CN107287127B - 一株耐乳酸的产酯毕赤酵母 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐乳酸的产酯酵母菌，属于生物工程技术和酿酒生物技术领域。该菌株于2017年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其分类命名为库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)，保藏编号为CGMCC No：14068。该毕赤酵母环境耐受性强，可耐受0％‑15％浓度的乳酸，并可在0％‑12％乳酸环境下代谢产生乙酸乙酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯等多种乙酯类挥发性风味物质，是一株性能优良的酿酒功能菌株。

Description

一株耐乳酸的产酯毕赤酵母

技术领域

本发明属于生物工程技术和酿酒领域。涉及一株耐乳酸的产酯酵 母。

背景技术

中国白酒的主要成分是乙醇和水(占总量的98％－99％)，而占 总量1％-2％的微量成分(指溶于酒中的酯、酸、醇、醛等种类众多 的微量有机化合物)作为白酒的呈香呈味物质，却决定着白酒的风格 与品质。其中，微量成分中酯类物质具有芳香的风味物质，是形成酒 体香气浓郁的主要因素。在各香型白酒国家标准中，总酯含量是划分 白酒等级的重要指标，例如酱香型优级酒总酯含量应高于2.2g/L，浓 香型优级酒总酯含量应高于2.0g/L。同时，不同酯类物质各自具有独 特的香气特征，如乙酸乙酯香气较清纯优雅，丙酸乙酯果香舒适、乙 酸苯乙酯具有玫瑰的甜香，酒中酯类物质的多样性，有助于提升其风 味的丰富性与协调性。因此，如何提高白酒中酯类的含量及丰富白酒 中酯类的多样性，是白酒生产者普遍关注的问题。

酒中酯类物质主要是在酿造过程产酯酵母代谢生成，通过蒸馏取 酒环节进入。而酿造环境为酸性环境，酒醅中含有大量的乳酸，一般 不适合产酯酵母的生长繁殖，从而影响酯类物质的代谢生成。如专利 《一种高耐受性产酯酵母菌株及其应用》(专利号：201310191489.0) 中筛选获得了一株环境耐受性强且产乙酸乙酯能力强的酵母，但该专利并未阐述此酵母对酒醅中主要酸类物质——乳酸的耐受能力情况， 同时该酵母菌主要代谢产物只是乙酸乙酯，产酯种类较少。因此选育 适应性好、耐受性好，特别是耐受乳酸能力强、产酯丰富的酵母成为 解决这一难题的关键因素。

发明内容

针对上述提高酒中酯类种类与含量措施中存在的问题和缺陷，本 发明的目的是选育出一种能够在实际酿造环境下，特别是在高乳酸浓 度下能够代谢丰富的酯类物质的酵母菌。

一方面，本发明提供了一株高耐受乳酸的产酯毕赤酵母。

该毕赤酵母菌已于2017年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：14068，保藏 地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。分类命名为库德里阿兹威 氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)

1)菌株来源：本发明所获得的库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)，是从白酒酿造过程中分离得到，该毕赤酵母菌生长迅 速，适应性好、耐受乳酸能力强、产酯种类丰富且产量高。

2)形态特征：该毕赤酵母的菌落呈白色，表面粗糙，易挑取， 菌落较大。利用显微镜观察该菌株的细胞形态，在15×40倍下该菌株 细胞呈椭圆形，且有出芽，其繁殖方式为出芽。

3)耐受性：所述的耐乳酸产酯酵母可在0％-15％(体积浓度) 的乳酸浓度下生长繁殖，所述的耐乳酸产酯酵母的最高耐受温度为45 摄氏度，最适宜生长温度为30℃；最高耐受乙醇浓度为10％(体积浓 度)；最高耐受乙酸浓度为3％(体积浓度)。其可以在温度25℃-45℃、 乙醇浓度0％-10％(体积浓度)，乙酸浓度0％-3％(体积浓度)条件 下生长繁殖。

4)菌株种子液的培养方法：所述的耐乳酸产酯酵母菌株种子液 培养方法为：250mL的三角瓶中装入100mL液体培养基，121℃，灭 菌15min，再从斜面上挑取一环该菌株于培养液中，28℃-40℃，静止 培养2-4天即得。

其中，所述种子液培养基的含有：乳酸10-30g/L，葡萄糖10-30g/L， 蛋白胨15-30g/L，酵母膏5-15g/L，氯化钠0.5-1.5g/L，pH 3.2±0.5， 该pH为自然pH，无需通过酸碱调配)。

5)产酯特性：该库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) 在0％-12％乳酸环境下代谢产生乙酸乙酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、乙 酸苯乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸异戊酯和乳酸乙酯等多种乙酯类挥发性 风味物质中的一种或多种。

另一方面，本发明还提供了该毕赤酵母的代谢产物。所述的代谢 产物为乙酯类挥发性风味物质。其中，所述的乙酯类挥发性风味物质 包含乙酸乙酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯、乙 酸异戊酯和乳酸乙酯等多种风味物质。

另一方面，本发明还提供了该毕赤酵母在酿酒中的应用。该毕赤 酵母产生的乙酯类风味物质，可以提高白酒的风味和品质。

另一方面，本发明还提供了毕赤酵母用于酿酒的方法，其特征在 于，取下甑冷却后酒醅，加入糖化剂或大曲，再接入体积为酒醅质量 1％-5％的毕赤酵母种子液，搅拌均匀后堆积于室内，保持室内环境 温度为25℃-35℃之间，发酵3-5天后可提高酒醅中酯类物质含量。

本发明的有益效果：

本发明得到了一株耐受高浓度乳酸且产酯种类丰富的酵母菌，该 菌可在0％-15％(体积浓度)的乳酸浓度下生长繁殖，并在0％-12％ (体积浓度)乳酸环境下代谢产生乙酸乙酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、 乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯等多种乙酯类挥发性风味物质。

附图说明

图1为耐乳酸产酯酵母的菌株的菌落形态。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一 步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。需要说明的是， 本发明中“接入体积为酒醅质量1％-5％的毕赤酵母种子液”，其中， 毕赤酵母种子液的体积与酒醅质量的单位对应关系如mL/g，L/kg，或 者依次类推。

实施例1耐乳酸产酯毕赤酵母的筛选

称取大曲或酒醅样品10g于90mL带玻璃珠无菌水中，充分振荡均 匀，吸取0.1mL上清液到富集培养基液体中，30℃条件下静止培养2-4 天，观察培养液是否浑浊，并进行闻香；若培养液已明显浑浊且闻香 有愉悦的水果香气时，吸取0.1mL富集液于新的筛选培养基中再次进 行培养，培养3-4次后将培养液梯度稀释于平板上，培养3～4天后， 挑取单菌落进行发酵。发酵结束后，测定发酵液的风味物质，挑选产 酯能力最高的菌株即为目标菌株。

筛选培养基的组成为：乳酸20g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L， 酵母膏10g/L，氯化钠1g/L，pH 3.2(自然pH)。

发酵培养基的组成为：乳酸40g/L，葡萄糖50g/L，蛋白胨2g/L， 酵母膏1g/L，磷酸氢二钾1g/L，氯化钠1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰 0.05g/L，pH 2.9(自然pH)。

实施例2耐乳酸产酯毕赤酵母的鉴定

对获得的高效降解乳酸的菌株进行菌落形态观察(图1)，发现该 菌落呈白色，表面粗糙，易挑取，菌落较大。利用显微镜观察该菌株 的细胞形态，在15×40倍下该菌株细胞呈椭圆形，且有出芽，可初步 确定为酵母菌。利用酵母特异分类鉴定引物扩增菌株的26srDNA片 段，并将扩增产物连接到pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞， 提取质粒进行测序与比对，确定所筛得酵母的种属，其分类命名为： 库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)。已于2017年04月24 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号 为CGMCC No：14068。

实施例3不同耐受条件下菌株生长能力

酿造环境对微生物的生长及代谢有着十分重要的影响。而在白酒 酿造过程由于发酵温度、乙醇浓度、基质酸度等不断变化，造成微生 物所处环境也时刻发生变化，因此研究了该酵母菌株在不同发酵温度、 乙醇浓度、乙酸浓度、乳酸浓度条件下的生长情况。

温度耐受性实验：将活化后的毕赤酵母菌2％(毕赤酵母种子液 的体积/YPD液体培养基的体积)种子液接种到装有100mL YPD液体 培养基的三角瓶中，分别放置在25℃、30℃、37℃、42℃、45℃下条 件下静止培养4天后，测定600nm波长下的OD值，浓度大的菌液可以作适当稀释，经稀释后测得的OD值乘以稀释倍数，即为培养液实 际的OD值。从表1中可以看出，该毕赤酵母菌在42℃下仍有较高生长 量，在45℃下菌株生长微弱。因此该菌株的最高耐受温度为45℃，最 适生长温度30℃。

表1不同温度下毕赤酵母生长情况

温度	25℃	30℃	37℃	42℃	45℃	47℃
							OD值	32.6	34.7	33.8	16.2	0.26	0.06

乙醇耐受性实验：YPD液体培养基灭菌后，分别加入不同体积的 无水乙醇，使YPD液体培养基中乙醇的浓度为0％、2％、4％、6％、 8％、10％(体积浓度)的无水乙醇，然后将2％(毕赤酵母种子液的 体积/YPD液体培养基的体积)种子液接入，30℃条件下静止培养4天后，测定600nm波长下的OD值，浓度大的菌液可以作适当稀释， 经稀释后测得的OD值乘以稀释倍数，即为培养液实际的OD值。从 表2中可以看出，在一定范围内，随着乙醇浓度的升高，菌株生长旺 盛；但当乙醇浓度进一步上升时，该毕赤酵母菌受到明显抑制。

表2不同乙醇浓度下毕赤酵母生长情况

乙醇浓度	0％	2％	4％	6％	8％	10％
							OD值	34.7	45.6	49.8	48.7	33.9	10.1

乙酸耐受性实验：YPD液体培养基灭菌后，分别加入不同体积的 乙酸，使YPD液体培养基中乙酸的浓度为0％、0.5％、1％、2％、3％、 4％(体积浓度)的乙酸，然后将2％(毕赤酵母种子液的体积/YPD 液体培养基的体积)种子液接入，30℃条件下静止培养4天后，测定600nm波长下的OD值，浓度大的菌液可以作适当稀释，经稀释后 测得的OD值乘以稀释倍数，即为培养液实际的OD值。从表3中可 以看出，当乙酸浓度为0.5％时菌株生长OD值最高，但当乙酸为2％ 时菌株受到明显抑制，而在4％乙酸浓度下几乎停止生长，因此菌株 最高耐受3％乙酸。

表3不同乙酸浓度下毕赤酵母生长情况

乙酸浓度	0％	0.5％	1％	2％	3％	4％
							OD值	34.7	35.4	17.24	7.63	0.85	0.17

乳酸耐受性实验：YPD液体培养基灭菌后，分别加入不同体积的 乳酸，使YPD液体培养基中乳酸的浓度为0％、2％、4％、6％、8％、 10％、12％、15％(体积浓度)的乳酸，然后将2％(毕赤酵母种子 液的体积/YPD液体培养基的体积)种子液接入，30℃条件下静止培养4天后，测定600nm波长下的OD值，浓度大的菌液可以作适当稀 释，经稀释后测得的OD值乘以稀释倍数，即为培养液实际的OD值。 从表4中可以看出，当乳酸浓度为12％时菌株生长抑制严重，而乳酸 达到15％，菌株OD值只有0.5，因此菌株最高乳酸耐受浓度为15％。

表4不同乳酸浓度下毕赤酵母生长情况

乳酸浓度	0％	2％	4％	6％	8％	10％	12％	15％
									OD值	34.7	34.8	36.3	30.7	21.3	15.5	3.2	0.5

实施例4不同乳酸浓度条件下菌株产酯能力

在含有5％葡萄糖的YPD液体培养基中，分别加入不同体积的乳酸， 使YPD液体培养基中乳酸的浓度为0％、2％、4％、8％、10％、12％、 15％(体积浓度)的乳酸，然后将2％(毕赤酵母种子液的体积/YPD 液体培养基的体积)种子液接入，30℃条件下静止培养4天后，测定 发酵液中酯类物质的种类与含量。从表5中发现，该毕赤酵母菌株在 乳酸浓度为4％时产酯能力最强，在乳酸浓度为15％时产酯能力受到 严重抑制，表明该菌株可在0％-12％乳酸浓度下进行产酯，但不同酯 类物质在不同乳酸浓度下产量差异大，如乙酸乙酯在为4％乳酸浓度 时产量最高，丙酸乙酯在8％乳酸浓度时产量最高，而辛酸乙酯在0％ 乳酸浓度时产量最高。

表5不同乳酸浓度下毕赤酵母产酯能力(×10⁶峰面积)

实施例5固态发酵产酯能力

以蒸馏下甑后的酒醅(测得乳酸含量为2.43％)为基质，加入0.5％ (糖化酶的质量/酒醅质量)的糖化酶，再接入2％(毕赤酵母种子液 的体积/酒醅质量)的毕赤酵母种子液，搅拌均匀，30℃，静止培养4 天，以加入0.5％的糖化酶但不接菌液的酒醅为空白对照。培养结束 后，测定酒醅中酯类物质含量，结果见表6。从表6中可以看出，当在 酒醅中接入毕赤酵母后，酒醅中酯类含量都得到了不同幅度提升，其 中乙酸乙酯含量最高，其次为乙酸苯乙酯。

表6固态发酵条件下产酯能力(×10⁶峰面积)

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做 进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的进一步限定，本领域技 术人员在此基础上，作出的非突出实质性特征和非显著进步的改进， 仍然属于本发明的保护范畴。

Claims (3)

1.一株耐乳酸的产酯毕赤酵母，其分类命名为库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)，于2017年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：14068。

2.权利要求1所述的毕赤酵母在酿酒中的应用。

3.权利要求1所述的毕赤酵母用于酿酒的方法，其特征在于，取下甑冷却后酒醅，加入糖化酶或大曲，再接入体积为酒醅质量1％-5％的毕赤酵母种子液，搅拌均匀后堆积于室内，保持室内环境温度为25℃-35℃之间，发酵3-5天后可提高酒醅中酯类物质含量。

Images