CN109619168B - 肉桂精油在蓝莓抑菌保鲜上的应用及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肉桂精油在蓝莓抑菌保鲜上的应用及应用方法，从蓝莓果实采后主要致病菌入手，研究了肉桂精油对其的抑菌效果，为避免肉桂精油对蓝莓果实品质的影响，提供了两种既能有效起到抑菌和保鲜效果，即一种抑菌保鲜微胶囊和一种抑菌保鲜油相固定吸附石，这两种应用形式不会产生药害，另外还研发了和这两种应用形式配套使用的装置。

Description

肉桂精油在蓝莓抑菌保鲜上的应用及应用方法

技术领域

本发明涉及抑菌、保鲜技术领域，具体为一种肉桂精油在蓝莓抑菌和保鲜上的应用及应用方法。

背景技术

蓝莓是一种集营养保健和经济价值于一体的新兴小浆果。但同时蓝莓果实果肉软、皮薄、多汁，采收、包装及贮运过程中易造成机械损伤，极易受到病原菌的侵染，导致采后病害发生严重，贮藏及货架期缩短，其中，由各种真菌病原体引起的采后腐烂是商业蓝莓生产中面临的一个重要问题，严重制约蓝莓产业的健康发展。传统的化学杀菌剂浸果方式易破坏果实表面的蜡质层，影响采后品质的维持；频繁和高浓度使用化学药剂会造成环境污染，果实残留及抗药性增强等问题。而采用辐照、臭氧等新兴方法成本较高，难以大规模推广应用。因此，亟需寻找一种不破坏蓝莓果实、采用非直接接触性作用方式发挥作用的天然杀菌保鲜方法。

植物精油是从植物中提取的具有挥发性、分子量较小的次生代谢产物。它是一类安全、低毒、高效的植物源食品保鲜剂，具有广谱抗细菌、抗真菌和抗氧化等作用，可以采用直接接触和熏蒸的作用方式，已逐渐应用于食品保鲜中，特别是对多种果蔬采后病原菌有较强的抑制作用，能降低采后病害的发生。但是，大部分精油都具有一定的刺激性气味，而不同的作用受体对气味的吸纳力不同，我们前期试验表明，葡萄、冬枣、桃子、苹果等对精油吸附力较强，因此，不推荐使用，而蓝莓经精油熏蒸处理后，基本没有味道，所以，精油熏蒸作用于蓝莓抑菌具有独到的优势。另一方面，精油自身挥发太快，因此，需要一定的载体或包埋材料结合保鲜装置来控制其释放速率，使得抑菌及保鲜效果更为精准。但目前有关这个方面的研究尚未见报道。

发明内容

本发明针对以上不足之处，提供了一种肉桂精油在抑菌保鲜上的应用及应用方法，从蓝莓果实采后主要致病菌入手，研究了肉桂精油对其的抑菌效果，为避免肉桂精油对蓝莓果实品质的影响，提供了两种既能有效起到抑菌和保鲜效果，又不会产生药害的应用形式及配套使用装置。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：肉桂精油在抑制尖孢镰刀菌、链格孢菌、灰葡萄孢菌生长上的应用。

肉桂精油在采后病害，延长贮藏期上的的应用。

所述尖孢镰刀菌、链格孢菌、灰葡萄孢菌分离自蓝莓。

一种抑菌保鲜微胶囊，所述胶囊以β-环糊精和明胶（质量比3:1）为壁材，以肉桂精油、柠檬草精油、薰衣草精油（体积比10:3:1）为芯材，壁芯质量比为5:1，通过饱和水溶液法制备。

所述胶囊的应用方法是将胶囊和需要抑菌或保鲜的物质放置在一个密闭空间内。

一种抑菌保鲜油相固定吸附石，将肉桂精油均匀滴加于油相固定吸附石的孔隙上，所述吸附石为陶瓷或石膏。

所述抑菌保鲜油相固定吸附石的应用方法是将抑菌保鲜油相固定吸附石固定于真菌培养皿及抑菌保鲜盒上使用。

所述抑菌保鲜盒包含有盒体其上密封的盒盖，盒体内部设置有若干分层置物架，所述分层置物架上表面设置有若干内陷的置物格，所述分层置物架下表面、置物格之间设置有通道，所述抑菌或保鲜微胶囊分点到每个置物格，所述抑菌保鲜油相固定吸附石固定于盒体的内壁上。

所述密闭空间为抑菌保鲜盒，所述抑菌保鲜盒包含有盒体及其上密封的盒盖，盒体内部设置有若干分层置物架，所述分层置物架上表面设置有若干内陷的置物格，所述分层置物架下表面、置物格之间设置有通道，所述抑菌保鲜微胶囊分点到每个置物格内。

本发明的优点在于：

1、肉桂精油作为从植物中提取的具有挥发性的天然次生代谢产物，是一类安全、无毒、高效的植物源食品保鲜剂，具有广谱抗细菌、抗真菌和抗氧化作用，可以采用直接接触和熏蒸的方式，已逐渐应用于果蔬保鲜中。

2、本发明开发了一种抑菌或保鲜微胶囊：内含抑菌成分肉桂精油、柠檬草精油、薰衣草精油，可起到缓慢长时间释放的效果，而且提高了精油的贮藏稳定性。

3、本发明开发的一种抑菌或保鲜油相固定吸附石（陶瓷或石膏），使用方法简单，且仅需要滴加微升级精油的用量，即达到快速抑菌效果，大大降低了成本。

4、本发明使用的用于蓝莓货架期贮藏的抑菌或保鲜盒，置物格可将蓝莓分开放置，避免真菌在果实间传染，引起大规模发病，另外，置物格之间设有风道，空气在盒内形成内循环，从而使精油能均匀地作用于每一个果实。

5、本发明将抑菌或保鲜微胶囊分点到在抑菌或保鲜盒每个置物格内，通过精油缓慢熏蒸的方式，能有效保持蓝莓采后品质，控制腐烂率，对蓝莓中长期贮藏有一定指导意义。

6、本发明将抑菌或保鲜油相固定吸附石（陶瓷或石膏）固定于盒体的内壁上，有效降低腐烂率，对蓝莓货架期病害的防控提供了理论依据。

附图说明

图1所示为3种病原菌菌丝形态特征（PDA培养基）；

图2所示为3种病原菌分生孢子形态特征；

图3所示为人工接种病原菌发病症状；

图4所示为基于 ITS 区序列和邻接法构建的系统发育树；

图5-1、5-2、5-3所示为不同浓度肉桂精油对3种病原菌的体外熏蒸抑制效果，其中5-1尖孢镰刀菌；5-2链格孢；5-3灰葡萄孢；接种菌斑直径为0.7cm；

图6所示为肉桂精油对3种病原菌菌丝微观形态的影响，6-1尖孢镰刀菌；6-2链格孢；6-3灰葡萄孢；a为未用精油处理的菌丝，b为肉桂精油处理过的菌丝；

图7所示为抑菌保鲜盒侧视图；

图8所示为抑菌保鲜盒俯视图；

图9所示为分层置物架底面图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细描述：

一、肉桂精油在抑制尖孢镰刀菌、链格孢菌、灰葡萄孢菌生长上的应用。

（一）蓝莓采后病原真菌的鉴定

蓝莓采摘后，挑选成熟度相同（8~9成熟）且健康无病的果实，室温放置，待发病后分离病原菌进行后续试验。

1、病原菌的采集与分离纯化

采用常规组织分离法，对发病果实上的病原菌进行分离，并经单孢分离获得纯培养菌株。

2、病原菌形态鉴定

将纯化菌株接种于PDA培养基，26℃恒温箱培养，待产孢后观察菌落形态，利用光学显微镜记录孢子形态和结构，并测量孢子大小。

3、病原菌致病性鉴定

选择健康无伤的蓝莓果实，将果实表面消毒后，采用针刺法将菌饼接种于果实被刺伤部位。以接种无菌的PDA培养基块作为对照，在25℃恒温箱中培养7~10天后观察发病情况。每种病原菌处理3个重复，每个重复10个果实。记录发病率及病害症状。

4、病原菌 rDNA-ITS 序列与系统进化树鉴定

利用CTAB法提取菌株DNA，选用真菌通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对病原菌进行PCR 扩增。扩增程序： 94℃ 变性 5 min；94℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸10 min。

PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，由铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序，测序结果在GenBank 数据库中进行 BLAST 比对分析，搜索同源性较高的已知序列，用DNAMAN 软件对已知序列计算相似性；利用MEGA 5.1 软件以 NJ（Neighbor-Joining）法构建系统发育树。

（二）肉桂精油对3种病原菌体外抑菌效果

选择61mL（直径75mm）的培养皿，取一片直径为30mm，厚度30mm的石膏石固定在皿盖中央，与培养皿一同灭菌后使用。倒入PDA培养基后，用无菌打孔器取直径7mm的病原菌菌饼接入，分别取一定量的肉桂精油均匀滴加于石膏石中央孔隙，使其含量为15，30，60，90 μL/L，不加精油的为对照组。于26℃培养5~7d，每天测量菌落直径。以抑制率100%的最低精油浓度为其最低抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration, MIC）。每个处理4个重复。

抑制率公式：（对照菌直径-处理菌直径）/对照菌直径×100%

（三）扫描电镜观察肉桂精油对3种病原菌菌丝形态变化的影响

取肉桂精油（25 μL/L）处理和对照菌丝，用2.5%戊二醛溶液固定24h，然后依次放入到浓度为50%，75%，100%的乙醇各脱水20 min，完成样品的脱水。采用临界点干燥法进行样品的干燥，喷金处理。在扫描电镜下观察样品并进行拍照。

（四） 结果分析

1、病原菌形态鉴定结果

L1形态特征（图1-1，2-1）：在PDA培养基上，菌丝白色绒状，后颜色变为浅灰色，不产色素。小型分生孢子数量多，卵圆形或椭圆形，大小为（5.2~10.6）μm×（2.5~4.4）μm。大型分生孢子月牙形、镰刀型，稍弯，顶部稍尖，多为3个隔膜，大小为（11.4~40.2）μm×（2.7~5.5）μm。

L2形态特征（图1-2，2-2）：在PDA培养基上，菌落初为灰色绒状，后颜色变为黑色，有同心圈。菌丝透明，有分隔，分生孢子褐色，单生或2~5个孢子形成短包子链。分生孢子顶端微曲，大小（11.1~33.8）μm×（5.4~9.5）μm，倒棒锤形或卵圆形，有纵横分隔，纵隔1~3个，横隔1~7个，分隔处缢缩，具有圆锥状或圆柱状短喙，喙长4.2~9.1μm。

L3形态特征（图1-3，2-3）：在PDA培养基上，菌丝初为白色绒状，后颜色变为浅褐色，形成黑色菌核。分生孢子梗数根丛生，直立或稍弯曲，具隔膜，顶端呈1~2次分枝，分枝的末端膨大，上密生小梗，小梗上聚生大量分生孢子。分生孢子卵圆形、椭圆形，无色至淡褐色，单孢，（8.3~11.3）μm×（6.3~10.1）μm。

2、病原菌的致病性

测定结果表明，经针刺接种的蓝莓果实均能发病，3~5天症状显现，7天后均发病严重，与原发病状较一致，重新分离后，其培养性状与原菌株相同，而对照处理均不发病（图3）

3、病原菌 rDNA-ITS 序列与系统发育鉴定

利用真菌通用引物ITS1/ITS4对3个纯化菌株rDNA-ITS进行PCR扩增， 获得3个扩增条带。将测序获得的序列与NCBI上已知菌株进行Blast比较，发现所测3个菌株和已知菌株均有较高的相似性。

将所测序列在GenBank数据库中进行同源比对，并将3种病原菌的序列及其相似序列用MEGA 5.2软件的邻接法（neighbor-joining method，NJ）构建系统发育树，以明确病原菌分类地位。

从图4看出，该3个菌株聚为3大类，各位于一个分支，其中A、B菌株所属类群的自举支持率为100%，G的自举值为99%。

菌株L1与中国（寄主不详）的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）（KU512835.1）、中国（寄主不详）的藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）（HM165488.1）、日本土壤中的冬虫夏草菌（Cordyceps sinensis）（AB187268.1）、以色列（寄主不详）的泽米黑孢壳（Melanospora zamiae）（KY628679.1）、西班牙（寄主不详）的肉座菌属（Hypocreales sp.）（EU600392.1）、葡萄牙葡萄寄生菌木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）（MF072591.1）聚为一类，结合孢子的形态特征，将菌株L1鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。

菌株L2与分离自中国猕猴桃（KX609761.1、KX609766.1、KX609763.1、KX609765.1、KX609764.1），中国无患子（KY213958.1）及印度分离自印度人参（KX494864.1）的链格孢菌（Alternaria alternata）聚为一类，结合孢子形态特征，鉴定菌株L2为链格孢菌（Alternaria alternata）。

菌株L3与分离自中国番茄灰霉病的富氏葡萄孢盘菌（Botryotinia fuckeliana）（JX875915.1）、意大利（寄主不详）灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）（KT587323.1）聚在同一枝，结合孢子形态特征，将菌株L3鉴定为灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）。其中富氏葡萄孢盘菌为有性世代，灰葡萄孢菌为无性世代。

4、肉桂精油对3种病原真菌体外抑菌效果

从图5-1、5-2、5-3可以看出，肉桂精油对尖孢镰刀菌、链格孢、灰葡萄孢的48h最低抑菌浓度（MIC）分别为60、30、30 μL/L。熏蒸72h后，当肉桂精油在60 μL/L和90 μL/L时，与CK组相比，对于三种病原菌抑菌率均在98%以上。熏蒸96h后，除尖孢镰刀菌抑菌率为80%外，对其他两种病原菌的抑制均在98%以上。

5、肉桂精油对3种病原菌菌丝形态变化的影响

对3个病原菌样品经临界点干燥后，进行扫描电镜观察，结果如图6。可以看出，未用精油处理的3种菌丝体均生长健康正常，表面光滑饱满，粗细均匀一致（图6-1a，6-2a，6-3a）。经肉桂精油（25μL/L）处理的尖孢镰刀菌出现强烈变形，皱缩凹陷明显（图6-1b）。经肉桂精油（25μL/L）处理的链格孢菌表面粗糙，有凸起。经肉桂精油（25μL/L）处理的灰葡萄孢菌丝皱缩，不平整，且菌丝之间出现严重黏连现象。

二、肉桂精油在控制蓝莓采后病害，延长贮藏期上的的应用。具体通过四、五实现。

三、一种抑菌保鲜胶囊

所述胶囊以β-环糊精和明胶（质量比3:1）为壁材，以肉桂精油、柠檬草精油、薰衣草精油（体积比10:3:1）的复配精油为芯材，壁芯质量比为5:1，通过饱和水溶液法制备。

具体制备方法为：采用加热溶解的方法制备饱和β-环糊精和明胶（质量比3:1）混合溶液，待冷却后以壁芯质量比5:1滴加复配精油，充分搅拌均匀，25℃振荡3h，置于5℃保存24h，抽滤后真空冷冻干燥成粉末状微胶囊。包埋产率为（95.08±0.7）%，包埋率为（89.31±0.5）%，挥发率可达25.39%。所述胶囊的应用方法是将胶囊和需要抑菌或保鲜的物质放置在一个密闭空间内。

四、抑菌保鲜油相固定吸附石应用

一种抑菌保鲜油相固定吸附石，将肉桂精油均匀滴加于油相固定吸附石的孔隙上，所述吸附石为陶瓷或石膏。

所述抑菌或保鲜固定吸附石的应用方法是将抑菌保鲜固定吸附石固定于真菌培养皿或抑菌保鲜盒上使用。

所述抑菌保鲜盒包含有盒体1其上密封的盒盖2，盒体1内部设置有若干分层置物架3，所述分层置物架3上表面设置有若干内陷的置物格4，所述分层置物架3下表面、置物格之间设置有通道5，所述抑菌保鲜固定吸附石固定于盒体的内壁上。

具体操作方法：

所述抑菌保鲜盒为食品级专用PP材质，体积为7L，共分4层，每层21（3*7）个置物格（7cm*4cm*3cm）。挑选8成熟、无机械损伤的健康蓝莓果实，每个置物格放置5个蓝莓，420个为一组。处理组将含肉桂精油（35μL/mL）的直径为30mm，厚度30mm的石膏石固定于保鲜盒四周内层，对照组不作处理，温度28℃、湿度（90±5）%条件下贮藏10天，对照组腐烂率为21.35%，处理组为3.12%。

五、抑菌保鲜微胶囊应用

一种抑菌保鲜微胶囊，所述胶囊以β-环糊精和明胶（质量比3:1）为壁材，以肉桂精油、柠檬草精油、薰衣草精油（体积比10:3:1）为芯材，壁芯质量为5:1，通过饱和水溶液法制备。

所述抑菌保鲜微胶囊的应用方法是将抑菌保鲜微胶囊，分点于抑菌保鲜盒上使用。

所述抑菌保鲜盒包含有盒体1其上密封的盒盖2，盒体1内部设置有若干分层置物架3，所述分层置物架3上表面设置有若干内陷的置物格4，所述分层置物架3下表面、置物格之间设置有通道5。

具体操作方法：

所述抑菌保鲜盒为食品级专用PP材质，体积为7L，共分4层，每层21（3*7）个置物格（7cm*4cm*3cm）。挑选8成熟、无机械损伤的健康蓝莓果实，每个置物格放置5个蓝莓，420个为一组。处理组将含肉桂精油（30μL/mL）的微胶囊粉末分点于每个置物格，对照组不作处理，温度7℃、湿度（85±5）%条件下贮藏58天，对照组腐烂率为5.78%，处理组为1.05%。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.肉桂精油在控制蓝莓采后病害，延长贮藏期上的应用方法，用于抑制分离自蓝莓的尖孢镰刀菌生长，其特征在于：所述肉桂精油应用形式是抑菌保鲜微胶囊，所述抑菌保鲜微胶囊以β-环糊精和明胶为壁材，以肉桂精油、柠檬草精油、薰衣草精油的复合物为芯材，壁芯质量比为5:1，通过饱和水溶液法制备；所述β-环糊精和明胶的质量比为3:1，所述肉桂精油、柠檬草精油、薰衣草精油体积比为10:3:1；应用时将微胶囊和需要抑菌保鲜的物质放置在一个密闭空间内；所述密闭空间为抑菌保鲜盒，所述抑菌保鲜盒包含有盒体及其上密封的盒盖，盒体内部设置有若干分层置物架，所述分层置物架上表面设置有若干內陷的置物格，所述分层置物架下表面、置物格之间设置有通道，所述抑菌保鲜微胶囊分点到每个置物格内。