CN113215038B - 一种嗜热脂肪地芽孢杆菌及其用于快速检测样品中抗生素的方法 - Google Patents

一种嗜热脂肪地芽孢杆菌及其用于快速检测样品中抗生素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种嗜热脂肪地芽孢杆菌及其用于快速检测样品中抗生素的方法，具体而言，所述菌为嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)GS101,于2021年01月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21738。另外，本发明还提供了一种检测棒。本发明的方法和/或检测棒对多种抗生素具有高灵敏性，不仅准确度高、正确度高，而且具有稳定性好，操作简单，检测快速的特点。

Description

一种嗜热脂肪地芽孢杆菌及其用于快速检测样品中抗生素的 方法
技术领域
本发明涉及一种嗜热脂肪地芽孢杆菌及其用于快速检测样品中抗生素的方法，属于生物技术领域。
背景技术
现代养殖业日渐向规模化、集约化方向发展,抗生素已成为保障畜禽健康生长和畜牧业正常发展的物质基础。如果不合理的使用抗生素易造成肉类食品中抗生素残留,不仅危害人体健康,而且影响畜牧业的可持续健康发展。近年肉类食品中抗生素残留超标时有报道，我国从1999年开始组织实施动物及动物产品抗生素残留监控，平均每年抽检1.4万批次样品。2016年2月24日，国家市场监督管理局发布抽检通告，在抽检的374批次肉及肉制品中，有8个批次不合格，原因是其中的磺胺类、土霉素、氟苯尼考、沙拉沙星、恩诺沙星类抗生素残留超标。加强抗生素残留检验对畜禽屠宰产业健康发展至关重要，目前畜禽肉中抗生素残留检测技术常需使用高效液相色谱仪、气相色谱质谱仪或超高效液相串联质谱仪等大型仪器，其优点是能准确定性、精确定量，但使用此类仪器检测成本高、检测环境要求高、检测周期长，不适用于屠宰行业的现场检测；屠宰场常使用酶联免疫法筛选，其优点是成本低，但是操作复杂，批间差异大，准确性低，且往往每次只能测定某一种或某一类抗生素(如磺胺类)，样品处理复杂、检测成本高，随着新食品安全法的实施，检测样品的批次增加，酶联免疫法不适合屠宰现场实时检测，无法为监管机构实时提供畜禽产品抗生素残留超标情况。因此开发广谱、简单的检测方法对政府机构监管人员和企业质控人员迫在眉睫，同时对畜禽屠宰产业健康发展及放心安全食品有着重要现实意义。
人们已经发现，在快检技术中应用微生物能够实现现场、实时检测，同时还可测定畜禽肌肉组织中β-内酰胺类、磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、酰胺醇类等广谱抗生素残留，能够满足畜禽屠宰企业和监管机构现场、实时、快速检测的需要。
因此，需要一种简便经济的检测手段，其能够对广谱(多种)抗生素均具有高灵敏性；同时，其不仅准确度高、正确度高，而且稳定性好、操作简单，检测快速。
发明内容
为了进一步改良抗生素的微生物检测方法，本发明提供一种嗜热脂肪地芽孢杆菌及其用于快速检测样品中抗生素的方法，能够快速检测如肌肉组织、饲料、血清和尿液等样品中的抗生素。
所述菌具体为嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)GS101,于2021年01月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21738。
本发明提供一种检测样品中抗生素残留的方法，以所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌GS101作为对抗生素敏感的微生物，通过使培养基中的指示剂变色来检测样品中是否含有抗生素。
本发明的另一目的在于提供一种用于上述方法的检测棒，以避免使用昂贵复杂的仪器，使快检更加简便经济，同时使检测快速且结果准确。
本发明所述检测棒包括检测管、拭子和杆部。
本发明所述检测管由液体试剂、固体试剂组成。
优选的，所述检测棒自上而下由杆部、拭子和检测管三部分组成，其特征在于：检测管中包含液体试剂和固体试剂，所述固体试剂中包被嗜热脂肪地芽孢杆菌GS101。
所述检测棒杆部顶端为环形切割端，可用于切割肌肉组织样品。
本发明的菌株来源于转化的嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)，后者经如下步骤制备：
1)对抗生素敏感的一个基因进行改造，获得对抗生素敏感的基因，并将该基因合成或克隆。
2)以pMD-18T为出发质粒，将该合成或克隆的基因与pMD-18T质粒连接，获得重组质粒1。
3)将重组质粒1进行双酶切，将pSET152以BamH I进行酶切纯化后，将两者连接，获得重组质粒2。
4)采用接合转移的方法将重组质粒2转入嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)，鉴定阳性转化菌。
5)所述阳性转化菌再经多次传代培养后，进行抗生素敏感实验。
发明人发现，与其他阳性转化菌不同的是，有一转化菌株竟同时对多种抗生素普遍都十分敏感(推测可能是传代过程发生了某种改变)，因而具有非常好的应用前景。发明人遂将其命名为GS101，并于2021年01月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21738，鉴定其属于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)。
此外，本发明提供了一种检测棒。优选的，所述检测棒的检测管中的固体试剂由如下步骤制成：
1)将2g胰蛋白胨、1g酵母浸膏、1g葡萄糖、0.5g琼脂和1000ml水混匀，调节pH为7.5±0.2，加入0.004g溴甲酚紫，以0.5g为单位分装于塑料检测管中，121℃灭菌10分钟。
2)待温度降至室温时加入90-110μl菌GS101悬浮液，混匀，
0-7℃保存。
优选的，所述检测棒的检测管中的液体试剂由如下步骤制备而成：
称量7.9g NaCl,0.2g KCl,0.24g KH2PO4和1.8g K2HPO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.5,最后加蒸馏水定容至1L。将其分装至每个微管中，每管为0.8ml，微管两端由铝箔密封。121℃灭菌10分钟。
本发明提供一株嗜热脂肪地芽孢杆菌，其特征在于：所述嗜热脂肪地芽孢杆菌为GS101，拉丁名为Geobacillus stearothermophilus，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.21738。
本发明提供所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌GS101在检测样品里是否含有抗生素中的应用。
本发明提供一种用于检测样品中是否含有抗生素的制剂，其特征在于，包括嗜热脂肪地芽孢杆菌GS101。
本发明提供一种检测样品中是否含有抗生素的方法，其特征在于，使用嗜热脂肪地芽孢杆菌GS101。
本发明提供一种快速检测样品中抗生素残留的检测棒，其由检测管、杆部和拭子三部分组成，其特征在于：检测管中包含液体试剂和固体试剂，所述固体试剂中包被有嗜热脂肪地芽孢杆菌GS101。
优选的，所述杆部的顶端为环形切割端。
优选的，所述固体试剂包含微生物常规培养基、指示剂和对抗生素敏感的微生物。
在一个实施例中，指示剂为溴甲酚紫。
在一个实施例中，对抗生素敏感的微生物为嗜热脂肪地芽孢杆菌GS101。
优选的，所述液体试剂包含(或为)盐溶液，例如钾盐和钠盐的混合物，具体的，例如NaCl、KC、KH2PO4和、K2HPO4的混合液。
本发明提供一种快速检测样品中抗生素残留的方法，其使用检测棒，所述检测棒由检测管、杆部和拭子三部分组成，其特征在于：检测管中包含液体试剂和固体试剂，所述固体试剂中包被有嗜热脂肪地芽孢杆菌GS101。
优选的，所述杆部的顶端为环形切割端。
本发明还提供一种用于微生物法快速检测肌肉组织、饲料、血清和尿液等样品中抗生素的快速检测方法，其包括如下步骤：
1)样品制备(每种样品制备方法示例如下)
a)肾脏和肝脏样品
将拭子从检测棒中拔出。使用检测棒露出的开口端，插入新鲜的肾脏或肝脏皮质约1-2cm深做环形切割，取渗出液用于检测。
b)肌肉样品
将肌肉样品速冻，然后解冻，取渗出液用于检测。
c)血清样品
将血液收集于50mL离心管中，凝集4小时，从管中取出凝块，离心剩余的液体(1200g，5分钟)，收集上清液。
d)尿液样品制备
移取500μL混匀的新鲜或解冻的尿液至空的离心管中，如果尿液中有颗粒，需要离心(1200g，5分钟，取上清)。
e)饲料样品制备
称取1.0±0.1g代表性粉末样品装入一次性50ml离心管中。加入PBS缓冲液(0.01MpH7.4)至10ml刻度，盖上盖子静置5分钟。剧烈振荡1分钟，检测前沉淀1分钟。
2)样品移取(每种样品制备方法示例如下)
a)肾脏、肝脏和肌肉样品
握住拭子杆，将棉签头插入肾脏、肝脏或肌肉组织的环形切口，顺时针移动同时旋转30秒，使拭子充满汁液，去除拭子上的样品颗粒。
b)血清、饲料和尿液样品
打开离心管，将拭子从检测棒中拔出，浸入样品上清液中，浸泡10秒。
3)样品检测(适用于各种样品的检测)
将孵育器设置为65℃，待温度稳定后进行检测。
垂直缓慢的旋转手柄，把拭子重新插入检测棒中，先拧到一半，使拭子刺破上层密封箔膜并完全浸没到上层清澈的液体试剂中，但不刺破下层的密封箔膜，等待2分钟。完全旋下拭子，使拭子直接到达检测管底部琼脂的上方。在硬面轻敲检测管底部5次，使液体完全进入检测管底部。完全旋出拭子，再次轻敲检测管底部5次。65℃孵育3小时。孵育结束后，拿出检测管冷却至室温，然后进行结果分析判定。
4)结果判读
从孵育器中取出检测检测管。与结果判读卡进行颜色比对，目视判定示意图见图1。
阴性：琼脂颜色为黄色或者黄/绿色为阴性结果。
可疑：琼脂下半部分为黄色或黄绿色，上半部分为蓝色/紫色或棕色为可疑结果。
阳性：琼脂颜色为蓝/紫色为阳性结果。
当样品检测结果判为阳性或可疑时，应采用国家标准方法进行确证。
菌生长可产生代谢产物，使培养基中的颜色指示剂变色，而样品中的抗生素能够抑制菌的生长，不产生代谢产物，因此指示剂不变色。所以，可通过培养基颜色的变化快速检测样品中是否含有抗生素。
本发明的方法和/或检测棒对多种抗生素具有高灵敏性，不仅准确度高、正确度高，而且具有稳定性好，操作简单，检测快速的特点。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。
图1判定示意图。
图2检测棒示意图。
具体实施方式
下面参考附图来说明本发明的实施例。在本发明的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述。
下面结合附图对本发明做进一步描述。
实施例
实施例1
嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)GS101的制备：
1)将GS101在平板上65℃培养24小时后，接种到装有繁殖培养基的试管中65℃摇床培养，每隔8小时进行梯度稀释，活菌计数，并观察芽孢形成，当有80％芽孢形成时，停止培养。
2)培养液5000rpm离心10分钟，弃上清液。将沉淀物悬浮于灭菌生理盐水中，振摇离心，弃上清，重复洗涤3次。
3)用灭菌生理盐水悬浮芽孢，使其含量约为1×109cfu/ml。
实施例2
1、检测管中固体试剂的制备：
1)将2g胰蛋白胨、1g酵母浸膏、1g葡萄糖、0.5g琼脂和1000ml水混匀，调节pH为7.5±0.2，加入0.004g溴甲酚紫，分装于螺口塑料检测管中，每管0.5g，121℃灭菌10分钟。
2)待温度降至室温时加入90-110μl菌GS101的悬液，混匀，0-7℃保存。
2、检测管中液体试剂的制备：
称7.9g NaCl,0.2g KCl,0.24g KH2PO4和1.8g K2HPO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.5,最后加蒸馏水定容至1L。将其分装至微管中，每管为0.8ml，121℃灭菌10分钟。
3、检测管的制备：
将液体试剂用铝箔密封于无菌塑料管中，将塑料管置于含0.5g固体试剂的螺口塑料检测管中。
4、检测棒的组装：
将带螺纹的杆部、拭子以及检测管自上而下地进行本领域常规组装(如图2的结构)。
实施例3
本实施例在于研究本发明所述方法的检测限。
分别选取兽药残留为阴性的牛肉、猪肾脏、羊肝脏、猪尿和鸡血清，用不同种类的兽药加标，用拭子沾取样品，采用本发明所述方法进行检测，检测到培养基不变色的最低浓度即为检测限，一般，检测限越低，灵敏度越高。本发明的方法可检测到的兽药种类及检测限见表1，本领域技术人员不难看出，本发明方法对各类抗生素的检测限都明显低于常规检测限，具有对各种抗生素的普遍的高灵敏性。
表1检测限
Figure BDA0003059662670000091
Figure BDA0003059662670000101
实施例4
本实施例在于研究本发明所述方法与现有菌抑制法检测项目和灵敏度的差异。所述现有菌为市售的对抗生素敏感的商品化菌株。
分别选取兽药残留为阴性的猪肾脏样品，用不同种类的抗生素加标，分别采用本发明所述方法(即采用GS101)和现有菌测试法检测，检测到培养基不变色的最低浓度即为检测限。可检测到的兽药种类及检测限见表2。
表2本方法与传统方法检测限对比
Figure BDA0003059662670000111
Figure BDA0003059662670000121
由表2可见，本发明所述方法所有项目的检测限都符合GB 31650限量要求，而采用现有菌的方法有多种药物无法检出(即“-”)，且很多药物的检测限大于国家限量要求，且5种禁用药物的检测限均非常高，无法满足检测要求。因此，相比于现有菌，本发明的GS101具有对广谱抗生素的更高灵敏性和更大的普适性。
实施例5
本实施例在于研究本发明所述方法的假阴性率和假阳性率。
采用本发明所述方法分别对100例牛肉、猪肾、羊肝、猪尿、鸡血清和饲料进行检测，检测结果见表3-表8。
表3牛肉
Figure BDA0003059662670000122
Figure BDA0003059662670000131
表4猪肾
Figure BDA0003059662670000132
表5羊肝
Figure BDA0003059662670000133
表6猪尿
Figure BDA0003059662670000134
表7鸡血清
Figure BDA0003059662670000141
表8饲料
Figure BDA0003059662670000142
由表3-表8可见，本发明的方法对于牛肉、猪肾、羊肝、猪尿、鸡血清和饲料样品的假阴性率均为0％，假阳性率均为2％，准确度高，正确率高，满足快检方法的技术要求。
实施例6
本实施例在于研究本发明所述方法与HPLC方法的一致性。
分别用本发明所述方法与HPLC方法检测牛肉、猪肾、羊肝、猪尿、鸡血清和饲料各50份样本，并对结果进行对比。
当检测结果低于检测限时，本发明所述方法用“-”表示，HPLC方法用“ND”表示；当检测结果高于检测限时，用“+”表示，HPLC方法显示含量具体数值。其对比结果如表9-表14所示。
表9牛肉样品本方法与HPLC方法对比结果(μg/kg)
Figure BDA0003059662670000151
表10猪肾样品本方法与HPLC方法对比结果(μg/kg)
Figure BDA0003059662670000152
Figure BDA0003059662670000161
表11羊肝样品本方法与HPLC方法对比结果(μg/kg)
Figure BDA0003059662670000162
Figure BDA0003059662670000171
表12猪尿样品本方法与HPLC方法对比结果(μg/kg)
Figure BDA0003059662670000172
表13鸡血清本方法与HPLC方法对比结果(μg/kg)
Figure BDA0003059662670000181
表14饲料本方法与HPLC方法对比结果(μg/kg)
Figure BDA0003059662670000182
Figure BDA0003059662670000191
由表9-表14可见，HPLC方法检出21份阳性样本，本发明所述方法检出21份阳性样本，HPLC方法检出279份确证阴性样本，本发明所述方法检出274份阴性样本和5份阳性样本。
表15本方法与HPLC方法实验数据分布表
Figure BDA0003059662670000192
对本发明所述方法和HPLC方法检测结果进行卡方检验，由表15可计算出显著性差异(χ2)为：
Figure BDA0003059662670000193
χ2＜3.84，表示本方法与HPLC方法的阳性确证比率在95％的置信区间内无显著性差异。因此，本发明所述方法与HPLC方法无显著性差异，即准确度高，正确率高。
实施例7
本实施例在于研究本发明所述方法的稳定性。
抽取3个不同批次本发明所述检测棒，对牛肉、猪肾、羊肝、猪鸡血清、饲料阴性和阳性样本进行检测，每个样品做6个平行，检测结果见表16。
表16批次间稳定性验证结果
Figure BDA0003059662670000201
从表16结果可以看出，对同一样品用不同批次本发明所述检测棒进行6次检测，结果一致，符合稳定性检测要求。
实施例8
本实施例还摸索了最佳实验条件。
1、取0.5g制备的培养基，加入100μl悬浮菌液和0.8ml液体试剂，分别在55℃、60℃、65℃和70℃下进行培养，每一温度做5个平行，记录培养基变色所需的时间，结果见表17。
表17孵育温度与时间的关系
孵育温度 1 2 3 4 5
55℃ 6小时 6小时 6小时 6小时 6小时
60℃ 5小时 5小时 5小时 5小时 5小时
65℃ 3小时 3小时 3小时 3小时 3小时
70℃ 5小时 5小时 5小时 5小时 5小时
由表17可见，当孵育温度为65℃时，孵育时间最短为3小时，表明65℃为最佳孵育温度。
2、将制备的109CFU/ml的菌液用无菌生理盐水梯度稀释，使菌液浓度为105-108CFU/ml。取0.5g制备的固体培养基，加入100μl不同浓度的菌液，首先检测不加抗生素时，在65℃条件下培养基变色所需的时间；然后检测不同浓度的抗生素类药物，在65℃条件下，按照对应的时间进行孵育，以能观察到培养基为紫色的抗生素浓度为检测限，结果见表18。
表18不同浓度菌液对应的检测限
Figure BDA0003059662670000221
由表18可以看出，随着菌液浓度的增加，所需的孵育时间越来越短，检测限越来越高，灵敏度越来越低，当菌液浓度为105和106时，各种抗生素的灵敏度均符合GB31650的限量要求，但当菌液浓度为105时，培养时间较长。因此，选择灵敏度符合GB31650限量要求，且孵育时间最短的浓度作为最佳菌液浓度，即选择106CFU/ml为最佳菌液浓度。
3、取0.5g制备的固体培养基，加入100μl悬浮菌液和0.8ml液体试剂，分别孵育2h、2.5h、3h、3.5h和4h后观察培养基颜色，每一时间做5个平行，结果见表19。
表19孵育时间对检测结果的影响
孵育时间 1 2 3 4 5
2小时 - - - +- +-
2.5小时 +- +- +- + -
3小时 + + + + +
3.5小时 + + + + +
4小时 + + + + +
注：黄色+紫色-介于黄色紫色之间+-
由表19可见，当孵育2小时时，培养基开始变色，当孵育时间为3小时时，培养基全部变色，表明培养完成。因此，选择3小时作为最佳孵育时间。
本发明的有益效果：
其一，检测管中包被的菌为GS101，其对几乎所有抗生素种类敏感，可同时检测广谱抗生素，不仅灵敏度高、准确度高，正确率高，而且稳定性很好。
其二，检测棒杆部顶端为环形切割端，可用于切割肌肉组织样品，操作更加简单快速，更适用于现场检测。

Claims (10)

1.一株嗜热脂肪地芽孢杆菌，其特征在于：所述嗜热脂肪地芽孢杆菌为GS101，拉丁名为Geobacillus stearothermophilus，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.21738。
2.权利要求1所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌在检测样品中抗生素残留的应用。
3.一种用于检测样品中是否含有抗生素的制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌。
4.一种检测样品中抗生素残留的方法，其特征在于，以权利要求1所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌作为对抗生素敏感的微生物，通过使培养基中的指示剂变色来检测样品中是否含有抗生素。
5.一种快速检测样品中抗生素残留的检测棒，其自上而下由杆部、拭子和检测管三部分组成，其特征在于：检测管中包含液体试剂和固体试剂，所述固体试剂中包被有权利要求1所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌。
6.根据权利要求5所述的检测棒，其特征在于，所述液体试剂包含盐溶液。
7.根据权利要求5所述的检测棒，其特征在于，所述固体试剂还进一步包含微生物常规培养基和指示剂。
8.根据权利要求5所述的检测棒，其特征在于，所述杆部的顶端为环形切割端。
9.一种快速检测样品中抗生素残留的方法，所述方法使用检测棒，所述检测棒自上而下由杆部、拭子和检测管三部分组成，其特征在于：检测管中包含液体试剂和固体试剂，所述固体试剂中包被有权利要求1所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述杆部的顶端为环形切割端。
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