CN108541755A - 一种抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，其特征在于：该方法使用的抑菌剂为天然肉桂醛精油，对链格孢菌有显著抑制作用，且最小抑制浓度（MIC）为0.2μL/mL。所述真菌毒素为Alternariol（AOH）和Alternariol monomethyl ether（AME），经过MIC和10×MIC浓度肉桂醛处理后，链格孢菌体内AOH和AME毒素含量显著下降。因此，肉桂醛精油作为一种安全无污染的天然防腐剂，不仅能控制葡萄采后病原菌链格孢菌，而且能降解其体内真菌毒素，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物防治中抑制病原菌及毒素降解技术领域，具体涉及一种抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法。
背景技术
葡萄鲜果甘甜多汁、营养丰富而深受人们的青睐。2014年中国鲜食葡萄年产量已达900万吨，位居世界首位。葡萄皮薄，肉软，含水量高，易受病菌侵染而腐烂变质。这给鲜食葡萄的贮藏、运输、延长销售时间等带来困难，造成巨大的经济损失；
葡萄采后腐烂的病原真菌主要为:灰霉、黑曲霉、青霉、根霉、链格孢和拟茎点霉等6个属。链格孢菌（Alternaria alternata）是葡萄采后优势致病菌之一，低温贮藏过程中仍能通过果梗潜伏侵染葡萄果实。在侵染部位产生局部的淡褐色或棕色腐败病斑，组织裂缝中长出绒毛状灰色真菌菌丛，果梗组织褐变腐烂，果粒脱落。此外，链格孢菌能够产生多种次级代谢产物，即链格孢毒素，可污染谷物，油籽和各种果蔬，对人和牲畜造成潜在的威胁。链格孢酚（Alternariol，AOH )和交链格孢酚单甲醚（Alternariol methyl ether，AME )为两种主要链格孢毒素，AOH和AME对哺乳动物细胞具有致突变性和细胞毒性；
肉桂醛是桂皮香料的提取物，它能够赋予食物独特的香味，同时可作为防腐剂的天然物质，已被广泛应用于食品、化妆品和医药领域。它具有杀菌、抑菌和抗氧化功效，且对多种果蔬致病菌具有很强的抑制效果。肉桂醛抑制采后真菌病害作用机理如下：1、破坏细胞壁、细胞膜功能，导致细胞内容物泄露；2、影响脂质层稳定；3、影响能量代谢及还原酶系。此外，大量文献报道肉桂醛对黄曲霉毒素具有很好的降解效果。但是，肉桂醛对采后葡萄链格孢菌的抑制及其体内毒素的降解，目前尚未有人作出相关研究。因此，该发明满足人们对鲜食葡萄的需求，以及带来巨大的生态、经济和社会效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，用于采后葡萄致病真菌的防治，以便满足人们对鲜食葡萄的需求。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现：
1. 一种抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，其特征在于：所述抑菌剂为天然肉桂醛精油（> 95%）；所述链格孢菌株（A-0913）分离纯化于红提葡萄果实，保存于湘潭大学生物与食品工程专业实验室；所述真菌毒素为AOH和AME毒素。
2. 一种如权利要求1所述抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，其特征在于：利用肉桂醛直接接触抑制采后葡萄链格孢菌生长，此方法包括如下步骤：
（1）制备马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB），将PDB培养基分装至150 mL锥形瓶中，每瓶100 mL，再向锥形瓶中加入吐温-80使其浓度为0.5%，于121 °C下，高压蒸汽灭菌 20 min；
（2）待所述步骤（1）中培养基灭菌完成后将其冷却至40-50 °C，加入肉桂醛使其终浓度分别为 0.00、0.0125、0.025、0.050、0.100和0.200 μL/mL，充分振荡摇匀；
（3）用6 mm的圆形打孔器在培养5 d的链格孢培养皿中打下菌苔，取2块菌苔接种到所述步骤（2）的锥形瓶中，于25 °C、150 rpm条件下振荡培养；
（4）培养96 h后取出所述步骤（3）中链格孢菌丝，无菌水冲洗3次后用无菌纱布过滤，然后置于80 °C干燥箱中直至恒重状态，随后对菌丝进行称量，并计算肉桂醛对链格孢菌丝生长的抑制率。
3. 一种如权利要求1所述抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，其特征在于：利用肉桂醛熏蒸抑制采后葡萄果实中链格孢菌的生长，此方法包括如下步骤：
（1）在超净工作台上将健康的葡萄果实用75%酒精进行表面消毒3~5 s，再放入0.1%次氯酸钠溶液中消毒2 min，最后用无菌水冲洗3次，晾干；
（2）用解剖刀在所诉步骤（1）中葡萄果实的赤道附近划一个1 cm×1 cm的伤口，再用移液枪吸取20 μL病原菌菌悬液（1×106 CFU/mL）置于伤口上，未接种病原菌的葡萄果 实作为对照组；
（3）将所述步骤（2）中处理后的葡萄果实分别置于含0、0.2 和2.0 μL/mL肉桂醛的密闭保鲜盒内，保鲜盒底部放有湿润的无菌纱布，置于4 °C恒温恒湿培养箱中培养至葡萄果实明显腐烂为止，观察放置过程中葡萄腐烂情况并拍照保存。
4. 一种如权利要求1所述抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，其特征在于：用肉桂醛降解链格孢菌体内真菌毒素，此方法包括如下步骤：
（1）用直径为6 mm的无菌打孔器在培养5 d的链格孢菌平板上打下菌苔，取两块菌苔放入100 mL 灭菌的马铃薯葡萄糖培养基（PDB）中，于25 °C、150 rpm振荡培养3 d；
（2）取出所述步骤（1）中的菌丝体，经四层纱布过滤后称取0.5 g 于研钵中研磨均匀；
（3）将所述步骤（2）中的菌丝体转移到10 mL离心管中，加入4 mL所述步骤（2）中的滤液，然后加入肉桂醛并使其浓度分别为0，MIC，10×MIC，最终使离心管总体积为5 mL，将其置于25 °C、150 rpm条件下孵育2 h；
（4）在所述步骤（3）中的离心管中加入含0.1%甲酸的乙腈-水（4:1，v/v）提取液5 mL，旋涡混合1 min，150 rpm室温振荡提取30 min；
（5）在所述步骤（4）中离心管中加入1.0 g MgSO4和0.4 g NaCl，旋涡混合1 min，于4 °C、4000 rpm条件下离心10 min；
（6）取所述步骤（5）中上清液过0.22 μm有机滤膜，滤液经HPLC分析。
5. 一种如权利要求1所述抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，其特征在于：利用肉桂醛降解葡萄果实中的链格孢毒素，此方法包括如下步骤：
（1）用手术刀将权利要求3中所有葡萄果实的腐烂部位切下，置于研钵中研磨均匀，并用无菌纱布过滤；
（2）将所述步骤（1）中滤液分为3组，每组3个重复，每个重复离心管中加入1.5 mL滤液。第1组每个离心管中加入肉桂醛并使其浓度为0.2 μL/mL，第2组每个离心管中加入肉桂醛并使其浓度为2.0 μL/mL，第3组不加肉桂醛作为对照组；
（3）将所述步骤（2）中离心管置于25 °C，150 rpm振荡培养箱中处理48 h；
（4）在所述步骤（3）中的离心管中加入含0.1%甲酸的乙腈-水（4:1，v/v）提取液1.5 mL，旋涡混合1 min，150 rpm室温振荡提取30 min；
（5）在所述步骤（4）中离心管中加入0.6 g MgSO4和0.2 g NaCl，旋涡混合1 min，于4 °C、4000 rpm条件下离心10 min；
（6）取所述步骤（5）中上清液过0.22 μm有机滤膜，滤液经HPLC分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的这种利用肉桂醛精油抑制葡萄采后链格孢菌及降解其体内真菌毒素的方法，肉桂醛接触法处理链格孢菌，以低剂量，达到对肉桂醛更有效的利用，同时降低葡萄采后由链格孢病原菌造成的损失；肉桂醛作为一种广谱高效、抑菌性强、安全无毒、性能稳定的天然抑菌物质，自然成为生物防治研究的重要内容；此外，经短时间肉桂醛处理，链格孢体内真菌毒素AOH和AME显著降低，该研究可以有效的应用于实际生活生产当中，将有效地降低AOH以及AME毒素对采后葡萄水果的污染。因此，该发明对采后真菌病害的抑制以及对水果的现代化生产中降解AOH与AME毒素具有理论指导意义和实际价值。
该发明的优点在于：操作简单易行、低剂量、高效能，具有良好的应用前景及市场价值。
附图说明
图1为肉桂醛直接接触对链格孢菌生长的影响。
图2为肉桂醛熏蒸对采后葡萄果实中链格孢菌生长的影响。
图3为真菌毒素AOH的标准曲线。
图4为真菌毒素AME的标准曲线。
图5为肉桂醛对链格孢菌丝体中毒素AOH、AME的降解作用。
图6为肉桂醛对葡萄果实中毒素AOH和AME的降解作用。
图7为肉桂醛降解真菌毒素AOH和AME的高效液相色谱图，其中A图为CK组，B图为肉桂醛处理组。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但实施例只用于说明本发明，而不是用于对本发明进行限定，任何在本发明基础上所做的修改、等同替换等均在本发明的保护范围内。
下述实施例中所用材料 ：
肉桂醛：购于上海达瑞精细化工品有限公司，其中肉桂醛的质量百分含量为95%；
链格孢真菌毒素AOH、AME标准品：购于Pribolab Pte. Ltd. Singapore。
实施例1 肉桂醛对链格孢菌丝体生长的影响
1、肉桂醛直接接触对链格孢菌生长的影响
（1）制备马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB），将PDB培养基分装至150 mL锥形瓶中，每瓶100 mL，再向锥形瓶中加入吐温-80使其浓度为0.5%，于121 °C下，高压蒸汽灭菌 20 min；
（2）待所述步骤（1）中培养基灭菌完成后将其冷却至40-50 °C，加入肉桂醛使其终浓度分别为 0.00、0.0125、0.025、0.050、0.100和0.200 μL/mL，充分振荡摇匀；
（3）用6 mm的圆形打孔器在培养5 d的链格孢培养皿中打下菌苔，取2块菌苔接种到所述步骤（2）的锥形瓶中，于25 °C、150 rpm条件下振荡培养；
（4）培养96 h后取出所述步骤（3）中链格孢菌丝，无菌水冲洗3次后用无菌纱布过滤，然后置于80 °C干燥箱中直至恒重状态，随后对菌丝进行称量，并计算肉桂醛对链格孢菌丝生长的抑制率。
2、肉桂醛熏蒸对葡萄果实中链格孢菌生长的影响
（1）在超净工作台上将健康的葡萄果实用75%酒精进行表面消毒3~5 s，再放入0.1%次氯酸钠溶液中消毒2 min，最后用无菌水冲洗3次，晾干；
（2）用解剖刀在所诉步骤（1）中葡萄果实的赤道附近划一个1 cm×1 cm的伤口，再用移液枪吸取20 μL病原菌菌悬液（1×106 CFU/mL）置于伤口上，未接种病原菌的葡萄果实作为对照组；
（3）将所述步骤（2）中处理后的葡萄果实分别置于含0、0.2 和2.0 μL/mL肉桂醛的密闭保鲜盒内，保鲜盒底部放有湿润的无菌纱布，置于4 °C恒温恒湿培养箱中培养至葡萄果实明显腐烂为止，观察放置过程中葡萄腐烂情况并拍照保存。
肉桂醛对链格孢菌丝体生长的影响如图1所示，低浓度肉桂醛（0.0125 μL/mL）对链格孢菌丝体的生长无显著影响，高浓度肉桂醛（≥ 0.025 μL/mL）对链格孢菌的生长具有明显的抑制作用，且随着浓度的增加抑制效果越好（P < 0.05）。培养96 h后，0.20 μL/mL浓度肉桂醛能完全抑制菌丝体的生长。因此，肉桂醛对链格孢菌丝体的最小抑制浓度为0.2 μL/mL。图2中显示，对照组中链格孢菌落已覆盖整个伤口并向周围蔓延，伤口处菌落呈墨绿色边缘菌丝为灰白色，果实伤口呈现暗黑色，MIC处理组中葡萄果实伤口处存在少量菌丝，伤口呈暗黑色，10×MIC处理组中葡萄果实未被链格孢病原菌侵染，果实伤口处也未见暗黑色病斑。因此，肉桂醛能显著抑制链格孢病原菌的生长，且随着浓度的增加抑制效果越明显。
实施例2 肉桂醛对链格孢真菌毒素AOH、AME的降解实验
1、真菌毒素AOH标准曲线制作
（1）将1.0 mg AOH毒素标准品用乙腈溶解，配制成浓度均为0.5 mg/mL标准储备液。取0.2 mL储备液于10 mL容量瓶甲醇定容，得浓度均为10 μg/mL的AOH毒素标准溶液。配得标准溶液均置于-20 °C冰箱中保存；
（2）根据需要将AOH标准溶液配制浓度为0.10、0.20、0.50、1.00、5.00和10.00 μg/mL的标准使用液；标准使用液现配现用，溶剂为甲醇溶液，配得标准使用液均置于-20 °C冰箱保存。
2、真菌毒素AME标准曲线制作
（1）将1.0 mg AME毒素标准品用乙腈溶解，配制成浓度均为0.5 mg/mL标准储备液。取0.4 mL储备液于10 mL容量瓶甲醇定容，得浓度均为20 μg/mL的AOH毒素标准溶液。配得标准溶液均置于-20 °C冰箱保存；
（2）根据需要将AOH标准溶液配制浓度为0.20、0.50、1.00、5.00、10.00和20.00 μg/mL的标准使用液；标准使用液现配现用，溶剂为甲醇溶液，配得标准使用液均置于-20°C冰箱保存。
3、链格孢真菌毒素AOH、AME的提取及检测
链格孢真菌毒素AOH、AME的提取：
称取已抽滤的供试菌丝体样品0.5 g冰浴研磨均匀，置于10 mL具塞离心管中；加入含0.1%甲酸的乙腈-水（80:20，V/V）提取液5 mL，涡旋混匀，150 r/min室温振荡提取30 min，再加入1.0 g无水MgSO4 和0.4 g NaCl，旋涡混匀1 min后，以4000 r/min离心10 min，取上清液过 0.22 μm有机滤膜，滤液经HPLC分析；
链格孢真菌毒素AOH、AME的检测：
HPLC检测条件：色谱柱：C18（250 mm × 4.6mm，5 μm）；柱温40 °C；流动相体系：0.1 %甲酸（A）和乙腈（B）；梯度洗脱程序：0 ~ 1 min，20 % ~ 55 % B；1 ~ 16 min，55 % ~ 60 %B；16 ~ 18 min，60 % ~ 80 % B；18 ~ 18.5 min，80 % ~ 20 % B；18.5 ~ 22 min，20 % B。进样量：20 μL；流速：1.0 mL/min。
4、肉桂醛对链格孢菌丝体中真菌毒素降解实验
（1）用直径为6 mm的无菌打孔器在培养5 d的链格孢菌平板上打下菌苔，取两块菌苔放入100 mL 灭菌的马铃薯葡萄糖培养基（PDB）中，于25 °C、150 rpm振荡培养3 d；
（2）取出所述步骤（1）中的菌丝体，经四层纱布过滤后称取0.5 g 于研钵中研磨均匀；
（3）将所述步骤（2）中的菌丝体转移到10 mL离心管中，加入4 mL所述步骤（2）中的滤液，然后加入肉桂醛并使其浓度分别为0，MIC，10×MIC，最终使离心管总体积为5 mL，将其置于25 °C、150 rpm条件下孵育2 h；
（4）在所述步骤（3）中的离心管中加入含0.1%甲酸的乙腈-水（4:1，v/v）提取液5 mL，旋涡混合1 min，150 rpm室温振荡提取30 min；
（5）在所述步骤（4）中离心管中加入1.0 g MgSO4和0.4 g NaCl，旋涡混合1 min，于4 °C、4000 rpm条件下离心10 min；
（6）取所述步骤（5）中上清液过0.22 μm有机滤膜，滤液经HPLC分析。
5、肉桂醛对葡萄果实中链格孢毒素的降解实验
（1）用手术刀将权利要求3中所有葡萄果实的腐烂部位切下，置于研钵中研磨均匀，并用无菌纱布过滤；
（2）将所述步骤（1）中滤液分为3组，每组3个重复，每个重复离心管中加入1.5 mL滤液。第1组每个离心管中加入肉桂醛并使其浓度为0.2 μL/mL，第2组每个离心管中加入肉桂醛并使其浓度为2.0 μL/mL，第3组不加肉桂醛作为对照组；
（3）将所述步骤（2）中离心管置于25 °C、150 rpm振荡培养箱中处理48 h；
（4）在所述步骤（3）中的离心管中加入含0.1%甲酸的乙腈-水（4:1，v/v）提取液1.5 mL，旋涡混合1 min，150 rpm室温振荡提取30 min；
（5）在所述步骤（4）中离心管中加入0.6 g MgSO4和0.2 g NaCl，旋涡混合1 min，于4 °C、4000 rpm条件下离心10 min；
（6）取所述步骤（5）中上清液过0.22 μm有机滤膜，滤液经HPLC分析。
肉桂醛对链格孢菌丝体中毒素AOH和AME的降解作用如图5所示，肉桂醛能有效降解AOH和AME这两种链格孢真菌毒素，且随着肉桂醛浓度的增加，降解效果越好。MIC和10×MIC浓度的肉桂醛处理120 min后，AOH含量从0.85 ± 0.025 μL/mL分别降到0.71 ±0.023 μL/mL、0.70 ± 0.052 μL/mL，降解率分别为16.47%、17.65%；AME含量从1.89 ±0.014 μL/mL分别降到1.75 ± 0.012 μL/mL、1.54 ± 0.014 μL/mL，降解率分别为7.41%、18.52%，图6为肉桂醛对葡萄果实中链格孢毒素AOH和AME的降解效果图，就毒素AOH而言，随着肉桂醛浓度的增加降解效果越好，处理48 h后MIC和10×MIC浓度的肉桂醛对毒素AOH的降解率分别为46.29%和59.81%，而就毒素AME而言，处理48 h后MIC肉桂醛处理组AME含量较CK组有所提高但无显著性差异，10×MIC处理组显著降更低了AME含量，降解率高达49.16%。综上，MIC和10×MIC浓度的肉桂醛对链格孢菌体内毒素AOH和AME均表现出较好地降解作用，但对葡萄果实中的毒素AOH和AME而言，MIC和10×MIC浓度的肉桂醛均可显著降解AOH，而AME却只能很好地被高浓度肉桂醛（10×MIC）所降解。
本发明的肉桂醛不仅能够抑制采后葡萄链格孢菌的生长，而且还能降解其体内真菌毒素。肉桂醛本身是一种食品添加剂，安全无毒，对多种采后致病菌都具有一定的抑制效果。因此，是一种极有潜力的新型的的果蔬保鲜剂。
Claims (5)
1.一种抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，其特征在于：所述抑菌剂为天然肉桂醛精油（> 95%）；所述链格孢菌株（A-0913）分离纯化于红提葡萄果实，保存于湘潭大学生物与食品工程专业实验室；所述真菌毒素为AOH和AME。
2.一种如权利要求1所述抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，其特征在于：利用肉桂醛直接接触抑制采后葡萄链格孢菌生长，此方法包括如下步骤：
（1）制备马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB），将PDB培养基分装至150 mL锥形瓶中，每瓶100 mL，再向锥形瓶中加入吐温-80使其浓度为0.5%，于121 °C下，高压蒸汽灭菌 20 min；
（2）待所述步骤（1）中培养基灭菌完成后将其冷却至40-50 °C，加入肉桂醛使其终浓度分别为 0.00、0.0125、0.025、0.050、0.100和0.200 μL/mL，充分振荡摇匀；
（3）用6 mm的圆形打孔器在培养5 d的链格孢培养皿中打下菌苔，取2块菌苔接种到所述步骤（2）的锥形瓶中，于25 °C、150 rpm条件下振荡培养；
（4）培养96 h后取出所述步骤（3）中链格孢菌丝，无菌水冲洗3次后用无菌纱布过滤，然后置于80 °C干燥箱中直至恒重状态，随后对菌丝进行称重，并计算肉桂醛对链格孢菌丝生长的抑制率。
3.一种如权利要求1所述抑制采后葡萄链格孢菌生长及降解其体内真菌毒素的方法，其特征在于：利用肉桂醛熏蒸抑制采后葡萄果实中链格孢菌的生长，此方法包括如下步骤：
（1）在超净工作台上将健康的葡萄果实用75%酒精进行表面消毒3~5 s，再放入0.1%次氯酸钠溶液中消毒2 min，最后用无菌水冲洗3次，晾干；
（2）用解剖刀在所诉步骤（1）中葡萄果实的赤道附近划一个1 cm×1 cm的伤口，再用移液枪吸取20 μL病原菌菌悬液（1×106 CFU/mL）置于伤口上，未接种病原菌的葡萄果实作为对照组；
（3）将所述步骤（2）中处理后的葡萄果实分别置于含0、0.2 和2.0 μL/mL肉桂醛的密闭保鲜盒内，保鲜盒底部放有湿润的无菌纱布，置于4 °C恒温恒湿培养箱中培养至葡萄果实明显腐烂为止，观察放置过程中葡萄腐烂情况并拍照保存。
4.一种如权利要求1所述抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，其特征在于：用肉桂醛降解链格孢菌丝体体内真菌毒素，此方法包括如下步骤：
（1）用直径为6 mm的无菌打孔器在培养5 d的链格孢菌平板上打下菌苔，取两块菌苔放入100 mL 灭菌的马铃薯葡萄糖培养基（PDB）中，于25 °C、150 rpm振荡培养3 d；
（2）取出所述步骤（1）中的菌丝体，经四层纱布过滤后称取0.5 g 于研钵中研磨均匀；
（3）将所述步骤（2）中的菌丝体转移到10 mL离心管中，加入4 mL所述步骤（2）中的滤液，然后加入肉桂醛并使其浓度分别为0，MIC，10×MIC，最终使离心管总体积为5 mL，将其置于25 °C、150 rpm条件下孵育2 h；
（4）在所述步骤（3）中的离心管中加入含0.1%甲酸的乙腈-水（4:1，v/v）提取液5 mL，旋涡混合1 min，150 rpm室温振荡提取30 min；
（5）在所述步骤（4）中离心管中加入1.0 g MgSO4和0.4 g NaCl，旋涡混合1 min，于4 °C、4000 rpm条件下离心10 min；
（6）取所述步骤（5）中上清液过0.22 μm有机滤膜，滤液经HPLC分析。
5.一种如权利要求1所述抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，其特征在于：利用肉桂醛降解葡萄果实中的链格孢毒素，此方法包括如下步骤：
（1）用手术刀将权利要求3中所有葡萄果实的腐烂部位切下，置于研钵中研磨均匀，并用无菌纱布过滤；
（2）将所述步骤（1）中滤液分为3组，每组3个重复，每个重复离心管中加入1.5 mL滤液，第1组每个离心管中加入肉桂醛并使其浓度为0.2 μL/mL，第2组每个离心管中加入肉桂醛并使其浓度为2.0 μL/mL，第3组不加肉桂醛作为对照组；
（3）将所述步骤（2）中离心管置于25 °C、150 rpm振荡培养箱中处理48 h；
（4）在所述步骤（3）中的离心管中加入含0.1%甲酸的乙腈-水（4:1，v/v）提取液1.5 mL，旋涡混合1 min，150 rpm室温振荡提取30 min；
（5）在所述步骤（4）中离心管中加入0.6 g MgSO4和0.2 g NaCl，旋涡混合1 min，于4 °C、4000 rpm条件下离心10 min；
（6）取所述步骤（5）中上清液过0.22 μm有机滤膜，滤液经HPLC分析。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180918 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |