CN103525708A - 落葵链格孢及其在苹果树腐烂病害防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提涉及微生物技术领域，本发明所述的落葵链格孢在2010年12月从河北省保定温仁采集于苹果树皮内，经分离、纯化、培养、发酵和活性鉴定等步骤获得，经鉴定为落葵链格孢（Alternaria basellae），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年9月10日，保藏编号为CGMCC No.8166。本发明所述的落葵链格孢的代谢活性物质对苹果树腐烂病病原菌具有较强抑制作用，可致腐烂菌菌丝畸形，原生质体外溢，田间保护及治疗作用均显示出该菌株的培养滤液对苹果树腐烂病菌具有良好的防治效果。

Description

落葵链格孢及其在苹果树腐烂病害防治中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及落葵链格孢及其在苹果树腐烂病害防治中的应用。

背景技术

由黑腐皮壳属Valsa ceratosperma引起的苹果树腐烂病，是苹果上一种分布广、危害重的病害。从我国首次发现苹果树腐烂病以来，国内已经有四次大的流行（曾士迈.宏观植物病理学.北京:中国农业出版社，2005）。2007年，国家苹果产业技术体系建立，为全国范围内苹果病虫害的调研和防控研究创造了条件，2008年的调查结果显示，全国苹果主产省苹果腐烂病的平均发病株率为52.7%，由此可见腐烂病的发生十分普遍且严重。（曹克强，国立耘，李保华，孙广宇，陈汉杰.中国苹果树腐烂病发生和防治情况调查.植物保护，2009，35(2):114-116）

链格孢Alternaria spp是一类极为常见的真菌，既是重要的植物病原菌（孙霞，张天宇.河北鸭梨病果上链格孢分离系的形态及分子特性研究.菌物学报，2008，27(1):105-117），同时又是非常有应用潜力的生防资源。近年来利用链格孢及其产生的次生代谢产物防治杂草的报道较多，但利用其抑制植物病害真菌的研究还较局限。链格孢可产生多种毒素，姜述君等研究发现狭卵链格孢菌A.augustiovoide菌株AAEC05-3能通过产生链格孢毒素细交链孢菌酮酸防除稗草（姜述君，范文艳，鞠世杰等.狭卵链格孢菌株AAEC05-3及其毒素对稗草的致病性.植物保护学报，2007，34(3):283-288）。

苹果腐烂病的防治一直以化学防治为主，但随着人们对环境条件以及果品质量要求的提高，化学防治将会受到越来越多的限制。目前，越来越多的研究人员利用安全、有效的生物防治措施防治苹果树腐烂病，王彩霞等研究了从土壤里分离出的细菌对苹果树腐烂病菌的抑制作用，发现菌株BJ1（微嗜酸寡氧单胞菌Stenotrophomonasacidaminiphila）对腐烂病菌有明显的拮抗效果，其发酵滤液能明显抑制腐烂病菌菌丝生长和孢子萌发（王彩霞，张清明，李桂舫，董向丽，李保华.苹果树腐烂病拮抗细菌菌株BJ1的鉴定及其抑菌作用.植物保护学报，2012，39(5):431-437）；高克祥等研究表明内生菌螺旋毛壳菌ND35培养滤液提取的粗酶液对腐烂病菌有抑制作用（高克祥，庞延东，秦乃花，刘晓光，康振生.内生菌螺旋毛壳抗生素和水解酶的协同抗真菌作用.植物病理学报，2006，36(4):347-358）；郜佐鹏等研究发现几种植物内生放线菌对苹果树腐烂病菌有抑制作用（郜佐鹏，柯希望，韦洁玲等.七株植物内生放线菌对苹果树腐烂病的防治作用.植物保护学报，2009，36(5):410-416）。因此，利用内生真菌产生的抗病原真菌的活性物质进行植物病原真菌病害的生物防治，具有周期短、便于生产和低毒等优点。所以，研究和开发对植物病害具有防治作用的优良的出发菌株一直是本领域技术人员不断追求的目标，探索防治苹果树腐烂病的生物制剂具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种从苹果树皮分离筛选出的内生真菌——落葵链格孢（Alternaria basellae）；本发明的另一目的是提供利用该菌株代谢产物防治苹果树腐烂病的方法。

为了实现本发明的目的，本发明首先提供一株落葵链格孢（Alternaria basellae）。

落葵链格孢（Alternaria basellae）的分离、筛选及鉴定：

本发明所述落葵链格孢在2010年12月从河北省保定温仁采集于苹果树皮内，经分离、纯化、培养、发酵和活性鉴定等步骤获得并保存：经鉴定为落葵链格孢（Alternaria basellae），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏日期为2013年9月10日，保藏编号为CGMCC No.8166。

落葵链格孢（Alternaria basellae），其固体培养特征为：菌落在PCA平板上培养，菌落圆形，等径生长，初为乳白色，3～4天后变为灰色，平展，絮状，疏松，中间稍隆起，背面灰色，形成，培养5天菌落直径达到5.52cm，分生孢子卵形、倒棒状，黄褐色，有0～3个横膈膜，0～2个纵斜隔膜，分隔处明显缢缩，主横膈膜增厚，19.05～30.80μm×7.86～8.00μm，无喙或柱状假喙，3.00～3.77μm×3.10～3.70μm，分生孢子形成不分枝的短链，每条链含有5～8个孢子，产孢表型从总体上看，分生孢子链较短，部分孢子之间的假喙较长。

本发明通过玻片对峙培养试验测定所述落葵链格孢（Alternariabasellae）对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制作用方式，同时利用离体枝条和田间试验测定其培养滤液对苹果树腐烂病的防治效果。

本发明还提供了所述落葵链格孢（Alternaria basellae）的代谢产物在防治苹果树腐烂病中的应用。

其中，所述落葵链格孢菌株的代谢产物为落葵链格孢培养滤液、菌饼或孢子悬浮液。

其制备方法如下：

培养滤液制备：用6mm打孔器打取已培养5天的苹果内生链格孢菌饼，放入装有100mL ME培养基的三角瓶中，每瓶放入3个菌饼，25℃、150r/min培养10天后用灭菌滤纸和0.22μm的微孔滤膜过滤，除去菌丝和孢子，-20℃保存备用。

菌饼制备：打取经单孢分离纯化后，于PDA培养基培养7-9天的链格孢菌落边缘旺盛生长的6mm的菌盘作为菌饼备用。

孢子悬浮液制备：将已产孢的链格孢菌丝块，经三层无菌纱布过滤，得到孢子悬浮液，并将孢悬液的浓度调整为1×10⁶～1×10⁷个分生孢子/mL。

作为优选，所述应用为在苹果树新鲜剪锯口和/或苹果树腐烂病病斑刮除后涂抹落葵链格孢培养滤液。

本发明的有益效果在于：

本发明从苹果树皮中分离筛选出代谢活性物质对苹果树腐烂病病原菌具有较强抑制作用的落葵链格孢，致使腐烂菌菌丝畸形，原生质体外溢，田间保护及治疗作用均显示出该菌株的培养滤液对苹果树腐烂病菌具有良好的防治效果，为农业上防治苹果树腐烂病提供了一种微生物菌株。

附图说明

图1为本发明所述落葵链格孢对苹果树腐烂病菌菌丝的影响；

其中：a-c为正常培养苹果树腐烂病菌4天后的菌丝形态，d-i为对峙培养4天后的菌丝形态，标尺为10μm。

图2为本发明所述落葵链格孢的形态特征图1；

其中：a为菌落，b为分生孢子，c为产孢表型。

图3为本发明实施例4中田间接种落葵链格孢培养滤液后腐烂病病斑的保护作用结果。

图4为本发明实施例4中田间接种落葵链格孢培养滤液后腐烂病病斑的治疗作用结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1落葵链格孢的分离与筛选

分离：将苹果树皮用自来水冲洗干净，剪成0.25cm²小块，置于75%酒精中浸泡30s，再用4%次氯酸钠表面消毒3.5min后，放入灭菌水中冲洗4次，每次至少1min，用灭菌滤纸吸干多余水分后，置于PDA培养基制成的平板中，25℃黑暗条件下培养一个月后，完成分离。

单孢纯化：挑取少量活化的菌丝接种到PCA平板上，采用两支40W日光灯中间加一支40W黑光灯，灯管彼此间距15cm的光照条件，在光照灯管下36～40cm处放置培养物，12h光照，12h黑暗，在25℃条件下，皿底向上培养一周左右至产生成熟的分生孢子。将产生分生孢子的PCA平板放在体视镜下观察，无菌操作下，挑单个孢子到PDA平板上，每平板3个，标记好置于生化培养箱内25℃黑暗培养，待长出菌落后，于PDA斜面4℃保存备用。落葵链格孢形态特征如图1所示。

筛选：将载玻片（75mm×25mm）放于直径为9cm的培养皿中，灭菌后，倒入已灭菌并融化的PDA培养基中，待其凝固后，将带有PDA培养基的载玻片取出，去掉载玻片底部的剩余培养基后，放入含有潮湿滤纸的灭菌培养皿中备用。将用PDA培养基25℃黑暗分别培养9天和6天直径为6mm的苹果内生落葵链格孢和V.ceratosperma菌饼，同时放置于覆有PDA培养基的载玻片两端，两菌饼相距4cm，每处理4次重复，以只接种落葵链格孢（A.basellae）和V.ceratosperma为对照。待落葵链格孢和V.ceratosperma两菌之间出现对峙区域时，分别测量两菌落朝对方菌落方向扩展的半径大小和形成的抑菌带的宽度，计算这两种菌的被抑制率和相对抑制率（如表1所示）。通过显微观察对峙区菌丝形态的变化，测量菌丝节间长度，计算腐烂菌菌丝节间的抑制率，每处理重复三次，每重复测量20条菌丝节间长度。

表1苹果内生落葵链格孢与苹果树腐烂病菌玻片对峙培养各菌落趋向半径、抑制率及抑菌带宽度

苹果内生落葵链格孢对腐烂病菌菌丝的抑制作用方式显微观察，发现正常生长在PDA培养基上的苹果树腐烂病菌菌丝细长、粗细均匀、表面光滑，顶端略细（图2-a、b、c），而与落葵链格孢对峙培养3-4天的腐烂菌菌丝从顶端数第一个节间缩短、菌丝不规则弯曲、分支增多、变粗、顶端钝圆，且部分菌丝原生质体外溢（图2-d、e、f、g、h、i）。与正常的腐烂菌菌丝相比，对峙培养的菌丝节间长度受到明显抑制，抑制率为85.66%。

实施例2落葵链格孢发酵代谢产物的制备方法

培养滤液制备：用6mm打孔器打取已培养5天的苹果内生落葵链格孢菌饼，放入装有100mL ME培养基的三角瓶中，每瓶放入3个菌饼，25℃、150r/min培养10天后用灭菌滤纸和0.22μm的微孔滤膜过滤，除去菌丝和孢子，-20℃保存备用。

菌饼制备：打取经单孢分离纯化后，于PDA培养基培养7-9天的链格孢菌落边缘旺盛生长的6mm的菌盘作为菌饼备用。

孢子悬浮液制备：将已产孢的落葵链格孢菌丝块，经三层无菌纱布过滤，得到孢子悬浮液，并将孢悬液的浓度调整为1×10⁶～1×10⁷个分生孢子/mL。

实施例3落葵链格孢发酵代谢产物对苹果树腐烂病的防治效果——离体枝条实验

通过离体苹果枝条测定实施例2制备的落葵链格孢培养滤液、菌饼和孢子悬浮液对苹果树腐烂病的保护和治疗作用。

保护作用：采集试验田1～2年生富士苹果枝条，剪取15cm长、粗细一致的枝段，75%乙醇溶液消毒后枝条两端用湿润的脱脂棉保湿。用直径6mm的打孔器打孔，然后接上苹果内生落葵链格孢菌饼，或涂抹其孢子悬浮液（浓度为1×10⁶～1×10⁷个分生孢子/mL），两天后去除菌饼并接种旺盛生长的苹果树腐烂病菌菌饼，培养滤液的施用方法是先涂抹50μL培养滤液原液，室温晾干再涂抹50μL培养滤液原液室温晾干，然后当天接种腐烂病菌菌饼，每个枝条2个接种点，每处理设置3个重复，每重复4个接种点，以接种空白培养基PDA，空白培养基ME，无菌水1（孢子悬浮液处理的空白对照，处理后两天接腐烂病菌菌饼）、无菌水2（苯醚甲环唑和培养滤液处理的空白对照，处理当天接腐烂病菌菌饼）作为阴性对照，0.5g/l的苯醚甲环唑作为阳性对照。用保鲜膜保湿72h，于25℃恒温培养箱中培养3天及6天后，观察苹果树腐烂病的发生情况，测量病斑大小，计算病斑面积和防治效果。

治疗作用：采用和保护作用相同的方法处理枝条。用直径6mm的打孔器打孔，然后接种旺盛生长的苹果树腐烂病菌菌饼，保鲜膜保湿2天后，去掉腐烂病菌菌饼，然后接苹果内生落葵链格孢菌饼，或涂抹其孢子悬浮液（浓度同保护作用）或其培养滤液（也是先涂抹50μL培养滤液原液，室温晾干再涂抹50μL培养滤液原液室温晾干），每个枝条2个接种点，每处理设置3个重复，每重复4个接种点，以接种PDA菌饼，空白培养基ME，无菌水作为阴性对照，0.5g/L的苯醚甲环唑作为阳性对照。用保鲜膜保湿72h，于25病恒温培养箱中培养3天和6天后，观察苹果树腐烂病的发生情况，测量病斑大小，计算病斑面积和防治效果。

病斑面积＝1／4×∏×长径×短径

防治效果（%）＝［（对照病斑面积－菌饼面积）－（处理病斑面积－菌饼面积）］／（对照病斑面积－菌饼面积）×100

落葵链格孢发酵代谢产物对离体枝条苹果树腐烂病的保护和治疗作用结果分别见表2和表3。

表2落葵链格孢发酵代谢产物对离体枝条苹果树腐烂病的保护作用

表3落葵链格孢发酵代谢产物对离体枝条苹果树腐烂病的治疗作用

表2表3显示出实施例2制备的落葵链格孢培养滤液原液、菌饼和孢子悬浮液对病斑的扩展均有一定的抑制效果，且三者对腐烂病的防治效果有一定差异。

保护作用接种菌饼的防效最高，可达95.07%，其次为培养滤液的68.71%；治疗作用培养滤液防效最高，为51.40%，其次为菌饼的49.91%。生防处理接种后6天，保护和治疗作用病斑长度及面积较3天前有所增大，但明显低于阴性对照，仍具有一定的防治效果。

实施例4落葵链格孢培养滤液对苹果树腐烂病的防治效果——田间试验

通过田间试验测定实施例2制备的落葵链格孢培养滤液对苹果树腐烂病的保护和治疗作用。

保护作用：选取5年生，长势相近的富士苹果树，在主枝上用6mm打孔器打孔（形成新鲜剪锯口）后涂苹果内生落葵链格孢培养滤液（每涂一遍自然晾干后再涂，共涂5遍），用保鲜膜包裹保湿，2天后接种旺盛生长的苹果树腐烂病菌菌饼（培养6天左右）保湿一周后去除保鲜膜，以涂不含链格孢的空白培养基和无菌水的处理为空白对照，每处理3次重复，每重复4棵树。观察腐烂病的发生情况，计算发病率，病斑面积以及防治效果。

治疗作用：选取5年生，长势相近的富士苹果树，在主枝上用6mm打孔器打孔（形成新鲜剪锯口），喷水保湿，并接种旺盛生长的苹果树腐烂病菌菌饼（培养6天左右），后用保鲜膜包裹保湿，2天后去掉腐烂病菌菌饼，再涂苹果内生落葵链格孢培养滤液（每涂一遍自然晾干后再涂，共涂5遍），保鲜膜包裹，一周后去除保鲜膜，以涂不含链格孢的空白培养基和不涂培养滤液只喷水的处理为空白对照，每处理3次重复，每重复4棵树。观察腐烂病的发生情况，计算发病率，病斑面积以及防治效果。

发病率（%）＝病株数／总株数×100

病斑面积＝1／4×∏×长径×短径

防治效果（%）＝（对照发病率－处理发病率）／对照发病率×100

防治效果（%）＝［（对照病斑面积－菌饼面积）－（处理病斑面积－菌饼面积）］／（对照病斑面积－菌饼面积）×100

田间保护和治疗作用试验结果显示出，与对照相比，实施例2制备的落葵链格孢培养滤液能有效抑制腐烂病菌的侵入和扩展，培养滤液处理后病斑面积大小随时间有所增长，但显著低于同时段调查的空白对照病斑面积（图3、图4）。

对于保护作用接种3周后发病率达25%，病斑面积扩展的防效为80.60%和（见表4）；治疗作用接种3周后发病率达50%病斑面积扩展的防效为71.47%（见表5）。

表4田间接种落葵链格孢培养滤液对苹果树腐烂病的保护作用

实施例5落葵链格孢培养滤液对苹果树腐烂病刮除病斑的防治效果

田间刮除病斑铲除防治试验：病斑部位及其周边1cm处的健康部位用梵氏刮刀刮至韧皮部，周围露出健康组织，然后用毛刷将搅拌均匀的药剂涂抹于伤口处及周围2cm范围内的健康树皮上。设置的处理：苹果内生落葵链格孢培养滤液原液、3.315%甲流萘乙酸、空白培养基ME和无菌水为空白对照。于2013年5月10日刮除病斑后进行处理，之后每30天进行一次调查，共调查3次。记录病斑的复发情况，游标卡尺测量愈伤组织的宽度，并计算防治效果。

防治效果（%）＝（对照复发率－（处理复发率）／对照复发率×100

果园中刮除病斑后涂抹实施例2制备的落葵链格孢培养滤液原液，90天后调查12块病斑，对照有10块复发，培养滤液处理复发5块，防效为50%（见表6）；培养滤液处理后形成的愈伤组织宽度为3.31mm，与无菌水处理的对照宽度形成显著差异。

表6落葵链格孢培养滤液对苹果树腐烂病病斑复发的防治效果和组织愈合的影响

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种落葵链格孢菌株，其特征在于，命名为落葵链格孢（Alternaria basellae），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2013年9月10日，保藏编号为CGMCC No.8166。

2.权利要求1所述的落葵链格孢菌株的代谢产物在生物防治苹果腐烂病害中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述落葵链格孢菌株的代谢产物为落葵链格孢培养滤液、菌饼或孢子悬浮液。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在苹果树新鲜的剪锯口和/或苹果树腐烂病病斑刮除后涂抹落葵链格孢培养滤液。

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