CN112063683B - 一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法以及试剂盒 - Google Patents

一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法以及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法，包括以下：步骤a，样品前处理；步骤b，目标菌液制备；步骤c，试剂盒培养；步骤d，判定标准：步骤e，第一次判定；步骤f，第二次判定。本发明的检测方法中对目标菌的选择无限制，筛查范围覆盖全部抗生素，操作简便，快速、检测抗生素范围广、灵敏度高，准确率高，试剂需求量少，不需要大型的分析仪器，利于无经验人员操作使用，具有较高的社会意义。同时耗时较少，分析成本低，对实验环境要求低，针对性强，抗干扰能力强，极大的降低了假阳性或假阴性的情况产生，适用于对食品及其生产、流通过程中抗生素残留进行大批量快速检测。

Description

一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法以及 试剂盒
技术领域
本发明涉及食品领域，特别是涉及一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法以及试剂盒。
背景技术
人类使用了残留有大量抗生素的食品，会使人体对抗生素产生抗性，引起各种组织器官的病变，甚至癌变，对人体的健康产生很大的危害。国家的相关部门虽然已经颁布了一些关于生鲜牛乳中抗生素含量的标准，但是仍然有一些抗生素含量超标的食品流入市场，危及消费者的生命健康。因此，食品中抗生素的残留检测是很重要的问题。
一般来说，肉类（畜禽）、鱼虾（水产）、蛋类、奶类、饲料和蜂蜜等产品需要进行抗生素的检测，常用方法包括色谱分析法、微生物检测法和免疫检测法。色谱分析法样品需要进行复杂的前处理，分析速度慢，仪器要求高，对检测人员要求高。微生物检测法是根据样品对微生物的抑制作用，来定性或定量检测样品中残留的抗生素，但是现有的微生物检测方法检测耗时长，检测结果需肉眼判断，易产生误差；免疫检测法主要依赖于抗体抗原的质量，而抗原抗体的制备要求高耗时长，限制了免疫法的广泛应用。并且以上三类现有方法均为一次检测只能检测某些特定种类的抗生素，无法对全部抗生素进行覆盖检测，漏检率高，容易造成假阴性，检测意义大打折扣。
因此，需要开发一种操作简便、快速，不需要大型的分析仪器，耗时较少，灵敏度高，检验结果正确率高，分析成本低，对实验环境要求低，对抗生素全族检测覆盖的适用于检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法以及试剂盒。根据本发明的一个方面，提供了一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法，包括以下：
步骤a，样品前处理：
液体样品前处理：随机抽取待检测液体样品，取一定量的所述液体样品进行过滤并除菌，得到第一待测样液；
固体样品前处理：随机抽取待检测固体样品，取一定量的所述固体样品进行均质化处理，进行离心、过滤并除菌，得到第二待测样液；
步骤b，目标菌液制备：
根据所要求检测的抗生素种类，选择一种或多种目标菌并制备相应的目标菌液，所述目标菌液中含有一种细菌或真菌，所述目标菌液的初始活菌浓度为100-10000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：
取相同体积的所述灭菌水和第一待测样液或所述第二待测样液分别加入试剂盒中，振荡混匀，得到空白对照试剂盒和加样试剂盒，向所述加样试剂盒与所述空白对照试剂盒中分别加入相同且等量的所述目标菌液，在相同的培养条件下，培养30min后，分别测定所述加样试剂盒中各目标菌的活菌浓度，分别测定所述空白对照试剂盒中各目标菌的活菌浓度，得到各所述目标菌的样品活菌浓度与空白对照活菌浓度，根据以下公式计算得到各所述目标菌的第一次活菌生长率，所述试剂盒包括泥鳅提取物、河蚌提取物、火龙果提取物和花椰菜提取物，所述公式为：
Figure 406992DEST_PATH_IMAGE001
步骤d，判定标准：
以含0.01μg/kg红霉素的样品作为加标样品，以大肠杆菌为目标菌按照所述步骤a~c在相同培养条件下，进行培养，以培养240min时的活菌生长率作为标准生长率，计算得到所述标准生长率为92%，并以所述标准生长率作为判定标准；
步骤e，第一次判定：
当各所述目标菌的第一次活菌生长率之一小于等于所述标准生长率92%时，即可判定为阳性，即所对应的待测样品中有抗生素残留，当各所述目标菌的第一次活菌生长率均大于所述标准生长率时，则需要进行第二次判定；
步骤f，第二次判定：
第一次活菌生长率均大于所述标准生长率的加样试剂盒和空白试剂盒，在所述培养条件下继续培养到240min，分别测定所述加样试剂盒中各目标菌的活菌浓度，分别测定所述空白对照试剂盒中各目标菌的活菌浓度，并根据所述步骤c中的公式计算得到各目标菌的第二次活菌生长率，当各所述目标菌的第二次活菌生长率之一小于等于所述标准生长率时，即可判定为阳性，即所对应的待测样品中有抗生素残留，当各所述目标菌的第二次活菌生长率均大于所述标准生长率时，则可判定阴性，即所对应的待测样品中未检出抗生素残留。
本发明的有益效果：本发明利用专属的试剂盒，对待测样品和目标菌进行短时间培养，测定培养后的活菌浓度，通过计算培养后的活菌生长率，对待测样品是否含有抗生素残留进行第一次判定。抗生素残留量较高的样品经过第一次判定被检测出，抗生素残留量较低的样品再进行继续培养，进行第二次判定。通过设置第一次判定和第二次判定，将抗生素残留量较低的样品筛选出来，进行第二次判定，既可以减轻检测人员的工作量，又可以提高检测准确度，避免漏检、错检。第一次判定培养时间短，节省检测时间，提高了检测效率，适用于对食品中抗生素残留进行大批量快速检测。本发明中使用的试剂盒用于微量检测，因用于微量检测的试剂盒内容物量较少，避免因氯化钠添加后分布不均而形成局部高盐，进而影响目标菌的生长和培养，本发明中的试剂盒中的泥鳅提取物、河蚌提取物、火龙果提取物和花椰菜提取物可以提供充足的营养物质，满足目标菌的生长需求，不需要添加氯化钠，使目标菌在不添加氯化钠的条件下，可以正常生长。
本发明的检测方法对目标菌的选择无限制，筛查范围覆盖全部抗生素，检出限低，操作简便，灵敏度高，正确率高，不需要大型的分析仪器。同时耗时少，分析成本低，对实验环境要求低，针对性强，极大的降低了假阳性或假阴性的情况产生，适用于对食品及其生产、流通过程中抗生素残留进行大批量快速检测。
在一些实施方式中，待测样品第一次判定为阳性后，进行验证判定：在所述培养条件下继续培养，依次在培养60min、90min、120min、150min、180min时，选择所述目标菌中的任一种作为验证菌，分别测定所述加样试剂盒和所述空白对照试剂盒中所述验证菌的活菌浓度，并根据所述步骤c中的公式计算得到加样试剂盒中所述验证菌在各相应培养时间的活菌生长率，所述验证菌的活菌生长率随培养时间延长而依次连续降低，则可判定为阳性，即所对应的待测样品中有抗生素残留。为了确保检测结果的准确，检测人员可以在第一次判定为阳性后，选择进行验证判定。验证判定采用活菌生长率趋势作为判定标准，与第一次判定的标准不同，以另一种方式对待测样品进行判定，从而保证检测结果的准确性，避免假阳性情况出现。
在一些实施方式中，待测样品第二次判定为阳性后，进行验证判定：重复所述步骤a~c，依次在培养30min、60min、90min、120min、150min、180min时，选择所述目标菌中的任一种作为验证菌，分别测定所述加样试剂盒和所述空白对照试剂盒中所述验证菌的活菌浓度，并根据所述步骤c中的公式计算得到加样试剂盒中所述验证菌菌在各相应培养时间的活菌生长率，所述验证菌的活菌生长率随培养时间延长而依次连续降低，则可判定为阳性，即所对应的待测样品中有抗生素残留。为了确保检测结果的准确，检测人员可以在第二次判定为阳性后，选择进行验证判定。验证判定采用活菌生长率趋势作为判定标准，与第二次判定的标准不同，以另一种方式对待测样品进行判定，从而保证检测结果的准确性，避免假阳性情况出现。
在一些实施方式中，试剂盒为无菌试剂盒，泥鳅提取物、河蚌提取物、火龙果提取物和花椰菜提取物均为粉末状。试剂盒为无菌试剂盒，在培养过程中，避免非目标菌对检测结果的干扰。试剂盒中的组分均为粉末状，使得试剂盒内不含水，试剂盒不会稀释待测样品，从而提高了本方法对待测样品中抗生素残留的检出限，保证了对待测样品中微量抗生素残留的检出。
在一些实施方式中，试剂盒中泥鳅提取物、河蚌提取物、火龙果提取物和花椰菜提取物的质量份数比为40~60：40~60：0.5~3：0.5~3。采用组分和质量份数比的试剂盒可以保证目标菌在试剂盒内进行较好的生长和培养，满足本发明方法的检测需要，避免因添加氯化钠，而造成的局部高盐使得目标菌生长受影响。
在一些实施方式中，目标菌是革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、厌氧菌和真菌中的一种或多种。本发明的方法中使用的目标菌不受菌种的限制，用户可以根据实际情况和检测需要选择任何一种菌作为目标菌，保证了本发明方法有极高的适用性，限制因素少。
在一些实施方式中，厌氧菌以痤疮丙酸杆菌为代表菌，真菌以念珠菌为代表菌，革兰氏阳性菌以葡萄球菌为代表菌，革兰氏阴性菌以大肠杆菌为代表菌，目标菌是葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌和念珠菌中的一种或多种。本发明的方法在使用时，可以根据具体检测对象和检测要求，选择合适的目标菌，目标菌可以是一种也可以是多种，目标菌所对应的抗生素种类要能涵盖所需要检测的抗生素的种类。用户可以根据实际情况和检测需要选择目标菌，使本方法在实际使用中有很强的灵活性，检测范围广，可以一次对抗生素全族进行残留检测。
在一些实施方式中，痤疮丙酸杆菌制备得到痤疮丙酸杆菌菌液，所述痤疮丙酸杆菌菌液用于对应检测甲硝唑类抗生素，所述念珠菌制备得到念珠菌菌液，所述念珠菌菌液用于对应检测抗真菌类抗生素，所述葡萄球菌制备得到葡萄球菌菌液，所述葡萄球菌菌液用于对应检测除甲硝类抗生素和抗真菌类抗生素以外的抗生素，所述大肠杆菌制备得到大肠杆菌菌液，所述大肠杆菌菌液用于对应检测除甲硝类抗生素和抗真菌类抗生素以外的抗生素。相应的目标菌对应相应的抗生素种类，便于用户在使用中选择合适的目标菌，进行检测。
在一些实施方式中，一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的试剂盒，为无菌试剂盒，按照重量份数计包括以下组分：泥鳅提取物40~60、河蚌提取物40~60、火龙果提取物0.5~3和花椰菜提取物0.5~3。试剂盒为无菌试剂盒可以避免由试剂盒带入杂菌而影响，对活菌生长率的测定。试剂盒中的泥鳅提取物、河蚌提取物、火龙果提取物和花椰菜提取物可以为目标菌生长提供充足的养分，不需要添加氯化钠。试剂盒没有添加氯化钠，避免因氯化钠添加后分布不均而形成局部高盐，进而影响目标菌的生长和培养，使目标菌在不添加氯化钠的条件下，可以正常生长。
在一些实施方式中，泥鳅提取物、河蚌提取物、火龙果提取物和花椰菜提取物均为粉末状。本发明的试剂盒适用于进行微量检测，试剂盒内不含水，避免稀释待测样品，从而提高了检出限。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例中的泥鳅提取物选择陕西斯诺特生物技术有限公司供应的泥鳅提取物，河蚌提取物选择陕西斯诺特生物技术有限公司供应的蚌肉提取物，火龙果提取物选择陕西斯诺特生物技术有限公司供应的，花椰菜提取物选择宁陕国圣生物科技有限公司供应的花椰菜提取物；
本实施例中离心机选择湘仪离心机仪器有限公司供应的HT175R台式高速冷冻离心机，0.45的微孔滤膜选择上海艾研生物科技有限公司供应的美国Millipore0.45μm的一次性针头滤器；
本实施例中需要配制的试剂：
目标菌液：按菌液活化要求对目标菌进行传代2-3代，然后加水稀释，使得菌液浓度为100-10000 cfu/ml之间，制备得到目标菌液。
以下实施例2-4均采用本实施例1中的试剂、仪器、配制的溶液。
实施例2
本发明的一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法以及试剂盒，包括以下：
步骤a，液体样品前处理：随机抽取待测牛奶样品，取5ml牛奶样品过0.45μm的微孔滤膜进行过滤除菌，得到第一待测液；
步骤b，目标菌液制备：根据所要求检测的抗生素种类为常用抗生素类，选择葡萄球菌作为目标菌，并制备相应的葡萄球菌菌液，葡萄球菌菌液的初始活菌浓度为100cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：试剂盒为无菌试剂盒，按照重量份数计由以下组分组成：泥鳅提取物40份、河蚌提取物40份、火龙果提取物0.5份和花椰菜提取物0.5份，各组分均为粉末状。
取1ml第一待测液加入试剂盒中，振荡混匀，得到加样试剂盒，取1ml灭菌水加入到另一试剂盒中，振荡混匀，得到空白对照试剂盒，向加样试剂盒中加入0.1ml葡萄球菌菌液，向空白对照试剂盒中加入0.1ml葡萄球菌菌液。在相同的培养条件下，培养30min时，使用显微镜分别对加样试剂盒和空白对照试剂盒中的培养液进行葡萄球菌计数，分别测定加样试剂盒与空白对照试剂盒中葡萄球菌的活菌浓度。
根据以下公式计算，得到葡萄球菌的第一次活菌生长率为89% ，计算公式为：
Figure 402630DEST_PATH_IMAGE002
步骤d，判定标准：
判定标准为：标准生长率为92%；
步骤e，第一次判定：
葡萄球菌第一次活菌生长率为89%，小于标准生长率92%，判定为阳性，即所对应的待测样品中有抗生素残留。
实施例3
本发明的一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法以及试剂盒，包括以下：
步骤a，液体样品前处理：随机抽取待测鱼塘水样品，取10ml鱼塘水样品过0.45μm的微孔滤膜进行过滤除菌，得到第一待测液；
步骤b，目标菌液制备：根据所要求检测的抗生素种类为常用抗生素类，选择葡萄球菌和大肠杆菌这两种代表菌为目标菌，并分别制备葡萄球菌菌液和大肠杆菌菌液，两种目标菌液的初始活菌浓度均为5000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：试剂盒为无菌试剂盒，按照重量份数计由以下组分组成：泥鳅提取物60份、河蚌提取物60份、火龙果提取物3份和花椰菜提取物3份，各组分均为粉末状。
取2ml第一待测液加入试剂盒中，振荡混匀，得到加样试剂盒，取2ml灭菌水加入到另一试剂盒中，振荡混匀，得到空白对照试剂盒，向加样试剂盒中加入0.2ml葡萄球菌菌液和0.2ml大肠杆菌菌液，向空白对照试剂盒中加入加入0.2ml葡萄球菌菌液和0.2ml大肠杆菌菌液。在相同的培养条件下，培养30min时，使用显微镜分别对加样试剂盒和空白对照试剂盒中的培养液进行葡萄球菌和大肠杆菌计数，分别测定加样试剂盒与空白对照试剂盒中葡萄球菌和大肠杆菌的活菌浓度。
根据以下公式计算，分别得到葡萄球菌和大肠杆菌的第一次活菌生长率，葡萄球菌第一次活菌生长率为89% ，大肠杆菌第一次活菌生长率为93%，计算公式为：
Figure 540351DEST_PATH_IMAGE003
步骤d，判定标准：
判定标准为：标准生长率为92%；
步骤e，第一次判定：
葡萄球菌第一次活菌生长率为89%，大肠杆菌第一次活菌生长率为93%，两者之一小于标准生长率92%，判定为阳性，即所对应的待测样品中有抗生素残留。
待测样品第一次判定为阳性后，可以进行验证判定：
在上述步骤c培养条件下继续培养，依次在培养60min、90min、120min、150min和180min时，选择目标菌中的大肠杆菌为验证菌，分别测定加样试剂盒和空白对照试剂盒中大肠杆菌的活菌浓度，并根据上述步骤c中的公式计算得到大肠杆菌在相应培养时间60min、90min、120min、150min、180min的活菌生长率依次为：93%、84%、74%、65%和56%，大肠杆菌的活菌生长率随培养时间延长而依次连续降低，则判定为阳性，即所对应的待测样品中有抗生素残留。
实施例4
本发明的一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法以及试剂盒，包括以下：
步骤a，固体样品前处理：随机抽取待测鱼肉样品，取10g鱼肉样品进行均质化处理，进行离心、过0.45μm的微孔滤膜进行过滤除菌，得到第二待测样液；
步骤b，目标菌液制备：根据所要求检测的抗生素为全族抗生素，选择葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌和念珠菌这四种代表菌作为目标菌，并分别制备相应的葡萄球菌菌液、大肠杆菌菌液、痤疮丙酸杆菌菌液和念珠菌菌液，四种目标菌液的初始活菌浓度均为1000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：试剂盒为无菌试剂盒，按照重量份数计由以下组分组成：泥鳅提取物50份、河蚌提取物50份、火龙果提取物1.5份和花椰菜提取物1.5份，各组分均为粉末状。
取1.5ml第一待测液加入试剂盒中，振荡混匀，得到加样试剂盒，取1.5ml灭菌水加入到另一试剂盒中，振荡混匀，得到空白对照试剂盒，分别向加样试剂盒和空白试剂盒中加入0.1ml葡萄球菌菌液、0.1ml大肠杆菌菌液、0.1ml痤疮丙酸杆菌液和0.1ml念珠菌菌液。在相同的培养条件下，培养30min时，使用显微镜分别对加样试剂盒和空白对照试剂盒中的培养液进行葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌和念珠菌计数，分别测定加样试剂盒与空白对照试剂盒中葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌和念珠菌的活菌浓度。
根据以下公式分别计算，分别得到葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌和念珠菌的第一次活菌生长率，葡萄球菌第一次活菌生长率为63%、大肠杆菌第一次活菌生长率为52%、痤疮丙酸杆菌第一次活菌生长率为70%、念珠菌第一次活菌生长率为54%，计算公式为：
Figure 127190DEST_PATH_IMAGE004
步骤d，判定标准：
判定标准为：标准生长率为92%；
步骤e，第一次判定：
葡萄球菌第一次活菌生长率为63%、大肠杆菌第一次活菌生长率为52%、痤疮丙酸杆菌第一次活菌生长率为70%、念珠菌第一次活菌生长率为54%，均小于标准生长了成92%，判定为阳性，即所对应的待测样品中有抗生素残留。
实施例5
本发明的一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法以及试剂盒，包括以下：
步骤a，固体样品前处理：随机抽取待测鸡肉样品，取7g鸡肉样品进行均质化处理，进行离心、过0.45μm的微孔滤膜进行过滤除菌，得到第二待测样液；
步骤b，目标菌液制备：根据所要求检测的抗生素为全族抗生素，葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌和念珠菌这四种代表菌作为目标菌，并分别制备相应的葡萄球菌菌液、大肠杆菌菌液、痤疮丙酸杆菌菌液和念珠菌菌液，四种目标菌液的初始活菌浓度均为10000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：试剂盒为无菌试剂盒，按照重量份数计由以下组分组成：泥鳅提取物50份、河蚌提取物50份、火龙果提取物1.5份和花椰菜提取物1.5份，各组分均为粉末状。
取1.0ml第一待测液加入试剂盒中，振荡混匀，得到加样试剂盒，取1.0ml灭菌水加入到另一试剂盒中，振荡混匀，得到空白对照试剂盒。分别向加样试剂盒和空白试剂盒中加入0.1ml葡萄球菌菌液、0.1ml大肠杆菌菌液、0.1ml痤疮丙酸杆菌液和0.1ml念珠菌菌液。在相同的培养条件下，培养30min时，使用显微镜分别对加样试剂盒和空白对照试剂盒中的培养液进行葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌和念珠菌计数，分别测定加样试剂盒与空白对照试剂盒中葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌和念珠菌的活菌浓度。
根据以下公式分别计算，分别得到葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌和念珠菌的第一次活菌生长率，葡萄球菌第一次活菌生长率为98%、大肠杆菌第一次活菌生长率为99%、痤疮丙酸杆菌第一次活菌生长率为98%、念珠菌第一次活菌生长率为98%，计算公式为：
Figure 350361DEST_PATH_IMAGE004
步骤d，判定标准：
判定标准为：标准生长率为92%；
步骤e，第一次判定：
葡萄球菌第一次活菌生长率为98%、大肠杆菌第一次活菌生长率为99%、痤疮丙酸杆菌第一次活菌生长率为98%、念珠菌第一次活菌生长率为98%，均大于标准生长率92%，需要进行第二次判定。
步骤f，第二次判定：
上述步骤c中的加样试剂盒和空白对照试剂盒，在上述培养条件下继续培养到240min，分别测定加样试剂盒和空白对照试剂盒中葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌和念珠菌的活菌浓度，并根据步骤c中的公式计算得到葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌和念珠菌的第二次活菌生长率分别为：葡萄球菌二次活菌生长率为93%、大肠杆菌第一次活菌生长率为90%、痤疮丙酸杆菌第一次活菌生长率为89%、念珠菌第一次活菌生长率为91%，目标菌的第二次活菌生长率中有三个小于标准生长率92%，可判定为阳性，即所对应的待测样品中有抗生素残留。
待测样品第二次判定为阳性后，可以进行验证判定：
重复上述步骤a~c，同样培养条件下，依次在培养30min、60min、90min、120min、150min、180min时，选择痤疮丙酸杆菌作为验证菌，分别测定加样试剂盒和空白对照试剂盒中痤疮丙酸杆菌的活菌浓度，并根据步骤c中的公式计算得到痤疮丙酸杆菌在30min、60min、90min、120min、150min、180min的活菌生长率依次为：98%、96%、95%、93%、92%和91%，痤疮丙酸杆菌的活菌生长率随培养时间延长而依次连续降低，可判定为阳性，即所对应的待测样品中有抗生素残留。
实施例6
本发明的一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法以及试剂盒，包括以下：
步骤a，液体样品前处理：随机抽取待测蜂蜜样品，取5.0ml蜂蜜样品过0.45μm的微孔滤膜进行过滤除菌，得到第一待测样液；
步骤b，目标菌液制备：根据所要求检测的抗生素为抗真菌类抗生素和甲硝唑类抗生素，选择痤疮丙酸杆菌和念珠菌两种代表菌作为目标菌，并分别制备痤疮丙酸杆菌菌液和念珠菌菌液，这两种目标菌液的初始活菌浓度均为8000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：试剂盒为无菌试剂盒，按照重量份数计由以下组分组成：泥鳅提取物50份、河蚌提取物50份、火龙果提取物1.5份和花椰菜提取物1.5份，各组分均为粉末状。
取1.0ml第一待测液加入试剂盒中，振荡混匀，得到加样试剂盒，取1.0ml灭菌水加入到另一试剂盒中，振荡混匀，得到空白对照试剂盒。分别向加样试剂盒和空白试剂盒中加入0.1ml痤疮丙酸杆菌液和0.1ml念珠菌菌液。在相同的培养条件下，培养30min时，使用显微镜分别对加样试剂盒和空白对照试剂盒中的培养液进行痤疮丙酸杆菌和念珠菌计数，分别测定加样试剂盒与空白对照试剂盒中痤疮丙酸杆菌和念珠菌的活菌浓度。
根据以下公式计算，分别得到痤疮丙酸杆菌和念珠菌的第一次活菌生长率，痤疮丙酸杆菌第一次活菌生长率为99%、念珠菌第一次活菌生长率为98%，计算公式为：
Figure 182313DEST_PATH_IMAGE005
步骤d，判定标准：
判定标准为：标准生长率为92%；
步骤e，第一次判定：
痤疮丙酸杆菌第一次活菌生长率为99%、念珠菌第一次活菌生长率为98%，均大于标准生长率92%，需要进行第二次判定。
步骤f，第二次判定：
上述步骤c中的加样试剂盒和空白对照试剂盒，在上述培养条件下继续培养到240min，分别测定加样试剂盒和空白试剂盒中痤疮丙酸杆菌和念珠菌的活菌浓度，并根据步骤c中的公式计算得到痤疮丙酸杆菌和念珠菌的第二次活菌生长率，分别为：痤疮丙酸杆菌第二次活菌生长率为95%、念珠菌第二次活菌生长率为96%，两个目标菌的第二次活菌生长率均大于标准生长率92%，判定为阴性，即所对应的待测样品中未检出抗生素残留。
实施例7
本实施例以灭菌水作为阴性样品，向阴性样品中分别添加红霉素，制备得到红霉素浓度梯度为0.1μg/kg、0.5μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg的待测样品，以葡萄球菌为目标菌，按照实施例2的检测方法分别在培养时间30min、60min、90min、120min、150min、180min、210min、240min对以上待测样品和阴性样品进行活菌生长率测定。测定后，得到各待测样品在不同培养时间的活菌生长率见表1：
表1 各待测样品在不同培养时间的活菌生长率
Figure 971277DEST_PATH_IMAGE006
从表1可以得出，使用本发明的检测方法在培养240min时，添加红霉素0.1μg/kg的待测样品中葡萄球菌的活菌生长率为92%。0.1μg/kg的抗生素添加浓度很低，远远低于现有国标的检出限。在实际检测工作中，使用本发明的检测方法，不断延长培养时间，可以对抗生素残留低于0.1μg/kg的样品进行检出。但是考虑到批量检测时的检测效率，本发明的检测方法，以含有0.1μg/kg抗生素的待测样品培养240min的活菌生长率，作为标准生长率，以该标准生长率为判定标准，即以目标菌的活菌生长率小于等于92%，作为判定阳性的标准，以目标菌的活菌生长率大于92%作为判定阴性的标准。如果待测样品培养240min时目标菌的活菌生长率大于于92%，即可认为待测样品中抗生素残留量低于0.1μg/kg，对于这种待测样品中的抗生素残留可以忽略不计，认为其为阴性，未检出抗生素残留。
从表1可以得出，使用本发明的方法检测阴性样品，培养240min时阴性样品中葡萄球菌的活菌生长率为98%，仍高于标准生长率92%，阴性样品为灭菌水，其中抗生素残留量为0，进一步证明本发明的判定标准：以待测样品培养240min的活菌生长率小于等于标准生长率92%，判定为阳性，既保证判定的准确性，提高了检出限。
实施例8
本实施例以灭菌水作为阴性样品，向阴性样品中分别添加红霉素，制备得到红霉素浓度梯度为0.1μg/kg、0.5μg/kg、0.6μg/kg、1.0μg/kg、2.0μg/kg、3.0μg/kg、4.0μg/kg、5.0μg/kg、6.0μg/kg、7.0μg/kg的待测样品，以葡萄球菌为目标菌，按照实施例2的检测方法在培养时间30min对以上待测样品和阴性样品进行活菌生长率测定。测定后，得到各待测样品在培养30min时的活菌生长率见表2：
表2 各待测样品在培养30min时的活菌生长率
Figure 869963DEST_PATH_IMAGE007
从表2可知，本发明的检测方法在培养30min时，测定不同添加浓度的待测样品的活菌生长率，只有抗生素添加浓度为0.1μg/kg和0.5μg/kg的待测样品的活菌生长率大于标准生长率92%，其余添加浓度的待测样品的活菌生长率均小于标准生长率92%，所以，以培养30min的活菌生长率小于等于92%，作为第一次判定阳性的标准。如果待测样品中抗生素残留浓度小于0.6μg/kg，即待测样品培养30min的活菌生长率大于92%，则需要进行二次判定。第二次判定的标准，即待测样品培养240min的活菌生长率小于等于标准生长率92%，判定为阳性，待测样品中有抗生素残留。
本发明的检测方法通过第一次判定标准，将待测样品中抗生素残留的检测时间缩短到30min，可以对抗生素残留量较高的检测样品进行阳性判定。对于某些抗生素残留量较低的样品在第一次判定不是阳性后，继续培养进行第二次判定。既可以提高检测准确率，减少假阴性的错误检测结果，又能缩短检测时间，提高检测效率，减轻检测人员工作量，十分适合大批量样品快速检测。
实施例9
本实施例以灭菌水作为阴性样品，选择红霉素和克林霉素两种抗生素作为目标抗生素，分别添加到阴性样品中，制备得到抗生素浓度梯度为0.1μg/kg 、0.5μg/kg、1.0μg/kg的待测样品，以葡萄球菌作为验证菌，按照实施例2的检测方法分别在培养时间30min、60min、90min、120min、150min、180min对以上待测样品和阴性样品进行活菌生长率测定。活菌生长率测定结果见表3：
表3 红霉素和克林霉素不同添加浓度的活菌生长率测定
Figure 908326DEST_PATH_IMAGE008
根据表3可以得出，验证菌的活菌生长率随培养时间延长而呈现逐渐降低趋势，说明待测样品中即使只含有微量的抗生素，就会存在抑菌反应。在抑菌反应的影响下，在一定时间范围内，随着培养时间的增加，活菌生长率呈逐步降低的趋势。
根据表3可以得出，阴性样品中没有抗生素残留，不存在抑菌反应，加入的验证菌不会受到抑菌反应的影响，在一定时间范围内，随着培养时间的增加，阴性样品的活菌生长率没有出现逐步降低的趋势。而是呈现无规律的上升-下降-再上升的分布，这与待测样品中有抗生素残留的样品呈现的逐步降低趋势完全不同。
根据上述特征，利用验证菌的活菌生长率随培养时间延长而逐渐降低的趋势，作为抗生素残留检测的一种验证判定手段，对已经判定是阳性的待测样品，进行验证判定，避免假阳性，提高检测的准确度。
实施例10
本实施例选择以下常用抗生素作为目标抗生素进行检出限测定：β-内酰胺类抗生素中的阿莫西林、氨苄青霉素和苯唑西林、头孢菌素类抗生素中的头孢喹诺、大环内脂类抗生素中的替米考星、四环素类抗生素中的土霉素和四环素、氨基糖苷类抗生素中的新霉素、多肽类抗生素中的杆菌肽、磺胺类抗生素中的磺胺嘧啶、林可酰胺类抗生素的林可霉素和甲氧苄氨嘧啶。以灭菌水为阴性样品，向阴性样品中分别加入上述目标抗生素，制备得到含有梯度浓度1.0μg/kg、2.0μg/kg、3.0μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg、15.0μg/kg的目标抗生素的待测样品，以葡萄球菌为目标菌，按照实施例2的检测方法分别在培养时间240min对以上待测样品进行活菌生长率测定。
根据测定得到的活菌生长率，活菌生长率最接近92%的抗生素添加浓度即为该抗生素的检出限。可以直接得到各目标抗生素的检出限见表4：
表4 各目标抗生素的检出限
Figure 449029DEST_PATH_IMAGE009
由表4可知，本发明的检测方法的检出限远远低于欧盟允许的抗生素最大残留量，低于欧盟允许的抗生素最大残留量的二十分之一，也远远低于现有同类微生物法对抗生素的检出限。说明本发明的检测方法可以对以上各类抗生素进行残留量检测，通过选择相应的目标菌，一次检测可以做到抗生素全部覆盖，检测范围最全，并且检出限较高，保证检测结果准确度，避免漏检、错检。
本发明中使用的试剂盒用于微量检测，试剂盒内容物量较少，避免因氯化钠添加后分布不均而形成局部高盐，进而影响目标菌的生长和培养。试剂盒中没有添加氯化钠，使目标菌在不添加氯化钠的条件下，可以正常生长。本发明的检测方法对目标菌的选择无限制，筛查范围覆盖全部抗生素，检出限远远低于国标，操作简便，灵敏度高，准确率高，不需要大型的分析仪器。同时耗时少，分析成本低，对实验环境要求低，极大的降低了假阳性或假阴性的情况产生，适用于对食品及其生产、流通过程中抗生素残留进行大批量快速检测。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法，其特征在于，包括以下：
步骤a，样品前处理：
液体样品前处理：随机抽取待检测液体样品，取一定量的所述液体样品进行过滤并除菌，得到第一待测样液；
固体样品前处理：随机抽取待检测固体样品，取一定量的所述固体样品进行均质化处理，进行离心、过滤并除菌，得到第二待测样液；
步骤b，目标菌液制备：
根据所要求检测的抗生素种类，选择葡萄球菌作为目标菌并制备相应的目标菌液，所述目标菌液的初始活菌浓度为100-10000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：
取相同体积的灭菌水和第一待测样液或所述第二待测样液分别加入试剂盒中，振荡混匀，得到空白对照试剂盒和加样试剂盒，向所述加样试剂盒与所述空白对照试剂盒中分别加入相同且等量的所述目标菌液，在相同的培养条件下，培养30min后，分别测定所述加样试剂盒中葡萄球菌的活菌浓度，分别测定所述空白对照试剂盒中葡萄球菌的活菌浓度，得到葡萄球菌的样品活菌浓度与空白对照活菌浓度，根据以下公式计算得到葡萄球菌的第一次活菌生长率，所述公式为：
Figure 376355DEST_PATH_IMAGE001
所述试剂盒为无菌试剂盒，按照重量份数计由以下组分组成：泥鳅提取物40份、河蚌提取物40份、火龙果提取物0.5份和花椰菜提取物0.5份，各组分均为粉末状；
步骤d，判定标准：
以含0.01μg/kg红霉素的样品作为加标样品，以葡萄球菌为目标菌按照所述步骤a~c在相同培养条件下，进行培养，以培养240min时的活菌生长率作为标准生长率，计算得到所述标准生长率为92%，并以所述标准生长率作为判定标准；
步骤e，第一次判定：
当葡萄球菌的第一次活菌生长率之一小于等于所述标准生长率92%时，即可判定为阳性，即所对应的待测样品中有抗生素残留，当葡萄球菌的第一次活菌生长率均大于所述标准生长率时，则需要进行第二次判定；
步骤f，第二次判定：
第一次活菌生长率均大于所述标准生长率的加样试剂盒和空白试剂盒，在所述培养条件下继续培养到240min，分别测定所述加样试剂盒中葡萄球菌的活菌浓度，分别测定所述空白对照试剂盒中葡萄球菌的活菌浓度，并根据所述步骤c中的公式计算得到葡萄球菌的第二次活菌生长率，当葡萄球菌的第二次活菌生长率之一小于等于所述标准生长率时，即可判定为阳性，即所对应的待测样品中有抗生素残留，当葡萄球菌的第二次活菌生长率均大于所述标准生长率时，则可判定阴性，即所对应的待测样品中未检出抗生素残留；
所述待测样品第一次判定为阳性后，进行验证判定：在所述培养条件下继续培养，依次在培养60min、90 min、120 min、150 min、180 min时，选择葡萄球菌作为验证菌，分别测定所述加样试剂盒和所述空白对照试剂盒中葡萄球菌的活菌浓度，并根据所述步骤c中的公式计算得到加样试剂盒中葡萄球菌在各相应培养时间的活菌生长率，葡萄球菌的活菌生长率随培养时间延长而依次连续降低，则可判定为阳性，即所对应的待测样品中有抗生素残留。
2.根据权利要求1所述的一种检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的方法，其特征在于，所述待测样品第二次判定为阳性后，进行验证判定：重复所述步骤a~c，依次在培养30min、60min、90 min、120 min、150 min、180 min时，选择葡萄球菌作为验证菌，分别测定所述加样试剂盒和所述空白对照试剂盒中葡萄球菌的活菌浓度，并根据所述步骤c中的公式计算得到加样试剂盒中葡萄球菌在各相应培养时间的活菌生长率，葡萄球菌的活菌生长率随培养时间延长而依次连续降低，则可判定为阳性，即所对应的待测样品中有抗生素残留。
3.一种组合物在制备检测食品及其生产、流通过程中抗生素残留的试剂盒的用途，其中所述组合物按照重量份数计包括以下组分：泥鳅提取物40~60、河蚌提取物40~60、火龙果提取物0.5~3和花椰菜提取物0.5~3；
所述试剂盒为无菌试剂盒。
4.根据权利要求3所述的用途，所述泥鳅提取物、河蚌提取物、火龙果提取物和花椰菜提取物均为粉末状。
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