CN110894475A - 一种利用寄主基质分离沉香树皮腐病病原菌的方法 - Google Patents

一种利用寄主基质分离沉香树皮腐病病原菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用寄主基质分离沉香树皮腐病病原菌的方法，该方法包括以下步骤：(1)从沉香的种植地采集发病样本；(2)沉香树寄主基质的预处理：将沉香树枝条切段、浸泡过滤水分；(3)分装试管，将切段枝条装入试管，置于高压蒸汽灭菌锅灭菌备用；(4)沉香树茎部病原真菌的分离，剪取病样组织病健交界处的组织块，置于试管中于恒温培养箱培养；(5)马铃薯葡萄糖琼脂培养基上纯化，挑取生长末端的菌丝块移入培养基上培养得纯培养物；(6)致病性测定；(7)病菌形态观察；本方法使用寄主基质为培养基，能阻止细菌的漫延，使生长速度较快的病原菌菌丝可以超越生长速度较慢的微生物，有效地与混杂的微生物分离开来，从而获得纯的菌株。

Description

一种利用寄主基质分离沉香树皮腐病病原菌的方法
技术领域
本发明涉及一种利用寄主基质分离沉香树皮腐病病原菌的方法，属植物保护领域。
背景技术
沉香树Aquilaria sinensis(Lour.)Spreng，学名土沉香，又名白木香等，属瑞香科沉香树属多年生乔木，为国家二级濒危保护植物。其产品沉香是一种传统的名贵药材和天然香料，经济价值高，市场需求量大。近年来，随着沉香树经济价值的提高，沉香树种植面积逐渐扩大，随之而来的沉香树病害也逐渐增多。
沉香树皮腐病的致病菌是长在沉香树的外皮层上，而外皮层长期暴露在空气中，除了病原菌，还混杂着许多非致病微生物。采用常规的组织分离的方法进行表面消毒处理极易引起生长于外皮层上的病原菌活性丧失，难以将病原菌分离出来。
目前关于沉香腐病病原菌的相关报道还很少，将其分离出来的更是少之又少，所以为了更好的研究沉香腐病的相关情况，研究并分离出沉香腐病病原菌具有重要的意义。
基于沉香树树皮腐病的致病菌适合在沉香树寄主基质上生长，并且生长速度比其他混杂微生物的生长速度快的原理，研究开发利用沉香树基质制备培养料(而非常规的马铃薯葡萄糖琼脂培养基)，分离沉香树皮腐病病原真菌，从而获得纯的菌株，是一种新型的、有效的分离致病菌的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种利用寄主基质分离沉香树皮腐病病原菌的方法，该方法使用寄主基质为培养基，能阻止细菌的漫延，使生长速度较快的病原菌菌丝可以超越生长速度较慢的微生物，有效地与混杂的微生物分离开来，从而获得纯的菌株。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种利用寄主基质分离沉香树皮腐病病原菌的方法，包括以下步骤：
(1)发病样本采集
从沉香树种植地采集沉香树发病样品，备用；
(2)沉香树寄主基质的预处理
取干枯、无霉变的沉香树枝条1kg，切段1～2cm长，置于水中浸泡12h，用纱布过滤水分，双手拧干备用；
(3)分装试管
将沥干水分的切段枝条装入试管中，料量低于试管口2～3cm，最后压平料面；清洁试管口内壁和试管外壁，试管口塞上棉花，然后用报纸封口；将装有培养料的试管置于高压蒸汽灭菌锅121℃，压力110pa下灭菌2h备用；
(4)沉香树茎部病原真菌的分离
在超净工作台上，用灭菌的剪刀或刀片，剪取沉香树病样组织病健交界处2mm×2mm的组织块，将其置于培养料试管内，立即塞上棉花，用报纸封口处理；置于28℃恒温培养箱中培养3～7d，观察菌丝生长状况；
(5)马铃薯葡萄糖琼脂培养基上纯化
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)的制备，称取去皮新鲜马铃薯200g，切成1cm左右的小方块放入锅中，加入1000mL自来水，置电池炉上煮20分钟后，用双层纱布过滤；把葡萄糖、琼脂粉加到滤液中，加热搅拌至琼脂粉完全融化，然后用水定容到1000mL；趁热分装到锥形瓶(每瓶约200mL)中，用胶塞塞紧，报纸包好，在121℃，压力110pa下进行高压蒸汽灭菌30min，备用；
选取长有与发病样本病症菌丝相近的试管，从中间截断，挑取生长未端的菌丝块(带菌的1小段枝条)移入PDA培养基上培养2～3d，便获得纯培养物；
(6)致病性测定
接种用的菌饼：将上述在PDA培养基上生长的纯培养物，用无菌打孔器打出直径5mm菌饼，备用；同时将PDA培养基也打同样大小的琼脂饼做对照用；
本方法利用菌饼法进行伤口接种，选取健康的沉香树枝条用75％的酒精进行表面消毒，用灭菌的刀在枝条表皮上划一刀，在伤口处附上菌饼，而对照组则附上琼脂饼；各5个重复；将处理好的枝条用盒子保湿，观察期为7天；
7天后，可观察到枝接种处表皮出现浅褐色病斑，并长满白色菌丝，症状与发病样本一致，重新分离白色菌丝，显微镜检查其形态与接种的纯培养物一致，而对照组的有伤口处理处均无症状表现；
(7)病菌形态观察
上述纯培养物在PDA上生长迅速(3天即长满培养皿)，菌落最初为白色，有丰富的气生菌丝(与发病样本病症一致)，菌丝随后变为浅黄色，并产生大量带有孢子的孢子囊，孢子囊圆形，光滑，直立，不分枝；孢囊孢子呈椭圆形，褐色或淡褐色，孢子壁上有条状直纹，大小约为长9～24μm×宽8～13μm；形态学特征与瓜笄霉choanephora cucurbitarum一致，因此鉴定该致病菌为瓜笄霉。
本发明的有益效果是：
本方法使用寄主基质为培养基，能阻止细菌的漫延，使生长速度较快的病原菌菌丝可以超越生长速度较慢的微生物，有效地与混杂的微生物分离开来，从而获得纯的菌株。
附图说明
图1沉香树皮腐病症状；
图2沉香树基质的预处理(切段及浸泡)；
图3分装试管；
图4发病组织块接入培养基；
图5组织块病原菌丝向基质中漫延生长；
图6病原菌丝未端接于PDA培养基中纯化；
图7纯化菌株的致病性测定；(A为对照组；B为接种实验组)；
图8病原菌在PDA培养基上不同时期的菌落特征，a:为第1天；b:为第2天；c:为第3天；
图9病原菌孢子和孢子囊形态特征。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
一种利用寄主基质分离沉香树皮腐病病原菌的方法，包括以下步骤：
(1)发病样本采集
从沉香树种植地采集沉香树发病样品，备用；
(2)沉香树寄主基质的预处理
取干枯、无霉变的沉香树枝条1kg，切段1～2cm长，置于水中浸泡12h，用纱布过滤水分，双手拧干备用；
(3)分装试管
将沥干水分的切段枝条装入试管中，料量低于试管口2～3cm，最后压平料面；清洁试管口内壁和试管外壁，试管口塞上棉花，然后用报纸封口；将装有培养料的试管置于高压蒸汽灭菌锅121℃，压力110pa下灭菌2h备用；
(4)沉香树茎部病原真菌的分离
在超净工作台上，用灭菌的剪刀或刀片，剪取沉香树病样组织病健交界处2mm×2mm的组织块，将其置于培养料试管内，立即塞上棉花，用报纸封口处理；置于28℃恒温培养箱中培养3～7d，观察菌丝生长状况；
(5)马铃薯葡萄糖琼脂培养基上纯化
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)的制备，称取去皮新鲜马铃薯200g，切成1cm左右的小方块放入锅中，加入1000mL自来水，置电池炉上煮20分钟后，用双层纱布过滤；把葡萄糖、琼脂粉加到滤液中，加热搅拌至琼脂粉完全融化，然后用水定容到1000mL；趁热分装到锥形瓶(每瓶约200mL)中，用胶塞塞紧，报纸包好，在121℃，压力110pa下进行高压蒸汽灭菌30min，备用；
选取长有与发病样本病症菌丝相近的试管，从中间截断，挑取生长未端的菌丝块(带菌的1小段枝条)移入PDA培养基上培养2～3d，便获得纯培养物；
(6)致病性测定
接种用的菌饼：将上述在PDA培养基上生长的纯培养物，用无菌打孔器打出直径5mm菌饼，备用；同时将PDA培养基也打同样大小的琼脂饼做对照用；
本方法利用菌饼法进行伤口接种，选取健康的沉香树枝条用75％的酒精进行表面消毒，用灭菌的刀在枝条表皮上划一刀，在伤口处附上菌饼，而对照组则附上琼脂饼；各5个重复；将处理好的枝条用盒子保湿，观察期为7天；
7天后，可观察到枝接种处表皮出现浅褐色病斑，并长满白色菌丝，症状与发病样本一致，重新分离白色菌丝，显微镜检查其形态与接种的纯培养物一致，而对照组的有伤口处理处均无症状表现；
(7)病菌形态观察
上述纯培养物在PDA上生长迅速(3天即长满培养皿)，菌落最初为白色，有丰富的气生菌丝(与发病样本病症一致)，菌丝随后变为浅黄色，并产生大量带有孢子的孢子囊，孢子囊圆形，光滑，直立，不分枝；孢囊孢子呈椭圆形，褐色或淡褐色，孢子壁上有条状直纹，大小约为长9～24μm×宽8～13μm；形态学特征与瓜笄霉choanephora cucurbitarum一致，因此鉴定该致病菌为瓜笄霉。

Claims (4)

1.一种利用寄主基质分离沉香树皮腐病病原菌的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)发病样本采集
从沉香树种植地采集沉香树发病样品，备用；
(2)沉香树寄主基质的预处理
取干枯、无霉变的沉香树枝条，切段1～2cm长，置于水中浸泡12h，用纱布过滤水分，双手拧干备用；
(3)分装试管
将沥干水分的切段枝条装入试管中，料量低于试管口2～3cm，最后压平料面，清洁试管口内壁和试管外壁，试管口塞上棉花，然后用报纸封口；将装有培养料的试管置于高压蒸汽灭菌锅灭菌备用；
(4)沉香树茎部病原真菌的分离
在超净工作台上，用灭菌的剪刀或刀片，剪取沉香树病样组织病健交界处2mm×2mm的组织块，将其置于培养料试管内，立即塞上棉花，用报纸封口处理；置于恒温培养箱培养，观察菌丝生长状况；
(5)马铃薯葡萄糖琼脂培养基上纯化
选取长有与发病样本病症菌丝相近的试管，从中间截断，挑取生长末端的菌丝块移入PDA培养基上培养2～3d，便获得纯培养物；
(6)致病性测定
接种用的菌饼：将上述在PDA培养基上生长的纯培养物，用无菌打孔器打出直径5mm菌饼，备用；同时将PDA培养基也打同样大小的琼脂饼做对照用；
本方法利用菌饼法进行伤口接种；选取健康的沉香树枝条用75％的酒精进行表面消毒，用灭菌的刀在枝条表皮上划一刀，在伤口处附上菌饼，而对照组则附上琼脂饼；各5个重复；将处理好的枝条用盒子保湿，观察期为7天；
7天后，可观察到枝接种处表皮出现浅褐色病斑，并长满白色菌丝，症状与发病样本一致，重新分离白色菌丝，显微镜检查其形态与接种的纯培养物一致，而对照组的有伤口处理处均无症状表现；
(7)病菌形态观察
上述纯培养物在PDA上生长迅速，3天即长满培养皿，菌落最初为白色，有丰富的气生菌丝，与发病样本病症一致；菌丝随后变为浅黄色，并产生大量带有孢子的孢子囊，孢子囊圆形，光滑，直立，不分枝；孢囊孢子呈椭圆形，褐色或淡褐色，孢子壁上有条状直纹，大小为长9～24μm×宽8～13μm；形态学特征与瓜笄霉choanephora cucurbitarum一致，因此鉴定该致病菌为瓜笄霉。
2.根据权利要求1所述的一种利用寄主基质分离沉香树皮腐病病原菌的方法，其特征在于：步骤(3)所述的灭菌的温度为121℃，压力为110pa，灭菌时间为2小时。
3.根据权利要求1所述的一种利用寄主基质分离沉香树皮腐病病原菌的方法，其特征在于：步骤(4)所述的培养为28℃恒温培养箱中培养3～7d。
4.根据权利要求1所述的一种利用寄主基质分离沉香树皮腐病病原菌的方法，其特征在于：步骤(5)所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA的制备：称取去皮新鲜马铃薯200g，切成1cm的小方块放入锅中，加入1000mL自来水，置电磁炉上煮20分钟后，用双层纱布过滤；把葡萄糖、琼脂粉加到滤液中，加热搅拌至琼脂粉完全融化，然后用水定容到1000mL，趁热分装到锥形瓶中，每瓶200mL，用胶塞塞紧，报纸包好，在121℃，压力110pa下进行高压蒸汽灭菌30min，备用。
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