CN113930373A - 烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及农业生物技术领域，公开了烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的保存方法，包括烟草无菌苗获得和培养、烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的发酵培养、茄科雷尔氏菌接种和发病植株的保存以及茄科雷尔氏菌的再培养与纯化。本发明的制备和保存方法简便易行，在本发明的保存条件下可保存60‑120天，且在此期限内茄科雷尔氏菌的侵染效率和致病性与自然茄科雷尔氏菌相同，在需要时及时培养可获得高致病性的茄科雷尔氏菌培养物；本发明通过寄主活体培养和高温处理，保证了带菌植物的生长，同时也使得菌株的致病性性状稳定，目标菌纯度有保证。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法。
背景技术
烟草青枯病又称黏液病、烟瘟、半边疯，主要是由茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种细菌性病害，该病害普遍发生在我国长江流域及西南烟区，危害严重，常造成烟叶产量和品质降低甚至绝收。目前，在生产中主要采用化学农药防治茄科雷尔氏菌，但是该方法并不能有效地防止该病发生；茄科雷尔氏菌导致烟草发病后更不能实现有效治疗，且长期大量施用化学农药既容易使病菌产生抗药性，又容易造成环境污染。目前生物防治具有可预防、无污染和长效性等优点，在植物病害的防治中具有越来越重要的位置，而开展有效的生物防治需要研究病原菌的致病性和病原菌与拮抗菌的互作关系，这就需要稳定且大量的病原菌。专利号为CN102229897B题目为一种导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物制备和保存方法的专利主要是利用目标菌的寄主植物——烟草，其茎秆微管系统发达的特性，直接将具有烟草青枯病典型症状的病株茎秆进行保湿培养，从而获得高纯培养物。贵州农业科学刊登的名为烟草青枯病菌种保存方法及其对致病力的影响的文献为在烟草青枯病的防治和烟草抗病性鉴定研究中获得致病力较强的菌株，分别采用烟草组培苗活体保存、灭菌蒸馏水常温保存以及料面冰箱保存3种不同方法保存烟草青枯病菌，并比较了3种保存方法对烟草青枯病菌致病力的影响，结果表明：烟草组培苗活体保存法和灭菌蒸馏水常温保存法均具有较好的保持青枯病菌致病力活性的能力，前者比后者稍强，如需提取粗毒素，则建议使用后者,斜面冰箱保存法的致病力下降最快。
烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌在常规培养过程中，往往容易出现继代培养过程中病原菌致病性丧失问题，导致致病性实验和拮抗试验无法进行。因此为了防止茄科雷尔氏菌在人工培养基上连续传代出现致病力迅速下降或其它遗传性状改变的问题，避免现有茄科雷尔氏菌菌株保存培养方法的效果不确定的缺陷，急需发展一种经济有效的、并保持烟草青枯病致病菌固有特性的方法。
发明内容
基于以上问题，本发明提供烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，本发明的制备和保存方法简便易行，通过寄主活体培养和高温处理，保证了带菌植物的生长，同时也使得菌株的致病性性状稳定，目标菌纯度有保证。
为解决以上技术问题，本发明提供了烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，包括以下步骤：
S1：烟草无菌苗获得和培养
选用健康饱满的烟草种子，用酒精和次氯酸钠对烟草种子表面各消毒3min，并用无菌水清洗三遍，用无菌滤纸吸干烟草种子表面的无菌水后，将烟草种子置于灭菌的MS培养基上培养，培育温度为22-30℃，获得烟草无菌苗；
S2：烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的发酵培养
将纯化培养得到的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌接种于常规PDA培养基上活化培养18-36h，从常规PDA培养基上挑取一环单菌落接入NB液体培养基中，于30℃、180转/分钟条件下振荡培养24-72h，获得旺盛生长的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌培养物；
S3：茄科雷尔氏菌接种和发病植株的保存
选择4-8叶期的烟草无菌苗，采用针刺灌根法对步骤S1中获得的烟草无菌苗接种经步骤S2发酵培养获得的茄科雷尔氏菌发酵液，接种后培养烟草无菌苗，选择具备典型烟草青枯病发病症状的烟草植株，将该烟草植株置于35-41℃条件下充分光照培养4-5天，待烟草青枯病发病症状稳定或不再发展时，将该烟草植株转入22-28℃温度条件下，在组培瓶中继续培养并保存；相对高温处理降低发病程度和对植株的影响，22-28℃的培养条件可保持病原菌和植株均正常生长，在该条件下发病植株保存时间为60-120天，优选70-90天；
S4：茄科雷尔氏菌的再培养与纯化
在无菌条件下从步骤S3中保存的具有烟草青枯病发病症状的烟草植株中分离茄科雷尔氏菌，具体方法如下：切取步骤S3中保存的具有烟草青枯病发病症状的烟草植株茎段2-3cm，将茎段放入研钵中，加入无菌水，研磨出组织液，再用接种环蘸取组织液在PDA培养基上划线接种，然后将PDA培养基置于25-30℃恒温培养箱中培养12-48h，之后挑取一环单菌落菌株，利用平板划线法在新的 PDA或NA固体培养基中培养，传代培养三代，至菌落形态稳定即得。
进一步的，步骤S2中NB液体培养基的振荡培养时间为36-48h。
进一步的，步骤S3中的针刺灌根法的具体操作如下：用灭菌的细针从烟草底部第三叶的叶腋垂直刺入茎部，刺出伤口，在伤口处注入0.1-1ml步骤S2中的茄科雷尔氏菌发酵液，或直接用步骤S2中的茄科雷尔氏菌发酵液灌根；接种后置于22-30℃的光照培养箱中培养，每天观察烟草苗病情情况。
进一步的，接种后的培养温度为22-28℃。
进一步的，步骤S4中PDA培养基的培养时间为20-26h。
进一步的，步骤S3中发病植株的保存方法还可通过盆栽方法移栽发病植株来实现；但是，在开放式培养条件下培养的带病原菌植株，进行病原菌再分离时需要取病健交界部位表面除菌或进行组织分离，才能重新获得烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的制备和保存方法简便易行，在本发明的保存条件下可保存60-120天，且在此期限内茄科雷尔氏菌的侵染效率和致病性与自然茄科雷尔氏菌相同，在需要时及时培养可获得高致病性的茄科雷尔氏菌培养物；本发明通过寄主活体培养和高温处理，保证了带菌植物的生长，同时也使得菌株的致病性性状稳定，目标菌纯度有保证。
附图说明
图1为采用本发明所述的方法，在组培瓶中用烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌接种无菌烟草苗的过程，接种7天时，整株苗和局部，均显示了成功侵染；
图2为采用本发明所述的方法，从接种的烟草植株上再次分离茄科雷尔氏菌，平板划线法获得的菌落形态；
图3为采用本发明的方法获得的茄科雷尔氏菌侵染烟草苗，在保存40天时观察到的侵染效果，表明症状发展稳定；
图4为采用本发明的方法接种保存的茄科雷尔氏菌，将侵染植株进行大田栽培保存90天时烟草植株表现典型的青枯症状；
图5为本发明的实施例的流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例：
见附图5，本实施例利用烟草苗活体保存茄科雷尔氏菌致病菌株，避免茄科雷尔氏菌致病菌株的致病性丢失。具体方法如下：
S1：烟草无菌苗获得和培养
选用健康饱满的烟草种子，用酒精和次氯酸钠对烟草种子表面各消毒3min，并用无菌水清洗三遍，用无菌滤纸吸干烟草种子表面的无菌水后，将烟草种子置于灭菌的MS培养基上培养，培育温度为22-30℃，获得烟草无菌苗；
S2：烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的发酵培养
将纯化培养得到的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌接种于常规PDA培养基上活化培养18-36h，从常规PDA培养基上挑取一环单菌落接入NB液体培养基中，于30℃、180转/分钟条件下振荡培养24-72h，优选振荡培养时间为36-48h，获得旺盛生长的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌培养物；
S3：茄科雷尔氏菌接种和发病植株的保存
选择4-8叶期的烟草无菌苗，采用针刺灌根法对步骤S1中获得的烟草无菌苗接种经步骤S2发酵培养获得的茄科雷尔氏菌发酵液，接种后培养烟草无菌苗，选择具备典型烟草青枯病发病症状的烟草植株，将该烟草植株置于35-41℃条件下充分光照培养4-5天，待烟草青枯病发病症状稳定或不再发展时，将该烟草植株转入22-28℃温度条件下继续在组培瓶中培养并保存；相对高温处理降低发病程度和对植株的影响，22-28℃的培养条件可保持病原菌和植株均正常生长，在该条件下发病植株保存时间为60-120天，优选70-90天；
本实施例的针刺灌根法的具体操作如下：用灭菌的细针从烟草底部第三叶的叶腋垂直刺入茎部，刺出伤口，在伤口处注入0.1-1ml步骤S2中的茄科雷尔氏菌发酵液，或直接用步骤S2中的茄科雷尔氏菌发酵液灌根；接种后置于22-30℃的光照培养箱中培养，优选培养温度为22-28℃，每天观察烟草苗病情情况；
S4：茄科雷尔氏菌的再培养与纯化
在无菌条件下从步骤S3中保存的具有烟草青枯病发病症状的烟草植株中分离茄科雷尔氏菌，具体方法如下：切取步骤S3中保存的具有烟草青枯病发病症状的烟草植株茎段2-3cm，将茎段放入研钵中，加入无菌水，研磨出组织液，再用接种环蘸取组织液在PDA培养基上划线接种，然后将PDA培养基置于25-30℃恒温培养箱中培养12-48h，优选培养时间为20-26h，之后挑取一环单菌落菌株，利用平板划线法在新的PDA或NA固体培养基中培养，传代培养三代，至菌落形态稳定即得。
本实施例对上述步骤S3中发病植株的保存方法还可通过盆栽方法移栽发病植株来实现，只是在这种开放式培养条件下培养的带病原菌植株，在进行病原菌再分离时需要取病健交界部位并对表面除菌或进行组织分离，才能重新获得烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌。
本实施例对比了常规4℃保存的茄科雷尔氏菌株的致病性和通过本发明的活体保存的茄科雷尔氏菌株的致病性，首先对常规4℃保存的茄科雷尔氏菌株进行了如下处理：取4℃条件下保存的茄科雷尔氏菌种平板，从平板上挑取一环单菌落接种入NB液体培养基中，于30℃、180rpm条件下振荡培养48h；然后选择8叶期以上的烟草无菌苗，采用针刺灌根法接种，具体操作方法为：用细针从底部第三叶的叶腋垂直刺入茎部，刺出伤口，在伤口处注入100μl上述细菌发酵液，接种后置于30℃的光照培养箱中培养，每天观察烟草苗病情情况。该部分所选用的烟草为亚布力旱烟。
见附图1，为采用本发明所述的方法，在组培瓶中用烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌接种无菌烟草苗的过程，接种7天时的症状发展情况，整株苗和局部，均显示了成功侵染。
见附图2，为采用本发明所述的方法，从接种的烟草植株上再次分离茄科雷尔氏菌，平板划线法获得的菌落形态。
见附图3，采用本发明的方法获得的茄科雷尔氏菌侵染烟草苗，在保存40 天时观察到的侵染效果，表明症状发展稳定。
见附图4，采用本发明的方法接种保存的茄科雷尔氏菌，将侵染植株进行大田栽培保存，结果发现90天时烟草植株表现典型的青枯症状。
综上所述，本发明的方法可直接进行病菌致病实验，简便快速，且有效保持了菌株的固有特性；本发明的保存方式易于实施，操作简便，保存时间长，效果好。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：烟草无菌苗获得和培养
选用健康饱满的烟草种子，用酒精和次氯酸钠对烟草种子表面各消毒3min，并用无菌水清洗三遍，用无菌滤纸吸干烟草种子表面的无菌水后，将烟草种子置于灭菌的MS培养基上培养，培育温度为22-30℃，获得烟草无菌苗；
S2：烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的发酵培养
将纯化培养得到的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌接种于常规PDA培养基上活化培养18-36h，从常规PDA培养基上挑取一环单菌落接入NB液体培养基中，于30℃、180转/分钟条件下振荡培养24-72h，获得旺盛生长的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌培养物；
S3：茄科雷尔氏菌接种和发病植株的保存
选择4-8叶期的烟草无菌苗，采用针刺灌根法对步骤S1中获得的烟草无菌苗接种经步骤S2发酵培养获得的茄科雷尔氏菌发酵液，接种后培养烟草无菌苗，选择具备典型烟草青枯病发病症状的烟草植株，将该烟草植株置于35-41℃条件下充分光照培养4-5天，待烟草青枯病发病症状稳定或不再发展时，将该烟草植株转入22-28℃温度条件下继续在组培瓶中培养并保存；
S4：茄科雷尔氏菌的再培养与纯化
在无菌条件下从步骤S3中保存的具有烟草青枯病发病症状的烟草植株中分离茄科雷尔氏菌，具体方法如下：切取步骤S3中保存的具有烟草青枯病发病症状的烟草植株茎段2-3cm，将茎段放入研钵中，加入无菌水，研磨出组织液，再用接种环蘸取组织液在PDA培养基上划线接种，然后将PDA培养基置于25-30℃恒温培养箱中培养12-48h，之后挑取一环单菌落菌株，利用平板划线法在新的PDA或NA固体培养基中培养，传代培养三代，至菌落形态稳定即得。
2.根据权利要求1所述的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，其特征在于，步骤S2中NB液体培养基的振荡培养时间为36-48h。
3.根据权利要求1所述的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，其特征在于，步骤S3中的针刺灌根法的具体操作如下：用灭菌的细针从烟草底部第三叶的叶腋垂直刺入茎部，刺出伤口，在伤口处注入0.1-1ml步骤S2中的茄科雷尔氏菌发酵液，或直接用步骤S2中的茄科雷尔氏菌发酵液灌根；接种后置于22-30℃的光照培养箱中培养，每天观察烟草苗病情情况。
4.根据权利要求3所述的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，其特征在于，接种后的培养温度为22-28℃。
5.根据权利要求1所述的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，其特征在于，步骤S4中PDA培养基的培养时间为20-26h。
6.根据权利要求1所述的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，其特征在于，步骤S3中发病植株的保存方法还可通过盆栽方法移栽发病植株来实现；但是，在开放式培养条件下培养的带病原菌植株，进行病原菌再分离时需要取病健交界部位表面除菌或进行组织分离，才能重新获得烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌。
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| CN114181865A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-03-15 | 海南师范大学 | 一种对茄雷尔氏菌有高效拮抗作用的芽孢菌及其应用 |
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