CN111440731B - 一种枸杞内生轮状镰刀菌菌株及其应用 - Google Patents

一种枸杞内生轮状镰刀菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

一种枸杞内生真菌菌株及其应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种枸杞内生轮状镰刀菌（Fusarium nematophilum）菌株NQ8GII4，保藏编号为CGMCCNo.19271，该内生真菌的培养滤液能显著抑制致腐病原菌的生长，具有很好的抑菌活性，菌株可使病原菌菌丝出现畸形、崩解及孢子干瘪现象，对致腐病原菌有明显的拮抗作用，具有拮抗广谱性特点，菌株产生的挥发物质能显著抑制病原菌菌丝生长。本发明还提供了一种含有枸杞内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4培养滤液成分的生物保鲜剂的制备和使用方法，使用该菌株培养滤液制成的生物保鲜剂，能显著降低果品保存期间腐烂速率，延长果品食品货架时间，在果品采后保鲜方面具有广阔的应用前景。

Description

一种枸杞内生轮状镰刀菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种植物内生真菌及其应用，特别涉及一种枸杞内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4及其应用。
背景技术
植物内生真菌是指其生活史的某一阶段或整个阶段生活在宿主植物组织中，但不会对宿主植物产生明显病害症状的一类真菌。植物内生真菌可长期与宿主植物协同进化，促进植物的生长，提高植物抗逆性，其作为潜在的生防因子，还可通过与病原菌争夺营养物质和空间达到防治病害的目的。近年来，利用内生真菌作为一种生物保鲜剂来防治果品采后病害的研究已取得重大的进展，如芦竹内生木霉菌Trichoderma sp.F0238发酵液对黄瓜灰霉病菌Botrytis cinereal和柑桔青霉病菌Penicillium italicum的抑制率达70％以上；疏花水柏枝内生真菌草酸青霉Penicillium oxalicum发酵液粗提物能较好地抑制柑橘果实中橘青霉Penicillium citrinum的生长,有效阻止柑橘果实的腐烂；冷杉内生真菌凤阳麝香霉Muscodor fengyangensis挥发物质2-甲基丙酸和2-甲基-丙酸甲酯可以有效抑制贮藏期草莓灰霉病和油桃褐腐病的发病率。
目前，果品采后保鲜多以低温贮藏和化学杀菌剂为主。但低温贮藏成本较高，能耗高，温度调控不当易引起果实发生冷害，果品质量不稳定；化学杀菌剂保鲜因存在果品污染、农药残留超标、健康威胁及增加病原菌的抗药性等问题也备受消费者抵制。拮抗菌作为一种安全、有效、环境友好、极具潜力的果品保鲜剂逐渐成为研究热点。因而探寻和发现抑菌效果更广谱、更有效的新型天然拮抗菌株，应用于果品保鲜领域具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种枸杞内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4及其应用。
为实现上述目的，本发明提供的枸杞内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4是从健康枸杞根内分离获得，并从中筛出具有广谱拮抗作用的菌株NQ8GII4，于4℃保存于PDA培养基上。本发明提供的枸杞内生轮状镰刀菌(Fusarium nematophilum)菌株NQ8GII4已于2020年01月13日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.19271,保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所邮编：100101，电话：86-10-64807355。
本发明通过以下技术方案实现：
一种枸杞内生轮状镰刀菌(Fusarium nematophilum)菌株NQ8GII4，保藏编号为CGMCCNo.19271。
进一步的，所述内生轮状镰刀菌菌株的培养滤液能显著抑制致腐病原菌的生长，具有很好的抑菌活性。
进一步的，所述内生轮状镰刀菌菌株可使病原菌菌丝出现畸形、崩解及孢子干瘪现象，对致腐病原菌有明显的拮抗作用，具有拮抗广谱性特点。
进一步的，所述内生轮状镰刀菌菌株产生的挥发物质能显著抑制病原菌菌丝生长。
进一步的，所述内生轮状镰刀菌菌株可用于制备一种用于果品保鲜的生物保鲜剂。
进一步的，所述内生轮状镰刀菌菌株产生的挥发物质主要包括：1-辛烯-3-醇，2,3-丁二醇，乙醇，苯乙酮，3-辛酮，1,3-辛二烯和3-羟基-2-丁酮。
一种含有枸杞内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4培养滤液成分的新鲜果品生物保鲜剂。
进一步的，所述含有培养滤液成分生物保鲜剂的制备和使用过程包括以下步骤：
(1)将预先培养5d的内生轮状镰刀菌NQ8GII4，按照体积比1：750-1500比例加入到PDB液体培养基中，25℃ 175r/min培养7d，得到发酵液，根据实际需要可进一步按比例放大培养，制备更多发酵液；
(2)用抽滤泵滤掉发酵液菌丝和孢子；
(3)经0.22μm的微孔滤膜3次过滤除菌，得无菌培养滤液；
(4)将上述无菌培养滤液制成培养液浓度为10％-30％的稀释液，得到利用该枸杞内生轮状镰刀菌培养滤液制成的生物保鲜剂；
(5)将经过初步清洁的待保鲜果品晾至表面无明显水分；
(6)将果品在步骤(4)制备的生物保鲜剂溶液中浸泡1-2分钟，或者用喷雾装置将生物保鲜剂溶液均匀喷洒在果品表面；
(7)将浸泡或喷洒有生物保鲜剂的果品自然沥水、晾干；
(8)装入保鲜袋中，置于15℃以下环境中保藏。
进一步的，所述生物保鲜剂，可用于各种果品的保鲜防腐。
进一步的，所述生物保鲜剂，能显著降低果品贮藏期间腐烂速率，延长果品食品货架期。
研究发现，当培养滤液浓度过大时，反而会增加长枣腐烂率，可能是由于高浓度的培养滤液中某些组分对果品植物细胞有破坏作用，而选用10～30％浓度范围时保鲜效果较好，可延长灵武长枣货架期，说明植物内生真菌培养滤液的施用浓度与果品保鲜效果有很大关系。目前，植物内生真菌果品保鲜尚处于起步阶段，菌株NQ8GII4作为一株极有前景的果品保鲜剂出发菌，进行制剂的研发尚需对其具体的抑菌机理、发酵液浓度、孢子量、田间防效等展开研究，使其成为一种新型的果品保鲜剂应用于实际生产中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种枸杞内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4，内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4可使病原菌菌丝出现畸形、崩解及孢子干瘪现象，对致腐病原菌有明显的拮抗作用；
(2)本发明提供的枸杞内生轮状镰刀菌培养滤液能显著抑制致腐病原菌的生长，具有很好的抑菌活性；
(3)本发明提供的枸杞内生轮状镰刀菌产生的挥发物质能显著抑制病原菌菌丝生长；
(4)本发明提供的利用枸杞内生轮状镰刀菌培养滤液成分制备的生物保鲜剂，能显著降低果品贮藏期间腐烂速率，延长果品保鲜期；
(5)作为一种新筛选出的植物内生真菌，其抑菌保鲜组分及机理有待进一步深入研究，对未来开发更安全、有效、环境友好的生物保鲜剂有重要意义。
附图说明
图1内生轮状镰刀菌NQ8GII4对致腐病原菌菌丝生长的抑制作用；
图2内生轮状镰刀菌NQ8GII4对致腐病原菌拮抗作用的显微观察；
图3内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对致腐病原菌的抑制作用；
图4内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对致腐病原菌孢子萌发的抑制作用；
图5内生轮状镰刀菌NQ8GII4挥发物质对致腐病原菌菌丝生长的抑制作用；
图6内生轮状镰刀菌NQ8GII4对不同病原菌的抑菌作用。
具体实施方式
以下具体实施例用于对本专利的技术方案作进一步说明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
供试植物内生真菌和化学杀菌剂：枸杞内生轮状镰刀菌F.nematophilumNQ8GII4，从健康枸杞根内分离保存；植物源药剂蛇床子素和大黄素甲醚、微生物源药剂木霉购于内蒙古清源保生物科技有限公司；化学药剂多菌灵、腐霉利和戊唑醇购于江苏三山农药有限公司。供试致腐病原菌：交链格孢Alternaria alternata、灰葡萄孢Botrytiscinereal、米根霉Rhizopus oryzae、出芽短梗霉Aureobasidium pullulans、球派伦霉Peyronellaea glomerata和胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides菌种，皆由采后腐烂的长枣、枸杞和葡萄上分离纯化，由宁夏大学农学院植物病理实验室保存。
供试果品：分别采摘宁夏灵武农场枣园无病虫害及机械损伤的长枣(红色面积占枣果总面积的1/2～2/3)采摘；采摘宁夏银川市金凤区森淼兰月谷酒庄葡萄园威代尔品种和西夏区新牛酒庄红地球品种；宁夏农科院枸杞研究所枸杞品种园无病虫害及机械损伤的枸杞果(果面全红，有硬度)用于保鲜试验。
主要试验仪器与试剂：
正置荧光显微镜(Olympus，日本)；梯度PCR仪(Bio-Rad T100，美国)；电泳仪(DYY-C6，北京)；凝胶成像系统(Azure c200，美国)；GC-MS仪(Clarus 600型，美国)；30m×0.25mm×0.05μm色谱柱(EliteWax ETR，美国)；50/30μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷萃取头(DVB/CAR/PDMS，美国)；自动进样器(SPME，美国)。内标物4-甲基-2-戊醇，NaCl(分析纯)。
实施例1
对峙培养：以交链格孢A.alternata、灰葡萄孢B.cinerea为灵武长枣靶标致腐真菌，通过皿内对峙培养，测定内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4对致腐真菌的抑制作用。在距PDA平板中心2.5cm的一端接种一个直径6mm的内生轮状镰刀菌NQ8GII4菌饼，另一端接种一个直径6mm的致腐病原菌菌饼，封口膜密封置于25℃霉菌培养箱中培养。同时接种内生轮状镰刀菌和致腐病原菌、接种内生轮状镰刀菌4d后再接致腐病原菌和接种致腐病原菌4d后再接种内生真菌，每组处理重复4次，设只接致腐病原菌菌饼的平板为对照，待对照菌丝满皿后，测量对照半径(Rc)和致腐病原菌菌落朝内生轮状镰刀菌方向扩展的半径(Rp)，计算抑制率。
抑菌率(％)＝[(Rc-Rp)/(Rc-3)]×100
比较3种接种方式可以看出(表1)，优先4d接种内生轮状镰刀菌NQ8GII4对交链格孢A.alternata和灰葡萄孢B.cinerea抑菌效果普遍偏高，抑制率分别为71.25％和68.75％；其次为同时接种内生真菌和致腐病原菌，抑制率均在50％以上；接种致腐病原菌4d后再接种内生真菌的抑菌效果较差，抑菌率均在30％以下。由图1可以看出，内生轮状镰刀菌NQ8GII4与致腐病原菌之间产生了明显的抑菌带，病原菌菌丝边缘变厚(图1C)，生长受到抑制不能向外正常扩展(图1B和G)。内生轮状镰刀菌NQ8GII4菌株对致腐病原菌有明显的拮抗作用。
表1内生轮状镰刀菌NQ8GI I4对致腐病原菌菌丝生长的抑制作用
Figure BDA0002473817820000051
实施例2
拮抗作用的的显微观察：
采用盖玻片对峙培养法。在距PDA平板中心1.5cm端分别接种直径6mm的内生轮状镰刀菌NQ8GII4和致腐病原菌菌饼，两菌饼间放置浸有PDA培养基的灭菌盖玻片，待内生真菌和致腐病原菌菌丝接触1～3d后取出盖玻片，在光学显微镜(400倍)下观察并拍照。
图2为显微观察下内生轮状镰刀菌NQ8GII4菌丝与交链格孢和灰葡萄孢菌丝相互作用的结果。正常生长在PDA培养基上的交链格孢和灰葡萄孢菌丝长势旺盛，粗细均匀，产孢量较多，孢子大小均匀(图2A和E)。在对峙试验中，内生轮状镰刀菌NQ8GII4对致腐病原菌产生了明显的拮抗作用。主要表现为内生轮状镰刀菌菌丝体通过与致腐病原菌菌丝平行生长(图2F)，产生分支吸附在致腐病原菌菌丝体上进行侵入、穿插(图2C和G)，还可见致腐病原菌出现菌丝错综复杂、膨大肿胀、畸形、崩解及孢子干瘪(图2B、H和D)等现象。
实施例3
内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对致腐病原菌抑菌活性测定：
内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液的制备：将预先培养5d的内生轮状镰刀菌NQ8GII4打取6个直径为6mm的菌饼，放入装有150mLPDB培养基的三角瓶中，25℃ 175r/min培养7d，得到发酵液(2.3×107CFU/mL)。先用抽滤泵滤掉发酵液菌丝和孢子，再经0.22μm的微孔滤膜过滤3次，除菌，获得培养滤液，4℃保存备用。
内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对致腐病原菌菌丝生长的抑制作用：将轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液与冷却至50℃左右的灭菌PDA培养基混匀，分别制成培养滤液浓度为10％、15％、20％、25％、30％和40％的PDA平板，凝固后，在平板中央放置1个6mm致腐病原菌菌饼。不含轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液的处理为对照，每组处理重复3次，密封置于25℃霉菌培养箱中培养，待对照致腐病原菌满皿后，测量致腐病原菌的半径，计算抑制率。
收集内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液，测定不同浓度培养滤液对致腐病原菌丝生长的抑制效果。结果表明，轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对致腐病原菌菌丝生长表现出一定的抑制活性，但不同浓度的培养滤液对病原菌间的抑制作用间存在很大差异。随着培养滤液浓度增加，抑制率上升，在培养滤液含量为40％时，对交链格孢和灰葡萄孢的抑制率分别为71.25％和62％(表2)。观察平板上病原菌菌丝生长情况，发现与对照相比病原菌菌丝分布不均，明显变薄，菌丝呈溶解状(图3)。可见内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液中含有某种抑菌活性物质能显著抑制致腐病原菌的生长。
表2内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对致腐病原菌的抑制作用
Figure BDA0002473817820000071
实施例4
内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对致腐病原菌孢子萌发的抑制作用：
(1)靶标致腐病原菌孢子悬浮液的制备：取已培养5d的致腐病原菌平板，加入5mL无菌水，用灭菌的牙签轻轻将表面的孢子刮下使其融入无菌水中，经无菌滤纸过滤残渣后配制成浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液。
(2)致腐病原菌孢子抑菌率测定：将内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液分别配制成10％、20％、40％、60％、80％和100％的浓度(V:V)备用。将不同浓度的轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液与致腐病原菌孢子悬浮液按1:1(V:V)混配，设无菌水与致腐病原菌孢子悬浮液混合为对照，每组处理重复3次，25℃黑暗培养12h，每个重复在光学显微镜(400倍)下观察5个视野。每个视野下随机观察20个孢子，检查孢子萌发率，统计孢子抑制率。
抑制率(％)＝[(对照分生孢子萌发率-处理分生孢子萌发率)/对照分生孢子萌发率]×100
内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对交链格孢和灰葡萄孢分生孢子萌发均有抑制作用，且不同浓度的培养滤液对分生孢子萌发的抑制效果差异显著，培养滤液浓度与孢子抑制率间成正比关系(图4A和B)。培养滤液浓度为50％时，对交链格孢和灰葡萄孢孢子萌发的抑菌率分别为92.86％和88.70％。其次，培养滤液浓度为40％，对交链格孢和灰葡萄孢孢子萌发的抑制率均已达到80％以上，可见内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4培养滤液中含有较高的抗生物质，具有很好的抑菌活性。
实施例5
内生轮状镰刀菌NQ8GII4挥发物质抑菌活性测定：
采用平板对扣法测定内生轮状镰刀菌NQ8GII4挥发性物质对致腐病原菌菌丝生长的抑制作用。将培养5d内生轮状镰刀菌NQ8GII4菌株，打1个6mm的菌饼，接种在PDA培养基上，25℃黑暗培养。分别在培养0、2、4、6、8和10d后，与刚接种6mm致腐病原菌菌饼的PDA平板对扣密封。放置时使接种内生真菌的培养皿在下，致腐病原菌在上。设琼脂块为对照，每组处理重复3次，25℃霉菌培养箱黑暗培养，待对照致腐病原菌长满皿后，测量各处理的致腐病原菌菌落半径，计算抑制率。
抑制率(％)＝[(对照菌落半径-处理菌落半径)/(对照菌落半径-3)]×100
由表3可知，内生轮状镰刀菌NQ8GII4挥发物质能显著抑制交链格孢和灰葡萄孢菌丝的生长。优先接种4d和6d的内生真菌NQ8GII4对交链格孢的抑菌效果最好，抑制率为90.30％和94.34％；内生轮状镰刀菌NQ8GII4接种8d和10d后再接种灰葡萄孢，抑制率为92.72％和95.95％；内生轮状镰刀菌NQ8GII4接种4d再接种球派伦霉的抑菌率为90.00％。由图5可以看出接种内生真菌后病原菌菌丝生长势明显减弱，菌丝变薄，说明内生轮状镰刀菌NQ8GII4产生的挥发物质对致腐病原菌菌丝生长影响显著。
表3内生轮状镰刀菌NQ8GII4挥发性物质对致腐病原菌的抑制作用
Figure BDA0002473817820000081
实施例6
内生轮状镰刀菌NQ8GII4挥发物质测定：
(1)样品的制备：将预先培养5d的内生轮状镰刀菌NQ8GII4取6个直径6mm的菌饼，放入装有150mL PDB培养液的三角瓶中，25℃ 175r/min培养7d，用两层纱布过滤菌体得粗提液。设不加菌饼的PDB培养液为空白对照，每个样品设3次重复。
(2)顶空固相微萃取法提取内生轮状镰刀菌NQ8GII4挥发物质：将萃取头在250℃条件下老化10min。取5.0mL粗提液于顶空瓶中，加入1.5g NaCl及10.0μL内标物4-甲基-2-戊醇(2.02mg/L)，45℃保温5min后将萃取头插入顶空瓶，45℃萃取35min。以5mL PDB培养液的顶空挥发物萃取物为对照。萃取完成后，直接将萃取头插入气相色谱进样口进行测定。
(3)GC/MS测定条件：利用Clarus 600型GC-MC仪对内生轮状镰刀菌NQ8GII4挥发成分进行测定。GC条件：进样温度250℃，氦气载气，色谱柱流速1mL/min，分流比5:1。程序升温：初温40℃，保留5min，然后以3℃/min升温至97℃，保持7min，再以2℃/min升至120℃，以3℃/min升至150℃，以8℃/min升至250℃，保持10min。MS条件：EI离子源，接口温度250℃，离子源温度220℃，电子能量70EV，扫描范围30～550amu。
(4)定性：挥发物质成分利用MS全离子扫描模式下的总离子流图谱，依据色谱保留时间和质谱信息、NIST标准谱库比对结果以及参考相关文献相结合的方法进行定性分析。
(5)定量：采用内标法进行定量分析，若挥发物质没有相应的标样，则利用化学结构相似、碳原子数接近的原则进行定量。各挥发物质成分含量(mg/L)＝各组分的峰面积×内标物浓度/内标物峰面积
内生轮状镰刀菌NQ8GII4挥发物质GC-MS的分析结果：
由表4可知，经质谱数据库检索比对，将挥发物质物质各组分通过内标法定量分析计算相对百分含量。在内生轮状镰刀菌NQ8GII4粗提液中主要检测出醇类、酮类、芳香烃类、酯类和烯类5类挥发性物质，共计20种化合物组分(表4)。其中以醇类化合物1-辛烯-3-醇和2,3-丁二醇的相对含量最高，分别为281.18％和271.25％，乙醇次之，为44.54％；酮类物质中苯乙酮、3-羟基-2-丁酮和3-辛酮含量相对较高，分别为98.67％、52.60％和42.24％；烯类物质中1,3-辛二烯含量可达48.95％；芳香烃类和酯类物质相对含量较少。
表4内生轮状镰刀菌NQ8GII4挥发性物质GC-MS分析结果
Figure BDA0002473817820000101
实施例7
内生轮状镰刀菌NQ8GII4的广谱抑菌活性测定：
除去灵武长枣的优势致腐病原菌交链格孢A.alternata和灰葡萄孢B.cinerea，分别以灵武长枣其他靶标致腐病原菌米根霉R.oryzae、出芽短梗霉A.pullulans、球派伦霉P.glomerata及枸杞胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides为指示菌，采用皿内培养测定内生轮状镰刀菌NQ8GII4的拮抗广谱性。操作方法同实施例1。
由表5可知，内生轮状镰刀菌NQ8GII4对几种病原菌都表现出较好的拮抗作用，其中对出芽短梗霉抑菌效果最好，抑菌率高达87.91％，对球派伦霉和枸杞胶孢炭疽菌的抑菌率分别为75.42％和65.87％。由图5可看出，内生轮状镰刀菌NQ8GII4和病原菌间出现明显的抑菌带，病原菌菌丝体生长受阻，不能正常向外扩展(图5E、H和G)，后期出现老化萎缩现象(图5G和H)。根霉菌生长势减弱，菌丝变薄稀疏(图5F)。
表5内生轮状镰刀菌NQ8GII4对不同病原菌的抑菌作用
Figure BDA0002473817820000111
实施例8
内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4培养滤液制备同实例3，再将无菌培养滤液制成培养液浓度为10％、20％、30％、40％和50％的稀释液(v/v)，得到利用该内生真菌发酵液制成的生物保鲜剂进行灵武长枣保鲜。
将挑选好的无病斑的长枣用清水轻微冲洗2次，沥水晾干。分别用无菌水(阴性对照)、50％多菌灵500倍液和0.5％大黄素甲醚80倍液(阳性对照)、内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液10％、20％、30％、40％和50％浓度(v/v)浸果1min，自然晾干，装入20μm厚度保鲜袋中，预先在保鲜袋两侧均匀扎10个针孔(失去气调作用)，每袋12颗果，每组处理重复4次，共计32袋，置于15℃冷藏柜中贮藏，每隔5d观察腐烂情况并统计腐烂率。采用张淑萍等鲜枣贮藏期腐烂标准，果面出现明显可见的病斑(直径大于0.3cm)视为烂果，此类果占统计果实总数的百分比计为腐烂率，以20％腐烂率判定灵武长枣失去商品价值。
由表6离体保鲜试验结果可知，阴性对照最早出现腐烂，贮藏10d时，腐烂率为18.75％，此时多菌灵和10％、20％、30％轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液处理的长枣没有出现腐烂现象。贮藏30d时，阴性对照已全部腐烂，与阴性对照相比，20％轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液处理的长枣腐烂率降低近78％，货架期延长15～20d，其保鲜效果与化学药剂多菌灵的保鲜效果相当，优于植物源药剂大黄素甲醚，贮藏时间长达30d。说明在15℃贮藏条件下，20％轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对灵武长枣具有显著的保鲜效果。
表6内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对长枣采后保鲜效果
Figure BDA0002473817820000121
实施例9
内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4培养滤液制备同实例3，以内生轮状镰刀菌滤液原液制成生物保鲜剂进行离体葡萄果粒保鲜。
将成熟的新鲜葡萄果粒沿果柄处剪下，自来水洗净葡萄果粒表面灰尘，沥水晾干。分别将无菌水(阴性对照)、1％蛇床子素55倍液和50％腐霉利1000倍液(阳性对照)、内生轮状镰刀菌菌株NQ8GⅡ4培养滤液原液喷施于离体葡萄果粒表面，自然晾干，装入保鲜袋中，每袋20颗葡萄果粒，每组处理重复4次，共计16袋。置于25℃条件下贮藏2d，取出，用灭菌牙签刺伤果粒，产生微伤，灭菌滤纸吸干溢出果汁，伤口处接种直径3mm的葡萄灰霉菌饼，继续培养3d后取下接种体，测量病斑面积，按严重度分级标准统计发病情况，计算病情指数。
严重度分级为5级。0级：无病斑；1级：病果(病斑)面积占整个果穗(果粒)面积的5％以下；3级：病果(病斑)面积占整个果穗(果粒)面积6％～15％；5级：病果(病斑)面积占整个果穗(果粒)面积16％～25％；7级：病果(病斑)面积占整个果穗(果粒)面积26％～50％；9级：病果(病斑)面积占整个果穗(果粒)面积50％以上。
病情指数＝∑[(各级病株数×相应级数值)/(调查总株数×最高级数值)]×100；
抑制率(％)＝[(空白对照病情指数-处理组病情指数)/空白对照病情指数]×100。
由表7可知，在25℃条件下内生轮状镰刀菌NQ8GⅡ4培养滤液对成熟期离体葡萄果粒灰霉病具有较好的防治效果。无菌水处理的2种葡萄果粒腐烂现象严重，与之相比，经内生轮状镰刀菌NQ8GⅡ4培养滤液处理的威代尔葡萄和红地球葡萄，病情指数仅为9.18％和13.45％，抑制率为78.09％和73.8％，明显优于植物源药剂蛇床子素的抑制率，仅次于化学药剂腐霉利的抑制率。可见轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对离体葡萄果粒具有显著的保鲜效果，可作为果品生物保鲜剂的出发菌种。
表7内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对离体葡萄果粒保鲜效果
Figure BDA0002473817820000131
实施例10
内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4培养滤液制备同实例3，再将无菌培养滤液制成培养液浓度为10％的稀释液，得到利用该内生轮状镰刀菌发酵液制成的生物保鲜剂进行枸杞果保鲜。
将离体枸杞果用清水冲洗，沥水晾干，将无菌水(阴性对照)、10％的内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液、10％(m/v)木霉和10％(v/v)戊唑醇(阳性对照)分别喷雾接种于枸杞果面，晾干，装入保鲜盒中，40颗/盒，每组4盒，共计16盒，于25℃RH70％冷藏柜中贮藏24h，于当天和第3d用1.0×106CFU/mL胶孢炭疽菌孢子悬浮液进行喷雾接种，待接种轮状镰刀菌培养滤液后第7d后观察枸杞果发病情况，按严重度分级标准计算病情指数。
严重度分级为5级。0级：无病斑；Ⅰ级：0<病斑面积占果(叶)总面积≤25％；Ⅱ级：25％<病斑面积占果(叶)总面积≤50％；Ⅲ级：50％≤病斑面积占果(叶)总面积≤75％；Ⅳ级：病斑面积占果(叶)总面积>75％。
由表8对离体枸杞果保鲜效果结果可知，预先3d接种10％浓度轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对枸杞果的保鲜效果最好，能显著降低枸杞炭疽病的发病率及病情指数，抑制率为92.54，其抑制率与化学农药戊唑醇(94.41％)的防效相当；其次为同时接菌，抑制率为84.95％，优于生物农药木霉(64.64％)的抑制率。可见，10％浓度轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对离体枸杞果有较好的保鲜效果。
表8内生轮状镰刀菌NQ8GII4培养滤液对枸杞果的保鲜效果
Figure BDA0002473817820000141
实施例11
一种利用内生轮状镰刀菌NQ8GII4发酵液成分制备生物保鲜剂的制备方法：将预先培养5d的内生轮状镰刀菌NQ8GII4，按照体积比1：1500比例加入到PDB液体培养基中，25℃ 175r/min培养7d，得到发酵液，也可根据实际需要进一步按比例放大培养，制备更多发酵液；再用抽滤泵滤掉发酵液菌丝和孢子，然后将滤过液用0.22μm的微孔滤膜3次过滤除菌，得无菌培养滤液；再将无菌培养滤液制成培养液浓度为20％的稀释液，得到利用该枸杞内生真菌发酵液制成的生物保鲜剂；
使用方法：将待保鲜新鲜果品用清水冲洗，沥水晾干，至表面无明显水分；再用喷雾装置将生物保鲜剂溶液均匀喷洒在果品表面；将喷洒有生物保鲜剂的果品自然晾干，装入保鲜袋中，置于15℃以下环境中保藏。
实施例12
一种利用内生轮状镰刀菌NQ8GII4发酵液成分制备生物保鲜剂的制备方法：将预先培养5d的内生轮状镰刀菌NQ8GII4，按照体积比1：1000比例加入到PDB液体培养基中，25℃ 175r/min培养7d，得到发酵液，也可根据实际需要进一步按比例放大培养，制备更多发酵液；再用抽滤泵滤掉发酵液菌丝和孢子，然后将滤过液用0.22μm的微孔滤膜3次过滤除菌，得无菌培养滤液；再将无菌培养滤液制成培养液浓度为30％的稀释液，得到利用该枸杞内生真菌发酵液制成的生物保鲜剂；
使用方法：将待保鲜新鲜果品用清水冲洗，沥水晾干，至表面无明显水分；再将其放入生物保鲜剂溶液中浸泡2分钟，将浸泡有生物保鲜剂的果品沥水晾干，装入保鲜袋中，置于15℃以下环境中保藏。
本文中应用了具体实施例对本发明的实际效果和实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，对于本技术领域的普通技术人员来说，再不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进、润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种枸杞内生轮状镰刀菌(Fusarium nematophilum)菌株NQ8GII4，保藏编号为CGMCCNo.19271。
2.根据权利要求1所述的一种枸杞内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4，其特征在于，所述内生轮状镰刀菌菌株的培养滤液能显著抑制致腐病原菌的生长，具有很好的抑菌活性。
3.根据权利要求1所述的一种枸杞内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4，其特征在于，所述内生轮状镰刀菌菌株可使病原菌菌丝出现畸形、崩解及孢子干瘪现象，对致腐病原菌有明显的拮抗作用，具有拮抗广谱性特点。
4.根据权利要求1所述的一种枸杞内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4，其特征在于，所述内生轮状镰刀菌菌株产生的挥发物质能显著抑制病原菌菌丝生长。
5.根据权利要求1所述的一种枸杞内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4，其特征在于，所述内生轮状镰刀菌菌株可用于制备一种用于果品保鲜的生物保鲜剂。
6.根据权利要求4所述的一种枸杞内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4，其特征在于，所述挥发物质主要包括：1-辛烯-3-醇，2,3-丁二醇，乙醇，苯乙酮，3-辛酮，1,3-辛二烯和3-羟基-2-丁酮。
7.一种生物保鲜剂，其特征在于，所述生物保鲜剂组分中含有权利要求1所述枸杞内生轮状镰刀菌菌株NQ8GII4的培养滤液成分。
8.根据权利要求7所述的一种生物保鲜剂，其特征在于，所述生物保鲜剂的制备和使用过程包括以下步骤：
(1)将预先培养5d的内生轮状镰刀菌NQ8GII4，按照体积比1：750-1500比例加入到PDB液体培养基中，25℃ 175r/min培养7d，得到发酵液，根据实际需要可进一步按比例放大培养，制备更多发酵液；
(2)用抽滤泵滤掉发酵液菌丝和孢子；
(3)经0.22μm的微孔滤膜3次过滤除菌，得无菌培养滤液；
(4)将上述无菌培养滤液制成培养液浓度为10％-50％的稀释液，得到利用该枸杞内生轮状镰刀菌培养滤液制成的生物保鲜剂；
(5)将经过初步清洁的待保鲜果品晾至表面无明显水分；
(6)将果品在步骤(4)制备的生物保鲜剂溶液中浸泡1-2分钟，或者用喷雾装置将生物保鲜剂溶液均匀喷洒在果品表面；
(7)将浸泡或喷洒有生物保鲜剂的果品自然沥水、晾干；
(8)装入保鲜袋中，置于15℃以下环境中保藏。
9.根据权利要求7所述的一种生物保鲜剂，其特征在于，所述生物保鲜剂，可用于各种果品的保鲜防腐。
10.根据权利要求7所述的一种生物保鲜剂，其特征在于，所述生物保鲜剂，能显著降低果品贮藏期间腐烂速率，延长果品食品货架期。
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