CN109527077A - 一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法，其特征在于：所用的抑菌物质为天然丁香酚精油，具有广谱抑菌性，且无污染无残留，对人体和环境友好；所用的海泡石为湖南省湘潭市含量丰富的特种稀有非金属矿，具有丰富的孔结构、巨大的比表面积，以及极佳的吸附性能，两者结合，制备新型的海泡石吸附精油复合材料，既有效的克服了精油易挥发不稳定的缺点，又达到了协同增大抗菌的效果，延长了精油作用的时间，因此，该发明具有广阔的市场前景。同时，也有利于葡萄采后贮藏保鲜，经济效益和社会效益十分显著。
Description
技术领域
本发明属于水果保鲜技术领域，具体涉及一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法。
背景技术
葡萄是中国栽培面积最普遍的三大水果之一，同时也是经济林中干鲜果品类的主要林木，葡萄鲜果甘甜多汁，营养丰富而深受人们的青睐，截至2015年底，我国葡萄栽培面积高达79.9万公顷，具有很大的经济价值。然而葡萄皮薄，肉软，含水量高，易受病菌浸染而腐烂变质。这给鲜食葡萄的贮藏、运输、延长销售时间等带来困难，造成巨大的经济损失。
葡萄采后腐烂的病原真菌主要为:灰霉、黑曲霉、青霉、根霉、链格孢和拟茎点霉等6个属。链格孢菌（Alternaria alternata）是葡萄采后优势致病菌之一，它不仅可在果园、运输及贮藏过程中引起果蔬的腐败，且在低温低湿环境中也表现出很强的生长和繁殖能力，导致冷藏水果和蔬菜的腐败变质。此外，链格孢菌能够产生多种次级代谢产物，对人和牲畜造成潜在的威胁。目前，化学杀菌剂如SO2主要被应用于控制葡萄采后病害。尽管其在控制腐烂和防止茎褐变方面具有显著的效果，但其毒性大、环境污染严重，给人类健康带来严重威胁，许多化学杀菌剂的使用在很多国家遭到限制。而且正由于这些药剂长期使用使致病菌产生抗药性，导致采后病害控制方法更加复杂化，影响保鲜效果。因此，寻找一种安全可靠、低毒的化学品来控制葡萄采后病害对葡萄产业的发展具有重大意义。
丁香酚是富含丁香油的为桃金娘科植物丁香的提取物，为无色或淡黄色液体，因其具有镇痛、局部麻醉、抗炎和抗菌作用而广泛应用于食品、化妆品和医药领域，它对许多食品中所含腐败微生物具有良好的抑制作用，是很好的杀菌消毒防腐剂，属于食品和药物管理局通常公认为安全的一类精油。然而，由于植物精油本身带有气味，且沸点较低，容易在常温下挥发。因此，提高植物精油的持效性和减小其气味是目前植物精油应用于果蔬保鲜研究的关键问题。基于现状，探索出一种高效廉价且无污染无残留的物质来吸附精油，从而延长精油的抑菌效果迫在眉睫。海泡石以其独特的结构具有极佳的吸附性能，且因在湖南湘潭储藏量大、安全、无污染等特点使其成为研究吸附精油物质的最佳选择。目前尚未有人做出相关研究。因此，该发明满足人们对鲜食葡萄的需求，以及带来巨大的生态、经济和社会效益。
发明内容
本发明针对现有葡萄果实防腐保鲜技术的现状，提供一种安全、高效、操作方便的海泡石吸附精油控制葡萄采后病害发生的防腐保鲜的方法，延长葡萄贮藏期和货架期，提高商品价值和经济效益以便满足人们对鲜食葡萄的需求。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
1. 一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法，其特征在于：海泡石作为吸附剂采购于湖南湘潭，所述精油为天然丁香酚精油（> 95%）作为抑菌物质。
2. 一种如权利要求1所述一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法，其特征在于：吸附前先对海泡石进行活化。
3. 一种如权利要求1所述一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法，其特征在于：采用酸活化的方法处理海泡石，选取盐酸、硫酸、硝酸一种或是两种，将海泡石浸入1.0~2.0 mol/L 所述酸溶液中，在磁力搅拌器上搅拌0.5 h~1.5 h后静置一段时间，水洗至中性，干燥，研磨，过筛，称重，即得到活化的海泡石。
4.一种如权利要求1所述一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法，其特征在于：利用海泡石丰富的孔结构和巨大的比表面积将丁香酚吸附于海泡石孔径中，延长精油作用的周期，达到缓释的效果，此方法包括如下步骤：
（1）称取等量的海泡石原矿和活化后的海泡石，加入相同体积的丁香酚，使其饱和吸附，制备海泡石/精油复合材料；
（2）设置纯精油、未活化海泡石/精油、活化海泡石/精油三组，置于敞开的环境中于室温（4°C）下自然挥发；
（3）使用超声波萃取的方法用乙酸乙酯反复提取样品中剩余精油的含量，将所得提取物于4°C、4000 rpm条件下离心10 min，收集上清液，每隔两天测定一次精油的含量；
（4）将所述步骤（3）中上清液过0.22 μm有机滤膜，滤液经GC分析。
5. 一种如权利要求1所述一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法，其特征在于：利用海泡石/精油复合材料直接接触抑制葡萄采后链格孢菌生长，此方法包括如下步骤：
（1）制备马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）：称取40 g马铃薯将其切成小块放入锅中，加入200 mL蒸馏水，煮沸并保持几分钟后，用双层纱布过滤，取出滤液加入4 g葡萄糖及4 g琼脂，最后用蒸馏水将其定容至200 mL；
（2）链格孢菌菌悬液的制备：供试菌株采取平板划线法接种到PDA培养基上，于25℃隔水式培养箱中倒置培养5 d，在无菌操作台上用无菌水将孢子洗脱，充分震荡，用两层纱布过滤，并将滤液摇匀，即可得到菌悬液，最后用血球计数板在显微镜的观察下将链格孢菌孢子的浓度控制在1×105-1×106CFU/mL;
（3）抑菌圈的测定：根据污染食物技术法（Poisoned Food Technique）研究丁香酚对链格孢菌菌丝体生长的影响，具体操作过程为：将高压灭菌后的PDA培养基冷却到45℃左右，用移液枪加入80 μL菌悬液并用涂布棒涂布均匀后静置几分钟，然后用直径为6mm的打孔器在PDA平板的中间打孔，再分别将无菌水、海泡石、精油、活化海泡石/精油的复合材料以及未活化海泡石/精油的复合材料加到不同平板的这个孔中，每组处理重复3次，并于25℃的恒温培养箱培养6d，采用十字交叉法每天测量菌斑的直径。
6. 一种如权利要求1所述一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法，其特征在于：采用熏蒸的方法抑制葡萄采后果实中链格孢菌的生长，此方法包括如下步骤：
（1）在超净工作台上将健康的葡萄果实用75%酒精进行表面消毒3~5 s，再放入0.1%次氯酸钠溶液中消毒2 min，最后用无菌水冲洗3次，在自然通风条件下晾干；
（2）用手术刀在所述步骤（1）中的葡萄果实赤道附近划一个5 mm×5 mm的伤口，再用移液枪吸取10 μL链格孢菌菌悬液（1×106 CFU/mL）置于伤口上；
（3）将所述步骤（2）处理后的葡萄果分别置于CK（未添加任何材料）、纯精油、活化海泡石/精油、未活化海泡石/精油复合材料的密闭保鲜盒内，保鲜盒底部放有湿润的无菌纱布，置于4°C恒温恒湿培养箱中培养至葡萄果实明显腐烂为止，观察放置过程中葡萄腐烂情况并拍照保存。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的这种利用海泡石吸附植物精油来抑制葡萄采后病害发生的方法，丁香酚作为一种广谱高效、抑菌性强、安全无毒、性能稳定的天然抑菌物质，自然成为生物防治研究的重要内容；此外湖南湘潭海泡石储量巨大，具有广阔的发展前景，大大提高海泡石的附加值，实现资源的充分利用，将海泡石用作载体也更具有成本优势。将两者结合，使丁香酚充分的吸附在海泡石的孔道内，可以有效克服精油易挥发、不稳定的缺点，延长其有效使用时间，协同增大抗菌效果，开发出一种新型的复合保鲜材料，为我国农业果蔬储运实践提供理论参考。
该发明的优点在于：操作简单易行、低剂量、高效能，具有良好的应用前景及市场价值。
附图说明
图1为酸活化前后海泡石的比表面积以及孔的体积。
图2 为海泡石活化前后的红外光谱图。
图3 为海泡石活化前后的扫描电镜图。
图4 为海泡石活化前后的XRD图谱。
图5 为丁香酚的标准曲线。
图6 为丁香酚标准品的气相色谱图。
图7 为常温下丁香酚的挥发。
图8 为海泡石吸附丁香酚复合材料直接接触对链格孢菌生长的影响。
图9为海泡石吸附丁香酚复合材料熏蒸对葡萄采后果实中链格孢菌生长的影响。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但实施例只用于说明本发明，而不是用于对本发明进行限定，任何在本发明基础上所做的修改、等同替换等均在本发明的保护范围内。
下述实施例中所用材料：
海泡石：采购于湖南省湘潭海泡石科技有限责任公司，
丁香酚：购于上海达瑞精细化工品有限公司，其中丁香酚的质量百分含量为95%。
实施例1海泡石的活化以及对丁香酚的缓释
1、活化海泡石
（1）称取海泡石于烧杯中加入适量的蒸馏水，在磁力搅拌器上搅拌30 min，使海泡石充分混合均匀；
（2）将所述步骤（1）中的混合溶液装入50 ml 离心管中，于4°C、4000 rpm条件下离心2min，除去溶于水的杂质；
（3）重复步骤（2）反复离心，直至上层液澄清为止，将所得的海泡石放入干燥箱于70 °C下干燥至恒重，研磨后过80目筛待用；
（4）将处理后的海泡石置于烧杯中，加入浓度为1 mol/L的盐酸中，在磁力搅拌器上充分搅拌均匀后静置48 h；
（5）将步骤（4）中的溶液装入离心管中，于4°C、4000 rpm条件下离心2 min，重复操作，直至上清液呈中性为止；
（6）将所得海泡石干燥、过筛、称重、保存，进行BET、XRD、FT-IR、SEM测试。
2、丁香酚标准曲线的制作
取一定的丁香酚标准品加入乙酸乙酯溶液中，其中丁香酚的浓度为20 μL/mL，然后分别吸取2000 μL、1000 μL、500 μL、250μL、125 μL、62.5 μL、31.3 μL、0 μL的母液添加到试管中，乙酸乙酯定容至10 mL，使溶液最终丁香酚的浓度为4.0 μL/mL、2.0 μL/mL、1.0 μL/mL、0.5 μL/mL、0.25 μL/mL、0.125 μL/mL、0.063 μL/mL、0 μL/mL每个样品在相同气相条件下进样三次，测定其峰面积，制作标准曲线。
3、气相色谱检测条件
使用GC-7890气相色谱系统，氮气作为载体和氢火焰离子化检测器进行气相色谱分离。HP-5MS 弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm），升温程序：起始温度40°C保留1 min，以10 °C /min升至 60 °C，再以15 °C /min升至150 °C，最后以10°C /min 升至200°C并保留一分钟，总时长为15min，检测器温度为250 °C，流速1 mL/min，分流比为10:1，进样量1μL。
4、海泡石吸附精油复合材料的缓释
用气相色谱法检测海泡石对植物精油释放的效果。于室温（25℃）下对精油、活化的海泡石吸附精油复合材料以及未活化的海泡石吸附精油复合物的挥发效果进行测量对比。使用超声波萃取方法，用乙酸乙酯对样品中残留的精油进行反复提取，并将提取物离心，取上清液并通过0.22 μm有机滤膜进行过滤，再用气相色谱法对滤液进行测量。每3天测量一次丁香酚的残留量。
从图1可以看出，经酸活化48 h后，海泡石的比表面积从71.961 m2/g上升至90.664 m2/g，增加了25.6%，孔的容积从0.228 cc/g 上升至0.357 cc/g 增加了56.6%；图2为海泡石活化前后的红外光谱图，2921、2367 cm-1处为CO3 2-特征峰，海泡石活化后，CO3 2-特征峰减弱或消；从图3可以看到未经活化的海泡石在扫描电镜下呈毛发状、针状或纤维状束集合体，排列较为紧密，呈片状的为杂质矿物滑石，而经过酸活化条件改性的海泡石，纤维束排列松散，间隙更为整洁、通畅，孔隙率增大；从图4海泡石的XRD图谱可以看出，海泡石活化前后骨架结构并未发生变化；根据丁香酚标准品的气相色谱图（图6）得到了丁香酚的标准曲线（图5），从标准曲线可以看出丁香酚在所测的浓度范围内(0~4 μL/mL)线性关系良好；未活化海泡石/精油复合材料以及活化海泡石/精油复合材料在常温下自然挥发的结果如图7所示，这三种样品中丁香酚的初始浓度保持一致为3.0μL/mL，随着时间的推移，仅精油处理组变化最明显，挥发速度最快，第9天，未活化海泡石/精油复合材料以及活化海泡石/精油复合材料中精油的含量分别为0.39和0.94μL/mL，而仅精油组基本完全挥发；未活化海泡石/精油复合材料组气相色谱在第12天基本上检测不到精油的残留量，而活化海泡石/精油复合材料在第18天才挥发完全，在整个过程中，活化海泡石/精油复合材料中精油的含量远远高于其他两组。
综上，海泡石经酸活化后溶解了CaCO3等杂质，改善了海泡石的表面性质，使其内部通道和孔洞被连通，提高了海泡石的纯度，改性后的海泡石拥有更大的比表面积，和较好的吸附性能。海泡石通过吸附作用将丁香酚吸附在孔道内，在丁香酚的起始浓度一致的条件下，未活化的海泡石和活化的海泡石吸附精油后均比精油本身作用的时间长，其中活化的海泡石吸附精油作用时间延长至18天，达到了缓释的效果。
实施例2海泡石/丁香酚复合材料对链格孢菌生长的影响
1、海泡石/丁香酚复合材料直接接触抑制葡萄采后链格孢菌生长
（1）制备马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）：称取40 g马铃薯将其切成小块放入锅中，加入200 mL蒸馏水，煮沸并保持几分钟后，用双层纱布过滤，取出滤液加入4 g葡萄糖及4 g琼脂，最后用蒸馏水将其定容至200 mL；
（2）链格孢菌菌悬液的制备：供试菌株采取平板划线法接种到PDA培养基上，于25℃隔水式培养箱中倒置培养5 d，在无菌操作台上用无菌水将孢子洗脱，充分震荡，用两层纱布过滤，并将滤液摇匀，即可得到菌悬液，最后用血球计数板在显微镜的观察下将链格孢菌孢子的浓度控制在1×105-1×106CFU/mL；
（3）抑菌圈的测定：根据污染食物技术法（Poisoned Food Technique）研究丁香酚对链格孢菌菌丝体生长的影响。具体操作过程为：将高压灭菌后的PDA培养基冷却到45℃左右，用移液枪加入80 μL菌悬液并用涂布棒涂布均匀后静置几分钟，然后用直径为6mm的打孔器在PDA平板的中间打孔，再分别将无菌水、海泡石、精油、活化海泡石/精油的复合材料以及未活化海泡石/精油的复合材料加到不同平板的这个孔中，每组处理重复3次，并于25℃的恒温培养箱培养6d，采用十字交叉法每天测量菌斑的直径。
2、海泡石/丁香酚后熏蒸对葡萄果实中链格孢菌生长的影响
（1）在超净工作台上将健康的葡萄果实用75%酒精进行表面消毒3~5 s，再放入0.1%次氯酸钠溶液中消毒2 min，最后用无菌水冲洗3次，在自然通风条件下晾干；
（2）用手术刀在所述步骤（1）中的葡萄果实赤道附近划一个5×5 mm的伤口，再用移液枪吸取10 μL链格孢菌菌悬液（1×106 CFU/mL）置于伤口上；
（3）将所述步骤（2）处理后的葡萄果实分别置于CK（未添加任何材料）、纯精油、活化海泡石/精油、未活化海泡石/精油复合材料的密闭保鲜盒内，保鲜盒底部放有湿润的无菌纱布，置于4 °C恒温恒湿培养箱中培养至葡萄果实明显腐烂为止，观察放置过程中葡萄腐烂情况并拍照保存。
根据图8可以明显看出，无菌水和海泡石的PDA平板没有形成抑菌圈，e活化海泡石/精油复合材料培养6天的链格孢菌抑菌圈直径（3.73±0.40 cm）显著高于aCK（0.00±0.00 cm）、b海泡石（0.00±0.00 cm）、c精油（3.53±0.25 cm）和d未活化的海泡石/精油的复合材料（3.40±0.42 cm）组，说明海泡石和精油的复合材料有抑菌作用，且活化海泡石和精油的复合材料较精油有更持久的抑菌效果。图9中显示，对照组中链格孢菌落已覆盖整个伤口并向周围蔓延，伤口处菌落呈墨绿色边缘菌丝为灰白色，果实伤口呈暗黑色；纯精油处理组和未活化/精油处理组存在部分果实被侵染，伤口处含有少量菌丝；活化海泡石/精油处理组中葡萄果实未被链格孢病原菌侵染，果实处也未见病斑。因此，丁香酚能显著抑制链格孢病原菌的生长，且被海泡石吸附以后可达到缓释的效果。
本发明的海泡石是一种天然的矿物质，且为湖南湘潭特色产业，储藏量丰富，应用前景广阔且价格低廉，而其特殊的孔结构和巨大的比较面积又赋予海泡石良好的吸附性能，丁香酚是一种食品添加剂，安全无毒，对多种采后致病菌都具有一定的抑制效果，二者结合起来制备海泡石吸附精油的复合材料，协同增大抗菌效果，因此，是一种极具潜力的新型果蔬保鲜剂。
Claims (6)
1. 一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法，其特征在于：海泡石作为吸附剂采购于湖南湘潭，所述精油为天然丁香酚精油（> 95%）作为抑菌物质。
2.一种如权利要求1所述一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法，其特征在于：吸附前先对海泡石进行活化。
3.一种如权利要求1所述一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法，其特征在于：采用酸活化的方法处理海泡石，选取盐酸、硫酸、硝酸一种或是两种，将海泡石浸入1.0~2.0 mol/L 所述酸溶液中，在磁力搅拌器上搅拌0.5 h~1.5 h后静置一段时间，水洗至中性，干燥，研磨，过筛，称重，即得到活化的海泡石。
4.一种如权利要求1所述一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法，其特征在于：利用海泡石丰富的孔结构和巨大的比表面积将丁香酚吸附于海泡石孔径中，延长精油作用的周期，达到缓释的效果，此方法包括如下步骤：
（1）称取等量的海泡石原矿和活化后的海泡石，加入相同体积的丁香酚，使其饱和吸附，制备海泡石/精油复合材料；
（2）设置纯精油、未活化海泡石/精油、活化海泡石/精油三组，置于敞开的环境中于室温（4°C）下自然挥发；
（3）使用超声波萃取的方法用乙酸乙酯反复提取样品中剩余精油的含量，将所得提取物于4°C、4000 rpm条件下离心10 min，收集上清液，每隔两天测定一次精油的含量；
（4）将所述步骤（3）中上清液过0.22 μm有机滤膜，滤液经GC分析。
5.一种如权利要求1所述一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法，其特征在于：利用海泡石/精油复合材料直接接触抑制葡萄采后链格孢菌生长，此方法包括如下步骤：
（1）制备马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）：称取40 g马铃薯将其切成小块放入锅中，加入200 mL蒸馏水，煮沸并保持几分钟后，用双层纱布过滤，取出滤液加入4 g葡萄糖及4 g琼脂，最后用蒸馏水将其定容至200 mL；
（2）链格孢菌菌悬液的制备：供试菌株采取平板划线法接种到PDA培养基上，于25 ℃隔水式培养箱中倒置培养5 d，在无菌操作台上用无菌水将孢子洗脱，充分震荡，用两层纱布过滤，并将滤液摇匀，即可得到菌悬液，最后用血球计数板在显微镜的观察下将链格孢菌孢子的浓度控制在1×105-1×106CFU/mL;
（3）抑菌圈的测定：根据污染食物技术法（Poisoned Food Technique）研究丁香酚对链格孢菌菌丝体生长的影响，具体操作过程为：将高压灭菌后的PDA培养基冷却到45℃左右，用移液枪加入80 μL菌悬液并用涂布棒涂布均匀后静置几分钟，然后用直径为6mm的打孔器在PDA平板的中间打孔，再分别将无菌水、海泡石、精油、活化海泡石/精油的复合材料以及未活化海泡石/精油的复合材料加到不同平板的这个孔中，每组处理重复3次，并于25℃的恒温培养箱培养6d，采用十字交叉法每天测量菌斑的直径。
6.一种如权利要求1所述一种海泡石/精油复合材料对葡萄采后链格孢防治的方法，其特征在于：采用熏蒸的方法抑制葡萄采后果实中链格孢菌的生长，此方法包括如下步骤：
（1）在超净工作台上将健康的葡萄果实用75%酒精进行表面消毒3~5 s，再放入0.1%次氯酸钠溶液中消毒2 min，最后用无菌水冲洗3次，在自然通风条件下晾干；
（2）用手术刀在所述步骤（1）中的葡萄果实赤道附近划一个5 mm×5 mm的伤口，再用移液枪吸取10 μL链格孢菌菌悬液（1×106 CFU/mL）置于伤口上；
（3）将所述步骤（2）处理后的葡萄果分别置于CK（未添加任何材料）、纯精油、活化海泡石/精油、未活化海泡石/精油复合材料的密闭保鲜盒内，保鲜盒底部放有湿润的无菌纱布，置于4°C恒温恒湿培养箱中培养至葡萄果实明显腐烂为止，观察放置过程中葡萄腐烂情况并拍照保存。
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