7H₂O 添加量对茶皂素降解率的影响图。

图7是本发明实施例中茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法培养基含水量对茶皂素降解率的影响图。

图8是本发明实施例中茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法发酵时间对茶皂素降解率的影响图。

图9是本发明实施例中茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法接种量对茶皂素降解率的影响图。

图10是本发明实施例中茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法初始pH对茶皂素降解率的影响图。

图11是本发明实施例中茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法种龄对茶皂素降解率的影响图。

图12是本发明实施例中茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法正交实验结果分析表。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者间接在该另一个元件上。当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至该另一个元件上。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

为了更好地理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体实施方式对上述技术方案进行详细的说明。

实施例：

请参阅图1-7，本实施例提供一种茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法，包括以下步骤：

S1：培养，所述培养包括：

种子液培养：将斜面菌种接种于种子液培养基中，于30℃﹑ 160r/min条件下培养24h，备用，嗜酸小球菌接种于MRS培养基中，在培养温度为37℃的恒温培养箱中静置培养24h，备用；

固体发酵培养：在250mL三角瓶中装入50g固体发酵培养基，以干基计，采用接种量为10％质量浓度，将培养好的种子液接入基础固体发酵培养基中，32℃恒温培养5d；

S2：测定，所述测定包括：

固体发酵样品茶皂素降解率的测定：采用香草醛-浓硫酸法测定；

茶皂素降解率的计算，茶皂素降解率＝(发酵后茶皂素浓度/发酵前茶皂素浓度)×100％；

S3：固体发酵培养基的优化，保持基础培养基其它组成不变,采用单因素试验法，依次改变培基的茶籽饼与麦麸的比例、葡萄糖添加量、 KH₂PO₄添加量、MgSO₄·7H₂O添加量，等量接种种子液培养液于固体发酵培养基中进行固体发酵，测定发酵前后茶籽饼中茶皂素浓度，以茶皂素降解率为指标，优化筛选不同茶籽饼与麦麸的比例、葡萄糖添加量、KH₂PO₄添加量、MgSO₄·7H₂O添加量等对菌种降解茶皂素的影响，每处理三个平行，依次改变培基的茶籽饼与麦麸的比例为95:5、90:10、85:15、80:20、 75:25，葡萄糖添加量的比例为2％、3％、4％、5％、6％，KH₂PO₄添加量的比例为0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％，MgSO₄·7H₂O添加量的比例为 0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％；

所述MRS培养基为：蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、葡萄糖2％、吐温800.1mL、K₂HPO₄ 0.2％、醋酸钠0.5％、柠檬酸二铵0.2％、MgSO₄· 7H₂O 0.058％、MnSO₄·4H₂O0.025％、蒸馏水100mL，pH值6.2～6.6，115℃灭菌25min；

基础固体发酵培养基：茶籽饼粕90％、麦麸10％、葡萄糖4％﹑

KH₂PO₄0.15％、MgSO₄·7H₂O 0.1％、NaCl 3％、pH值7.5、固水比为1:0.5；

S4：固体发酵条件的优化，通过改变影响发酵的条件,测定发酵前后茶籽饼中茶皂素浓度，以茶皂素降解率为指标。

一、试验材料

1)菌种，试验菌种为嗜酸小球菌(Pediococcus acidilactici)，由管维联合湖南农业大学生物科学技术学院微生物实验室对衡阳市荆田湾农业开发有限公司提供的自然堆放的茶籽饼粕原料进行筛选所得的菌种。

2)主要试剂，茶皂素标准品(98.2％茶皂素)购于陕西帕尼尔生物科技有限公司，茶籽饼、麦麸(市场购得，无霉变与虫蛀)，葡萄糖、NaCl、 MgSO₄·7H₂O、MnSO₄·4H₂O、柠檬酸二铵、无水乙酸钠、吐温80、香草醛、甲醇(AR)、浓H₂SO₄、牛肉膏、蛋白胨(BR，上海盛思生化科技有限公司)；酵母膏(BR，上海天鹅啤酒有限公司)；琼脂、酵母抽提粉；

3)主要仪器设备，紫外可见分光光度计(752型，上海光谱仪器有限公司)；恒温水箱(SHHW21.420AII，天津市泰斯特仪器有限公司)；台式低速离心机(TDZ4，湖南赫西仪器装备有限公司)；高速多功能粉碎机(TYSP-400A，浙江省永康市红太阳机电有限公司)；超声波清洗机 (JCX-250W，山东济宁超声电子仪器厂)；电子天平(KF型，浙江凯丰集团有限公司)；

4)培养基，MRS培养基(培养嗜酸小球菌)：蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、葡萄糖2％、吐温80 0.1mL、K₂HPO₄ 0.2％、醋酸钠0.5％、柠檬酸二铵0.2％、MgSO₄·7H₂O0.058％、MnSO₄·4H₂O 0.025％、蒸馏水 100mL，pH值6.2～6.6，115℃灭菌25min。

基础液体发酵培养基：茶皂素15.0g、葡萄糖5g、蛋白胨5g、KH₂PO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O1g、酵母抽提粉3g，蒸馏水1000mL、pH值7.2～7.5， 121℃灭菌25min。

基础固体发酵培养基：茶籽饼粕90％、麦麸10％、葡萄糖4％﹑ KH₂PO₄0.15％、MgSO₄·7H₂O0.1％、NaCl 3％，pH值7.5，固水比为1:0.5。

二、试验方法

1)培养，种子液培养：将斜面菌种接种于种子液培养基中，于30℃﹑160r/min条件下培养24h，备用；嗜酸小球菌接种于MRS培养基中，在培养温度为37℃的恒温培养箱中静置培养24h，备用；

固体发酵培养：在250mL三角瓶中装入50g固体发酵培养基(以干基计)，采用接种量为10％(v/w)，将培养好的种子液接入基础固体发酵培养基中，32℃恒温培养5d。

2)测定方法，固体发酵样品茶皂素降解率的测定：采用香草醛-浓硫酸法测定；茶皂素降解率的计算，茶皂素降解率＝(发酵后茶皂素浓度/发酵前茶皂素浓度)×100％；数据处理，本试验所得数据均通过WPS Office软件进行误差分析。

3)固体发酵培养基的优化，保持基础培养基其它组成不变,采用单因素试验法，依次改变培基的茶籽饼与麦麸的比例(95:5、90:10、85:15、 80:20、75:25)、葡萄糖添加量(2％、3％、4％、5％、6％)、KH₂PO₄添加量 (0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％)、MgSO₄·7H₂O添加量(0.05％、 0.1％、0.15％、0.2％、0.25％)，等量接种种子液培养液于固体发酵培养基中进行固体发酵。测定发酵前后茶籽饼中茶皂素浓度，以茶皂素降解率为指标，优化筛选不同茶籽饼与麦麸的比例、葡萄糖添加量、KH₂PO₄添加量、 MgSO₄·7H₂O添加量等对菌种降解茶皂素的影响。每处理三个平行。

4)固体发酵条件的优化，通过改变影响发酵的条件,测定发酵前后茶籽饼中茶皂素浓度，以茶皂素降解率为指标，在优化培养基的基础上，考察含水量、发酵时间、初始pH值、接种量以及种龄对茶皂素降解的影响，研究最佳的固体发酵条件。每处理三个平行；

在单因素试验的基础上，采用正交试验法设计以含水量、初始pH值、接种量、种龄等对嗜酸小球菌降解茶皂素的影响较大的因素进行4因素3 水平的优化实验，正交设计见图1。

三、结果与分析

1)茶籽饼茶皂素含量的测定，利用香草醛-浓硫酸方法绘制茶皂素标准曲线如图2所示，得线性回归方程为：y＝0.6107x+0.0105，相关系数 R²＝0.9928，说明茶皂素浓度与吸光度值的线性关系良好。采用香草醛-浓硫酸方法测得茶籽饼1g中含有茶皂素0.1745g，即茶皂素含量为17.45％。

2)固体发酵培养基的优化，茶籽饼与麦麸比例，改变培养基中茶籽饼与麦麸的添加比例(95:5、90:10、85:15、80:20、75:25)在其他条件不变的情况下，32℃恒温发酵5d，80℃烘干后，测定培养基中的茶皂素含量并计算茶皂素的降解率，结果见图3。从图3可以看出，在茶籽饼与麦麸的比例为85：15时，茶皂素降解率最高，达到11.29％。在一定范围内，茶皂素降解率随茶籽饼比例的增加而增大，说明茶皂素的增加在一定范围内能够加强菌体的生长繁殖能力，但茶籽饼所占比例过大时，培养基中的茶皂素浓度高，对菌体的生长代谢起抑制作用，从而影响对茶皂素的降解率。故选择茶籽饼与麦麸的比例为85:15进行后续研究；

葡萄糖添加量，在其他条件不变的情况下，改变培养基中葡萄糖的添加量，32℃恒温发酵5d，80℃烘干后，测定培养基中的茶皂素含量并计算茶皂素的降解率，结果见图4。从图4可以看出，在葡萄糖添加量在 2％～3％范围内，茶皂素降解率随葡萄糖添加量的增加而增加，当葡萄糖添加量为3％时，茶皂素降解率达到33.07％，但葡萄糖添加量大于3％时，茶皂素降解率显著且持续下降。造成原因可能由于培养基中碳源含量过高或过低，从而使培养基中的碳氮比例失调，导致菌体生长代谢能力下降。因此选择3％的葡萄糖添加量为最佳添加量；

KH₂PO₄添加量，其他条件不变，改变培养基中KH₂PO₄添加量，32℃恒温发酵5d，80℃烘干后，测定培养基中的茶皂素含量并计算茶皂素的降解率，结果见图5。从图5可以看出，在一定范围内，茶皂素降解率随 KH2PO4添加量的增加而增加，当KH2PO4添加量为0.1％时，茶皂素降解率达到41.38％，但KH2PO4添加量超过0.1％，茶皂素降解率随着KH₂PO₄添加量的增加而下降。磷是微生物细胞中如核蛋白﹑核酸、ATP﹑磷脂、辅酶等的重要原料，能保持细胞内ATP代谢的平衡，参与调节体内的酸碱平衡，参与体内能量的代谢。培养基中磷含量不足，影响微生物代谢生长速度，但磷含量超过微生物生长代谢的需要量，则对微生物的生长起抑制作用。因此选择0.1％的KH₂PO₄添加量为最佳添加量；

MgSO₄·7H₂O添加量，改变培养基中MgSO₄·7H₂O添加量(0.05％、0.1％、 0.15％、0.2％、0.25％)，其他条件不变，32℃恒温发酵5d，80℃烘干后，测定培养基中的茶皂素含量并计算茶皂素的降解率，结果见图6。从图6 可以看出，在一定范围内，茶皂素降解率随MgSO₄·7H₂O添加量的增加而增加，当MgSO₄·7H₂O添加量为0.15％时，茶皂素降解率最高达到48.83％。镁参与能量代谢、蛋白质和核酸的合成及催化酶的激活和抑制等。培养基中镁含量过低，会导致细胞膜和核糖体的稳定性降低，对微生物营养的吸收与蛋白质的合成产生影响，从而影响机体的正常生长代谢，但镁含量过高，对微生物生长代谢起抑制作用。因此选择0.15％的MgSO₄·7H₂O添加量为最佳添加量；

3)固体发酵条件的优化，含水量，在上述筛选出的适宜培养基配方的基础上，改变培养基的含水量，培养后测定茶皂素含量并计算茶皂素降解率，结果见图7。从图7可以看出，在含水量在40％～70％范围内，茶皂素降解率随含水量的增大而增加，在含水量为70％时茶皂素降解率最大，达到60.97％。当含水量超过70％时，茶皂素降解率显著降低。茶籽饼遇水易凝结，含水量过高的培养基易结块，菌体生长受抑制；同时含水量过低时，培养基较松散，不能给菌体提供适宜的生长环境。固体培养基的含水量是构成微生物生长代谢环境的重要因素，因此选择培养基的含水量70％为最佳含水量；

酵时间，不同的发酵时间对茶皂素降解率的影响如图8所示。从图8 可以看出，发酵初期随着时间的增加，茶皂素降解率逐渐增加，当发酵时间达到5d后，茶皂素降解率基本不发生变化，即培养基经5d发酵后，茶皂素的含量趋于稳定。因此选择5d作为后续研究的发酵时间；

接种量，不同的接种量对茶皂素降解率的影响如图9所示。从图9可知，不同的接种量对茶皂素的降解率差异显著。当接种量为15％时，茶皂素降解率最大，达到66.19％。接种量小于15％时，茶皂素降解率随接种量的增加而增加；接种量大于15％时，茶皂素降解率随接种量增加而下降。接种量过大，发酵前期菌体基数大，菌体大量生长使营养物质消耗过快，且从液体种子液带出的副产物过多，导致发酵延滞期延长，从而引起相同的发酵周期茶皂素的降解率低。因此选择15％为最佳接种量并进行后续研究；

初始pH值，不同的初始pH值对茶皂素降解率的影响如图10所示。从图10可以看出初始pH值对菌体的生长代谢影响显著，在一定范围内随着培养基初始pH值的升高，茶皂素降解率随之增加。当pH值为6.5时降解率最大，达到67.85％。不同的微生物都有适合生长的pH范围及最适的生长pH值，嗜酸小球菌的生长pH偏酸性范围，试验证明当初始pH值在酸性范围内时，培养基中的茶皂素降解率大于初始pH值在碱性范围内；同时过高或过低的pH值会影响菌体内酶的活性与稳定性，影响营养物质的溶解度及微生物对营养的吸收。因此选择pH为6.5作为培养基的初始 pH值；

种龄，不同的种龄对茶皂素降解率的影响如图11所示。从图11可以看出，当种龄在24h时，茶皂素降解率最大，达到68.65％。当种龄较低时，菌体处于延滞期，导致细胞增长速率过慢而延长延滞期；当种龄偏高时，菌体老化，菌种活力减弱，代谢产物增多，延长了发酵周期。因此选择24h作为最佳种龄；

正交试验，采用正交试验法，选定对茶皂素降解率影响较大的因素含水量、初始pH值、接种量、种龄进行四因素三水平正交；

从图12可分析得：通过极差值R的对比RA>RB>RD>RC，即各因素对茶皂素降解率的影响比较为含水量>初始pH值>种龄>接种量。实验条件下优化水平的最优组合为A₃B₁C₃D₂。即发酵培养基的最优组合为茶籽饼85％、麦麸15％、葡萄糖3％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄·7H₂O0.15％、含水量70％，培养条件为初始pH值为6.0、接种量为20％、种龄为24h、发酵时间为5d、发酵温度为32℃。在此工艺条件下，茶皂素降解率可以达到68.42％,比优化前提高了57.13％。

4)讨论与结论，微生物发酵法是对茶籽饼粕降解的主要方法，且被认为是目前发展潜力最大的茶籽饼粕脱毒处理方法。其原理是在茶籽饼粕中加入微生物进行发酵，使加入的微生物在发酵培养基上大量生长并同时将茶皂素分解利用，从而降低茶皂素的含量，达到去毒的目的，而且微生物在发酵过程中产生包括酶、促生长因子以及抗菌物质等有益的代谢产物，同时降低了茶籽饼粕中的单宁和纤维素等抗营养因子，加上使用的发酵微生物菌种本身是动物益生菌，能起到改善动物肠道微生态平衡的作用。

本试验以茶籽饼为原料，对茶籽饼生物脱毒及其发酵工艺的研究。通过单因素和正交试验考察茶籽饼粕添加量、碳源、氮源、无机盐种类和添加量、含水量、初始pH值、种龄、接种量、发酵时间等因素对茶皂素降解率的影响，优化了发酵培养基的组成及发酵条件，最终得到适宜的脱毒工艺条件。

结果表明，在茶籽饼脱毒过程中，含水量与初始pH值是影响茶皂素降解率的关键性因素，茶籽饼与麦麸比值为85:15、葡萄糖3％、KH₂PO₄ 0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.15％、含水量70％，培养条件为初始pH值为6.0、接种量为20％、种龄为24h、发酵时间为5d、发酵温度为32℃。在此条件下茶皂素降解率为68.42％。在此工艺条件下，固态发酵培养基配制完成后无需灭菌，这在一定程度上降低了能耗，且操作简单，对设备要求低，降低了生产成本，为茶籽饼生物脱毒技术的推广提供了技术支持。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：培养，所述培养包括：

种子液培养：将斜面菌种接种于种子液培养基中，于30℃﹑160r/min条件下培养24h，备用，嗜酸小球菌接种于MRS培养基中，在培养温度为37℃的恒温培养箱中静置培养24h，备用；

固体发酵培养：在250mL三角瓶中装入50g固体发酵培养基，以干基计，采用接种量为10%质量浓度，将培养好的种子液接入基础固体发酵培养基中，32℃恒温培养5d；

S2：测定，所述测定包括：

固体发酵样品茶皂素降解率的测定：采用香草醛-浓硫酸法测定；

茶皂素降解率的计算，茶皂素降解率=（发酵后茶皂素浓度/发酵前茶皂素浓度）×100%；

S3：固体发酵培养基的优化，保持基础培养基其它组成不变, 采用单因素试验法，依次改变培基的茶籽饼与麦麸的比例、葡萄糖添加量、KH₂PO₄添加量、MgSO₄•7H₂O添加量，等量接种种子液培养液于固体发酵培养基中进行固体发酵，测定发酵前后茶籽饼中茶皂素浓度，以茶皂素降解率为指标，优化筛选不同茶籽饼与麦麸的比例、葡萄糖添加量、KH₂PO₄添加量、MgSO₄•7H₂O添加量等对菌种降解茶皂素的影响，每处理三个平行；

S4：固体发酵条件的优化，通过改变影响发酵的条件, 测定发酵前后茶籽饼中茶皂素浓度，以茶皂素降解率为指标。

2.根据权利要求1所述的茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法，其特征在于：步骤S3中，依次改变培基的茶籽饼与麦麸的比例为95:5、90:10、85:15、80:20、75:25，葡萄糖添加量的比例为2%、3%、4%、5%、6%，KH₂PO₄添加量的比例为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%，MgSO₄•7H₂O添加量的比例为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%。

3.根据权利要求1所述的茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法，其特征在于：步骤S3中，所述MRS培养基为：蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、葡萄糖2%、吐温80 0.1mL、K₂HPO₄ 0.2 %、醋酸钠0.5 %、柠檬酸二铵0.2 %、MgSO₄•7H₂O 0.058 %、MnSO₄• 4H₂O 0.025%、蒸馏水100mL，pH值6.2～6.6，115℃灭菌25min。

4.根据权利要求3所述的茶籽饼生物脱毒工艺的试验方法，其特征在于：基础固体发酵培养基：茶籽饼粕90%、麦麸10%、葡萄糖4%﹑KH₂PO₄0.15%、MgSO₄•7H₂O 0.1% 、NaCl 3%、pH值7.5、固水比为1:0.5。

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