CN106032523A - 一种分离纯化苹果轮纹病菌的简易方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离纯化苹果轮纹病菌的简易方法，涉及植物病原菌的分离与纯化技术。从采集的轮纹病枝上，切取新鲜的轮纹病斑或病键交界处的寄主组织，在灭菌的马铃薯葡萄糖培养液中侵泡5~20分钟后，直接接种30~80日龄苹果幼果的人制伤口，在20~30℃环境下保湿培养5~7天；待接种果实发病并形成0.2~1cm宽的环状病斑后，转入黑光灯或紫外灯下培养5~10天，诱导病斑产生分生孢子；将孢子涂布到2%琼脂平板上，在显微镜下挑取单个的分生孢子，转入PDA培养基中培养，可获得苹果轮纹病菌的单孢分离菌株。本发明以克服了常规方法分离纯化方法工作量大、诱导产孢困难、分离频率低等问题，为轮纹病的研究提供了一套简便、快捷、准确、可靠的病原菌分离纯化技术。

Description

一种分离纯化苹果轮纹病菌的简易方法

技术领域

本发明属于植物病原菌的分离与纯化研究领域，涉及病原真菌的分离、纯化、诱导产孢与培养技术。

背景技术

苹果轮纹病是苹果上的重要病害，主要为害枝干和果实，在环渤海湾和黄河故道苹果产区危害尤为严重，已成为苹果树上的第一大病害。

病菌侵染枝干形成病瘤、粗皮和干腐病斑，严重影响树势，当树体受到干旱胁迫或衰弱时，轮纹病菌在枝干内迅速扩展，形成干腐病斑，最终导致树体或枝干死亡；2008年，对全国7个苹果主产省，88个果园枝干轮纹病调查表明，苹果枝干轮纹病的总体发病率达77.6%。

轮纹病菌侵染果实，导致果实轮纹病，严重影响果实的产量和品质；在未套袋果实上，因轮纹病导致的烂果每年都在5%~30%之间，重病园高达80%以上。

苹果轮纹病是由子囊菌亚门葡萄座腔菌属Botryosphaeria spp.的真菌侵染引起的一种真菌病害；分离纯化病原菌是开展病原菌生物学、群体遗传、病害发生流行规律、筛选防治药剂等项研究的前提和基础，这些研究都需要纯化的轮纹病菌。

分离与纯化苹果轮纹病的常规方法需要病菌分离、诱导产孢、单孢分离和致病性验证4个步骤；病菌分离是从果园内采集枝条或果实上的病斑，切取病健交界处的寄主组织，用70%的酒精和次氯酸钠消毒后，转入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上分离培养，获得病菌；诱导产孢是在分离获得病原菌后，通过黑光照谢处理，诱导PDA上培养的病菌产生分生孢子；单孢分离是当诱导病菌产生孢子后，挑取单个的孢子转入PDA培养基中，获得单孢分离菌株；致病性验证则是将获得单孢分离菌株回接到苹果果实或枝条上，能使接种果实和枝条发病的分离菌株才是致病的轮纹病，才能用于下一步的试验研究。

苹果轮纹病菌常规分离纯化方法的缺点是：工作量大，步骤繁琐，而且从寄主组织内分离到的杂菌多，获得目标菌株的概率低，利用纯培养的菌株诱导产孢困难，获得单孢分离菌株的概率低。

发明内容

针对常规方法的缺点和不足，本发明的目的在于提供一套简便、快捷、准确、可靠的分离纯化技术，以解决苹果轮纹病菌分离纯化工作量大、诱导产孢困难、分离频率低等问题。

本发明采用的技术原理如下：轮纹病菌能够从伤口侵染幼龄的苹果果实，并诱发褐色病斑；不能诱发幼果发病的真菌，不是轮纹病菌，或不是致病的轮纹病，从而对病菌的致病性进行筛选；果实发病并形成较大的病斑后，对发病果实进行黑光或紫外光照谢处理，诱导病菌产生分生孢子；苹果幼果上的轮纹病斑在短波光的照谢下很容易产生分生孢子；挑取病斑上的单个分生孢子培养，可获得纯化且具有致病的轮纹病菌；通过单孢分离，实现对病菌的分离与纯化。

本发明采用的技术方案如下：切取轮纹病的病组织直接接种苹果幼龄果实，诱发果实产生轮纹病斑，果实发病后，将病果放在短波光下照谢，诱导病菌产生分生孢子；当病菌产孢后，挑取单个的分生孢子，转入PAD中培养，获得纯化菌株。

具体实施方案如下：

（1）样品采集：从目标果园内采集带有轮纹病斑的枝条和果实，用小刀切取病斑或病健交界处的寄主组织，修成不超过5毫米见方的组织块；接种时无需要进行消毒处理；

（2）幼果准备：从果园内摘取30~80日龄苹果的幼果，其中50~60日富士品种果实诱导产孢效果最好；苹果幼果可以放在3℃~5℃的冷藏箱内长期保存；接种时，取保存的幼果，用70%的酒精擦试果实表面消毒；取直径5毫米的消毒打孔器，或者消毒小刀，沿幼果腰部均匀挖孔，人为制造2~4个伤口，伤口直径和深度都不能超过5毫米，伤口间的距离不小于2厘米；

（3）接种与培养：取轮纹病的病组织在灭菌的马铃薯葡萄糖培养液中浸泡5~20分钟，用消毒摄子将病组织直接塞入幼果的伤口中，每孔一块病组织，让病组织尽可能多地接触果肉；将接种幼果放入铺有湿润滤纸的保湿缸或保湿盒内，转入20℃~25℃的环境中保湿培养5~7天；待大部分接种伤口发病，并形成0.2~1cm宽的环状病斑后，取出果实，诱导产孢；

（4）诱导产孢：将发病的果实放在10W~60W，波长约为365nm黑光灯，或波长为256nm紫外灯下培养5~10天，病斑上产生黑色球状的分生孢子器，并溢出灰白色的线状分生孢子角；病果离灯的距离不超过20厘米，环境温度控制在20℃~30℃之间，相对湿度控制在60%-90%之间；

（5）分离单孢：称取2克琼脂粉，加入98毫升蒸馏水，经121℃灭菌20min；在超净工作台上，用移液枪取5毫升融化的水琼脂，均匀的涂布到灭菌的载玻片上，制成平板，平板厚度为0.5~1毫米；取玻璃毛细管，在酒精灯上从中间灼烧后拉细，冷却后折断；用烧制后的玻璃毛细管挑取分生孢子角，涂布到水琼脂上，滴加1~2滴无菌水，将孢子涂开；在100倍显微境下，找单个的分生孢子，用烧制的毛细管挑出，转入PDA培养基上；自每块病组织产生的分生孢子中，挑取3~4个分生孢子，置入同一个培养皿中，在25℃下培养3-4天，选取生长良好，性状典型的菌落，即为纯化后的苹果轮纹病菌。

本发病的优点在于：方法简便，分离纯化病菌的效率高，获得的菌株可靠，不需要再作致病性验证。

应用实例，用于抗药检测轮纹病菌菌株的分离与纯化：

（1）样品准备：2014年8月份，自山东沂源的果园内，采集的带有3个以上轮纹病瘤或马鞍状病斑的枝段20个，每个枝段长约5厘米，以枝段为单位分离轮纹病菌；病菌分离时，用小刀从每个枝段上切取3个轮纹病瘤或马鞍状病斑，修成约0.5厘米见方的组织块，在灭菌的马铃薯葡萄糖液体培养基中浸泡5~10分钟；

（2）幼果接种：取6月采集，且在5℃冷藏箱中保存的苹果幼果20个，用70%的乙醇擦拭表面消毒后，用直径0.5厘米打孔器，沿果实腰部均匀打3个深度3~5毫米的孔，把在灭菌马铃薯葡萄糖液体培养基中浸泡的组织块直接塞入孔内，每个枝条上的病组织接种于同一个果实上，共接种20个果实；

（3）诱导产孢：把接种幼果放入保湿缸内，在保湿缸内加入蒸馏水，将缸内相对湿度控制在100%，然后转入25℃的恒温箱中培养， 5天后共有18个果实发病，每个果实至少有1个典型的轮纹病斑；把发病的果实转入30W的黑光灯下诱导产孢，病果离黑光灯5厘米左右，相对湿度控制在60%~90%之间，温度控制在20~30℃之间，培养5天后，发病果实陆续产孢，并溢出孢子角；病斑的产孢率在90%以上；

（4）单孢分离：挑取病斑上的分生孢子角，涂布在2%水琼脂上，显微镜下用毛细管挑取单个孢子转入PDA平板培养基中，从每个病果上挑取3~6个分生孢子，转入2个培养皿中，25℃培养3~5天后，选取典型菌落，即为纯化的单孢菌株；

（5）结果：从20个枝条接种的20个幼果中，共分离获得18个纯化的单孢菌株。

Claims (2)

1.一种分离纯化苹果轮纹病菌的简易方法；其特征在于：在苹果幼龄果实的伤口内直接接种轮纹病的病组织，保湿培养，待果实发病并形成病斑后，诱导病斑产生分生孢子，挑取单个的分生孢子培养，获得轮纹病菌的单孢菌株；

所述苹果幼龄果实为从果园内摘取的30~80日龄的苹果幼果，其中用50~60日龄的富士品种幼果诱导产孢效果最好；苹果幼果可以放在3℃~5℃的冷藏箱内长期保存；

所述伤口是对苹果幼果进行表面消毒后，用打孔器或小刀，在果实表面均匀挖孔，人为制造伤口，伤口直径和深度不要超过5毫米，间距不小于2厘米；

所述轮纹病的病组织是从果园内采集带有轮纹病斑的枝条和果实，用小刀切取病斑，或病健交界处的寄主组织，病组织大小不超过5毫米；

所述接种是将轮纹病的病组织在灭菌的马铃薯葡萄糖培养液中浸泡5~20分钟后，直接塞入幼果的伤口中，每个伤口一块病组织；

所述保湿培养是把接种幼果放入保湿缸或保湿盒内，转入20℃~25℃的环境中保湿培养5~7天，诱导接种果实发病；

所述诱导病菌产生分生孢子是当发病幼果形成0.2~1cm宽的环状病斑后，将病果放在10W~60W，波长约为365nm黑光灯，或波长约为256nm紫外灯下培养5~10天；病果离灯的距离不超过20厘米，环境温度控制在20℃~30℃之间，相对湿度控制在60%~90%之间，诱导病斑上的轮纹病菌产生分生孢子；其中黑光灯诱导果实产孢的效果更好；

所述挑取单个的分生孢子培养是用玻璃毛细管挑取分生孢子角，涂布到2%水琼脂平板上，在100倍显微境下，找单个的分生孢子，用烧制的毛细管或挑针挑出，转入马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上培养。

2. 权利要求1所述的一种分离纯化苹果轮纹病菌的简易方法，其特征是：在苹果幼果的伤口内直接接种轮纹病的病组织，待果实发病后，在黑光灯或紫外灯诱导病菌产孢，然后挑取单个分生孢子培养，顺序操作。