CN111830015A - 一种定量检测抗生素的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种定量检测抗生素的方法,包括以下步骤:将青霉素结合蛋白粗提蛋白上清的稀释液和合成肽的稀释液混匀得到青霉素结合蛋白羧肽酶水解肽链体系溶液;在青霉素结合蛋白羧肽酶水解肽链体系溶液中分别加入不同浓度的抗生素水溶液得到反应体系溶液,将反应体系溶液离心取上清液,在上清液中加入茚三酮显色剂,测定吸光度值,根据吸光度值建立所述抗生素的浓度梯度标准校正曲线;在青霉素结合蛋白羧肽酶水解肽链体系中加入待测液,离心后加入所述茚三酮显色剂,测定待测液的吸光度值,根据抗生素的浓度梯度标准校正曲线计算待测液中的抗生素浓度。
Description
技术领域
本申请涉及食品检测领域,具体的,涉及一种定量检测抗生素的方法。
背景技术
抗生素作为一种能抑制和杀灭细菌的药物,已被广泛用于医疗卫生、畜禽养殖、农业生产等行业,为社会的经济发展做出了很大的贡献。但是抗生素的使用会导致病原微生物产生耐药性,使得抗生素能杀死细菌的有效剂量不断增加,对人类健康造成潜在威胁。随着生活水平的不断提高,人们对食品安全的要求也在增高,在食品安全问题中,抗生素污染问题是比较突出的,现有检测抗生素的方法多为高效液相色谱法、气相色谱法以及质谱联用法,这些方法仪器成本较高,并不经济实用。因此如何快速、便捷、有效的检测水和食品中抗生素的含量成为亟待解决的问题。
发明内容
本公开的目的在于提供一种定量检测抗生素的方法,该方法可以实现对水或食品基质提取液中的抗生素的定量检测。
为了实现上述目的,本公开一方面提供了一种定量检测抗生素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、将青霉素结合蛋白粗提蛋白上清的稀释液和合成肽的稀释液混匀得到PBP羧肽酶水解肽链体系溶液;
S2、在所述青霉素结合蛋白羧肽酶水解肽链体系溶液中分别加入不同浓度的抗生素水溶液得到反应体系溶液,将所述反应体系溶液离心取上清液,在所述上清液中加入茚三酮显色剂,测定吸光度值,根据所述吸光度值建立所述抗生素的浓度梯度标准校正曲线;
S3、在所述青霉素结合蛋白羧肽酶水解肽链体系溶液中加入待测液,离心后取上清液加入所述茚三酮显色剂,测定所述待测液的吸光度值,根据所述抗生素的浓度梯度标准校正曲线计算所述待测液中的抗生素浓度。
可选地,所述抗生素为β-内酰胺类抗生素,所述茚三酮显色剂为茚三酮-苯酚显色剂。
可选地,步骤S1中,所述青霉素结合蛋白粗提蛋白上清的稀释液的制备方法包括:将青霉素结合蛋白超声破碎2-4min后;离心取上清液;6500-9500rpm离心3-7min,取上清液;所述合成肽的稀释液的制备方法包括:先用0.08-0.12M PBS缓冲液将合成肽稀释成0.8-1.2mg/mL的母液,将所述母液用蒸馏水稀释900-1100倍。
可选地,所述青霉素结合蛋白为为PBP1、PBP2或PBP3,优选为PBP3;所述合成肽为五聚D-Ala或D-Cys-D-Ala-D-Ala。
可选地,步骤S2和步骤S3中,所述离心的方法包括:离心转速为7500-8500rpm,离心时间为3-7min。
可选地,步骤S2中,所述抗生素的浓度梯度标准校正曲线的绘制方法包括:以吸光度值作为Y值,抗生素添加浓度作为X值,绘制直角坐标系。
另一方面,本公开提供了上述方法在水或食品基质提取液中对抗生素定量测量的应用。
可选地,所述抗生素为β-内酰胺类抗生素。
通过上述技术方案,本公开通过向青霉素结合蛋白羧肽酶水解肽链的体系内添加抗生素,由于羧肽酶受到抑制程度不同,因此催化肽链水解程度也不同,从而可以利用茚三酮试剂检测青霉素结合蛋白催化肽链水解下的游离氨基酸的数量,通过单位时间内生成蓝紫色物质的OD值来确定青霉素结合蛋白的羧肽酶活性,进而检测水或食品基质提取液中的β内酰胺类抗生素的含量。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1为青霉素标准溶液茚三酮显色结果。
图2为青霉素标准溶液Kaiser显色实验结果(波长为585nm)。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开,并不用于限制本公开。
本公开一方面提供了一种定量检测抗生素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、将青霉素结合蛋白粗提蛋白上清的稀释液和合成肽的稀释液混匀得到PBP羧肽酶水解肽链体系溶液;
S2、在所述青霉素结合蛋白羧肽酶水解肽链体系溶液中分别加入不同浓度的抗生素水溶液得到反应体系溶液,将所述反应体系溶液离心取上清液,在所述上清液中加入茚三酮显色剂,测定吸光度值,根据所述吸光度值建立所述抗生素的浓度梯度标准校正曲线;
S3、在所述青霉素结合蛋白羧肽酶水解肽链体系溶液中加入待测液,离心后取上清液加入所述茚三酮显色剂,测定所述待测液的吸光度值,根据所述抗生素的浓度梯度标准校正曲线计算所述待测液中的抗生素浓度。
本公开中,茚三酮是一种有机化合物,常用于鉴定一级胺或二级胺,特别是氨基酸。茚三酮反应是在加热条件及弱酸环境下,氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫蓝色(与天冬酰胺则形成棕色产物,与脯氨酸或羟脯氨酸反应生成亮黄色)化合物及相应的醛和二氧化碳的反应。青霉素结合蛋白(PBPs)是广泛存在于细菌表面的一种膜蛋白,是β-内酰胺类抗生素的主要作用靶位。青霉素结合蛋白可催化N端固定在树脂上的肽链五聚D-Ala或D-Cys-D-Ala-D-Ala水解下顶端的氨基酸Ala,生成的游离氨基酸Ala带有游离氨基(伯胺),因此可被茚三酮染成蓝紫色。单位时间内生成的游离氨基酸数量体现出青霉素结合蛋白羧肽酶的活性。而当青霉素结合蛋白与抗生素结合时,羧肽酶活性会受到显著抑制。
可选地,所述抗生素为β-内酰胺类抗生素,所述茚三酮显色剂为茚三酮-苯酚显色剂。
可选地,步骤S1中,所述青霉素结合蛋白粗提蛋白上清的稀释液的制备方法包括:将青霉素结合蛋白超声破碎2-4min后;离心取上清液;6500-9500rpm离心3-7min,取上清液;所述合成肽的稀释液的制备方法包括:先用0.08-0.12M PBS缓冲液将合成肽稀释成0.8-1.2mg/mL的母液,将所述母液用蒸馏水稀释900-1100倍。
可选地,所述青霉素结合蛋白为为PBP1、PBP2或PBP3,优选为PBP3;所述合成肽为五聚D-Ala或D-Cys-D-Ala-D-Ala。
可选地,步骤S2和步骤S3中,所述离心的方法包括:离心转速为7500-8500rpm,离心时间为3-7min。
可选地,步骤S2中,所述抗生素的浓度梯度标准校正曲线的绘制方法包括:以吸光度值作为Y值,抗生素添加浓度作为X值,绘制直角坐标系。
另一方面,本公开提供了上述方法在水或食品基质提取液中对抗生素定量测量的应用。
以下,通过实施例进一步详细说明本公开。其中,待测样品为在纯净的饮用水中加入青霉素标准液制得的青霉素浓度分别为2.0mM、4.0mM和6.0mM的饮用水。
实施例1
制备青霉素结合蛋白粗提蛋白上清:将青霉素结合蛋白超声破碎3min后;离心取上清液;8000rpm离心5min,取上清液。
先用0.1M PBS缓冲液将合成肽稀释成1mg/mL的母液,将所述母液用蒸馏水稀释1000倍。
制备PBP羧肽酶水解肽链体系:将青霉素结合蛋白粗提蛋白上清稀释5倍得到青霉素结合蛋白粗提蛋白上清的稀释液和合成肽的稀释液混匀。
绘制青霉素的浓度梯度标准校正曲线:将青霉素标准液加水稀释成浓度为0.15mM,0.75mM,1.5mM,3.0mM,4.5mM,6.0mM,7.5mM,9.0mM的8个浓度梯度的溶液,加入青霉素结合蛋白羧肽酶水解肽链体系溶液,得到反应体系溶液,将反应体系溶液在8000rpm离心5min,取上清液,于上清液中加入苯酚-茚三酮显色,利用酶标仪在吸收波长585nm下测OD值(如图1所示),然后以测得的吸光度值作为Y值,青霉素添加浓度作为X值,绘制青霉素的浓度梯度标准校正曲线(如图2所示)。
在青霉素结合蛋白羧肽酶水解肽链体系溶液中加入待测样品,8000rpm离心5min,取上清液,于上清液中加入苯酚-茚三酮显色。
测试例1
利用利用酶标仪在吸收波长585nm下检测实施例1中的待测样品的OD值,并根据实施例对应的青霉素的浓度梯度标准校正曲线分别计算实施例1中的待测样品的青霉素浓度,每个浓度重复三次,具体结果见表1。
表1
根据表1数据可以看出,利用本公开的方法可以检测水和食品基质提取液中中的抗生素含量,测量结果准确。
以上详细描述了本公开的优选实施方式,但是,本公开并不限于上述实施方式中的具体细节,在本公开的技术构思范围内,可以对本公开的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复,本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本公开的思想,其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (8)
1.一种定量检测抗生素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、将青霉素结合蛋白粗提蛋白上清的稀释液和合成肽的稀释液混匀得到青霉素结合蛋白羧肽酶水解肽链体系溶液;
S2、在所述青霉素结合蛋白羧肽酶水解肽链体系溶液中分别加入不同浓度的抗生素水溶液得到反应体系溶液,将所述反应体系溶液离心取上清液,在所述上清液中加入茚三酮显色剂,测定吸光度值,根据所述吸光度值建立所述抗生素的浓度梯度标准校正曲线;
S3、在所述青霉素结合蛋白羧肽酶水解肽链体系溶液中加入待测液,离心后取上清液加入所述茚三酮显色剂,测定所述待测液的吸光度值,根据所述抗生素的浓度梯度标准校正曲线计算所述待测液中的抗生素浓度。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述抗生素为β-内酰胺类抗生素,所述茚三酮显色剂为茚三酮-苯酚显色剂。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤S1中,所述青霉素结合蛋白粗提蛋白上清的制备方法包括:将青霉素结合蛋白超声破碎2-4min后;离心取上清液;6500-9500rpm离心3-7min,取上清液;
所述合成肽的稀释液的制备方法包括:先用0.08-0.12M PBS缓冲液将合成肽稀释成0.8-1.2mg/mL的母液,将所述母液用蒸馏水稀释900-1100倍。
4.根据权利要求1或3所述的方法,其中,所述青霉素结合蛋白为PBP1、PBP2或PBP3,优选为PBP3;所述合成肽为五聚D-Ala或D-Cys-D-Ala-D-Ala。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤S2和步骤S3中,所述离心的方法包括:离心转速为7500-8500rpm,离心时间3-7min。
6.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤S2中,所述抗生素的浓度梯度标准校正曲线的绘制方法包括:以吸光度值作为Y值,抗生素添加浓度作为X值,绘制直角坐标系。
7.权利要求1-6任意一项所述的方法在水或食品基质提取液中对抗生素定量测量的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其中,所述抗生素为β-内酰胺类抗生素。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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