CN101813698A - 一种牛奶中β-内酰胺类抗生素配体受体法检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛奶中β-内酰胺类抗生素配体受体法检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括以下组分：(1)包被了青霉素结合蛋白PBP 2x_a或PBP2x_b重组蛋白的酶标板；(2)酶标记物；(3)氨苄青霉素钠标准品溶液；(4)20倍浓缩清洗缓冲液；(5)酶标稀释液；(6)20倍浓缩样品提取液；(7)显色液；(8)反应终止液。本发明的试剂盒可同时筛查牛奶中8种β-内酰胺类抗生素残留，且检出限均低于我国及世界上主要发达国家的最低残留限量，检测时间50分钟以内，具有操作简便、快速、准确、成本低等特点，适宜大规模推广应用。

Description

一种牛奶中β-内酰胺类抗生素配体受体法检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属生化微量分析领域，具体涉及一种牛奶中β-内酰胺类抗生素配体受体法检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

随着人们食品安全观念的日益增强，牛乳中抗生素残留的问题越来越受到消费者的关注。牛乳中的残留主要是奶牛的饲料、奶牛的药物注射以及牛乳的保险添加剂中的抗生素残留引起的。兽医临床中应用的抗生素种类很多，其中以β-内酰胺类抗生素最为普遍，又以β-内酰胺类抗生素残留对人体的危害最大。

目前，控制牛乳中抗生素的使用量，制定快速检测牛乳中抗生素含量的标准方法，是保证牛乳质量安全的必要保证，是食品质量安全控制的主要要求，对于保证广大消费者身体健康具有十分重要的意义。

现有的抗生素残留的检测方法主要有以下几种：

1、微生物生长抑制法：是比较经典和应用较广泛的方法，如TTC法(氯化三苯基四氮唑法)、纸片法、牛津杯法、拭子法等。具有操作简便及低成本的优势，但存在检测周期长、特异性差、无法定量检测和易假阳性等缺点，因此无法完全满足残留检测的需要。

2、理化分析方法：主要包括高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)、气相色谱法(GC)、气相色谱质谱联用法(GC-MS)。基本原理是利用色谱柱将所要检测的化合物精确分离，再通过检测器定量测定其含量。该方法具有准确、可靠、检测极限低等优点，通常做为确证分析方法应用于食品抗生素残留检测领域，但缺点是样品预处理较复杂，并且需要昂贵的仪器和专业操作人员，检测时间长，且检测通量低，难以适应大规模样品的筛查。

3、免疫分析方法：目前应用的抗生素残留免疫分析技术主要分为两大类：一是以抗原抗体识别为核心反应的酶联免疫吸附法；二是以竞争性免疫层析为核心的胶体金试纸条分析法。该方法具有灵敏度较高、特异性强、处理量大等特点，但缺点是只能检测β-内酰胺类抗生素中的一种或少数几种，无法对β-内酰胺类抗生素的总量进行检测。

4、配体受体分析法：是继免疫分析法之后检测抗生素残留的有力工具。它的原理是配体受体之间的特异性识别反应，具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、不需要复杂仪器设备等特点，但缺点是目前市场上此类产品较少，且所能检测的β-内酰胺类抗生素的种类还不够多、检测限较国内外的相关残留限量标准均偏高，不能完全满足日常残留监控的需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种牛奶中β-内酰胺类抗生素配体受体法检测试剂盒及其检测方法。首先通过基因工程的方法制备两种对β-内酰胺类抗生素具有高灵敏度、高特异性的重组青霉素结合蛋白，然后通过配体受体特异性识别反应的基本原理，构建一种牛奶中β-内酰胺类抗生素残留快速检测试剂盒及其检测方法。本发明的试剂盒能同时检测8种β-内酰胺类抗生素，包括青霉素类和头孢类，其检出限均低于我国及世界上主要发达国家对牛奶中β-内酰胺类抗生素残留的最低限量标准，且检测时间短，操作简便，完全满足国家有关检验监督部门、牛奶企业、奶站对牛奶中β-内酰胺类抗生素残留的大规模筛查及定量验证。

本发明提供的检测试剂盒，包括以下组分：

(1)包被了青霉素结合蛋白PBP 2x_a或PBP 2x_b重组蛋白的酶标板；

(2)酶标记物；

(3)氨苄青霉素钠标准品溶液；

(4)20倍浓缩清洗缓冲液；

(5)酶标稀释液；

(6)20倍浓缩样品提取液；

(7)显色液；

(8)反应终止液。

所述青霉素结合蛋白PBP 2x_a或PBP 2x_b是根据肺炎链球菌Streptococcuspneumonia R6菌株青霉素结合蛋白PBP 2x的基因序列(基因序列号为GENBANK 18266817)，通过人工基因合成制备的两种不同氨基酸序列的重组青霉素结合蛋白。

其中，所述PBP 2x_a重组蛋白的人工合成基因序列为19～750aa，删去了1～19aa跨膜区基因序列；所述PBP 2x_b重组蛋白的人工合成基因序列为266～615aa，为PBP 2x与β-内酰胺类抗生素的结合功能区，删去了其他非结合功能区蛋白序列。

所述PBP 2x_a或PBP 2x_b重组蛋白在构建质粒时均加上谷胱甘肽转移酶GST标签，将质粒转入工程菌中诱导表达带GST标签的PBP 2x_a和PBP 2x_b重组蛋白，然后通过肠激酶将融合的GST标签切除。

通过肠激酶将融合的GST标签切除后，再通过亲和、离子交换、疏水及凝胶过滤，即获得高纯度青霉素结合蛋白PBP 2x_a或PBP 2x_b。

所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的氨苄青霉素结合物。

所述辣根过氧化物酶标记的氨苄青霉素结合物是将辣根过氧化物酶HRP和氨苄青霉素AMP通过碳二亚胺的方法偶联成结合物，其浓度为0.1μg/mL～1μg/mL。

所述氨苄青霉素钠标准品溶液包括6瓶，浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L。

所述20倍浓缩清洗缓冲液为含有1％(v/v)Tween-20的0.1moL/L的磷酸盐PBS溶液。

所述酶标稀释液是浓度为0.05moL/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液。

所述20倍浓缩样品提取液是pH 7.4、0.1moL/L的磷酸盐PBS缓冲液。

所述显色液包括底物液A和底物液B，其中底物液A为0.1‰～1‰H₂O₂溶液，底物液B为1mg/mL～5mg/mL的二甲基联苯胺TMB溶液。

所述反应终止液是含有0.15moL/L硫酸和0.1moL/L盐酸的混合溶液。

本发明的试剂盒，利用配体受体特异性识别反应的基本原理对β-内酰胺类抗生素残留进行检测，具体步骤如下：

首先对样品进行前处理，然后向包被了青霉素结合蛋白PBP 2x_a或PBP 2x_b重组蛋白的微量测试孔中加入苄青霉素钠标准溶液或样品溶液和酶标记物，竞争反应后用清洗缓冲液洗涤酶标板，再加入等体积混合的底物溶液A和B，显色，然后加入反应终止液终止反应，用酶标仪于450nm波长测定吸光度值，最后通过半对数法模拟标准曲线，计算样品中β-内酰胺类抗生素的浓度值。

本发明的试剂盒能同时检测8种β-内酰胺类抗生素，包括青霉素类和头孢类，其检出限均低于我国及世界上主要发达国家对牛奶中β-内酰胺类抗生素残留的最低限量标准，且检测时间短，检测通量大，操作简易，完全满足国家有关检验监督部门、牛奶企业、奶站对牛奶中β-内酰胺类抗生素残留的大规模筛查及定量验证。

本发明的试剂盒对8种主要的β-内酰胺类抗生素的检测限分别如下：青霉素、氨苄青霉素、头孢菌素≥1μg/kg、阿莫西林、邻氯青霉素≥3μg/kg，头孢唑啉≥7μg/kg，头孢哌酮≥5μg/kg，头孢噻呋≥10μg/kg，与其他常见抗生素交叉反应率均≤0.01％。检测时间均在50分钟以内，并且能同时检测多个样品，实现大通量检测。

附图说明

图1为本发明包被有重组青霉素结合蛋白PBP 2x_a或PBP 2x_b重组蛋白酶标板的结构示意图，其中a为酶标板的平面示意图，b为酶标板中小孔的放大图。

图2为pET-41a(+)PBP 2x_a质粒图谱。

图3为pET-41a(+)PBP 2x_b质粒图谱。

图4为本发明试剂盒的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

试验材料：

质粒pET41a，大肠杆菌菌株E.coli BL-21(DE3)购自美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)。

Yeast Extract，Tryptone购自英国Oxoid公司。

制性内切酶XhoI、BglII购自TaKaLa公司。

大肠杆菌DH5α、T4 DNA Ligase、DNA markers DL2000、2x Taq Mastermix、蛋白质分子量标准、肠激酶购自上海欣百诺生物科技有限公司。

异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)购自大连宝生生物技术有限公司。

PCR产物胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自爱思进生物技术有限公司(AXYGEN)。

其它常规试剂均购自Sigma-Aldrich公司或国药集团化学试剂有限公司。

溶液剂培养基配方：

10×磷酸盐母液：称取15g Na₂HPO₄，3g KH₂PO₄溶解在80ml水，定容至100ml，121℃灭菌20min。

LB培养基配方：称取蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，溶解于0.9L水中，用1moL/L的NaOH调整pH至7.0，再补足水至1L，121℃灭菌20min。

XY1培养基配方：称取葡萄糖5g，酵母提取物10g、蛋白胨15g、NaCl 1.5g，NH₄Cl 1g，MgCl₂0.8g溶于0.9L蒸馏水，115℃灭菌30min。。

试验仪器：

核酸电泳仪(EPS-100)                上海天能科技有限公司

台式离心机(5417C)                  德国Eppendorf公司

振荡培养箱(BS-1E)                  湘仪离心机仪器有限公司

PCR仪(5334)                        德国Eppendorf公司

紫外投射仪(UV-2000)                北京爱普华美生物科技有限公司

旋涡震荡(XW-80A)                   上海精科实业有限公司

酶标仪(680)                        美国伯乐公司(BIO-RAD)

紫外自动收集器(BSZ-100-LCD)        上海琪特分析仪器有限公司

实施例1

重组青霉素结合蛋白PBP 2x_a和PBP 2x_b的制备

1)基因合成

根据肺炎链球菌Streptococcus pneumonia R6菌株青霉素结合蛋白(PBP 2x)的基因序列(基因序列号：GENBANK 18266817)设计、合成两种人工基因片段：(1)PBP 2x_a的人工合成基因序列为19～750aa，删去了1～19aa跨膜区基因序列(具体参见序列表中的SEQ ID No 1)；(2)PBP 2x_b的人工合成基因序列为266～615aa，为PBP 2x与β-内酰胺类抗生素的结合功能区，删去了其他非结合功能区基因序列(具体参见序列表中的SEQ ID No 2)。为了方便与表达载体的连接以及获得具有与青霉素结合蛋白PBP 2x同样功能的重组蛋白，分别在两种基因片段的5’端添加了一个Bgl II酶切位点(下划线部分)和肠激酶酶切位点碱基，在3’端添加了一个Xho I酶切位点(下划线部分)，具体分别为结构为：

5’AGA TCTG GAC GAC GAC GAC AAG-PBP 2Xa-TGA CTC GAG T-3’，

5’AGA TCT G GAC GAC GAC GAC AAG-PBP 2X_b-TGA CTC GAG T-3’，

表达后可用肠激酶酶将融合的GST标签切除掉。

2)重组表达质粒pET41a-PBP 2x_a及pET41a-PBP 2x_b的构建

DNA的重组操作主要依据Sambrook手册进行。PBP 2x_a及PBP 2x_b基因片段用BglII和Xho I双酶切，同时用Bgl II和Xho I双酶切处理pET41a质粒，分别回收片段后连接转化到大肠杆菌DH5α中，筛选pET41a-PBP 2x_a和pET41a-PBP 2x_b转化子，测序鉴定正确的pET41a-PBP 2x_a和pET41a-PBP 2x_b。用T7ter和T7Promoter测序引物对转化子进行测序，确定GST标签和基因片段的正确。其中pET-41a(+)PBP 2x_a、pET-41a(+)PBP 2x_b质粒的图谱分别参加图2和图3。

3)表达工程菌的构建及诱导表达

抽提的pET41a-PBP 2x_a及pET41a-PBP 2x_b质粒溶于适量的TE溶液中(浓度约为1μg/μL)备用，将质粒转入大肠杆菌菌株E.coli BL-21(DE3)中。取单个菌落接种于5ml LB液体培养基(含卡那霉素50μg/ml)中，37℃200r/min震摇培养过夜，再取50μl新鲜培养过夜菌液，加入5ml含卡那霉素50μg/ml另一LB培养基中，37℃200r/min震摇培养3h至对数生长期，取1mL培养菌液作对照(未诱导)，剩余的培养基中加入异丙基-B-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM后，37℃200r/min震摇培养，分别于1、2、3和4h收集培养菌液各1mL于离心管中。

4)发酵及表达检测

取上步中筛选的阳性克隆菌株接种至100mL LB液体培养基(含卡那霉素50μg/mL)中，37℃200r/min震摇培养过夜，再取10mL新鲜培养过夜菌液，加入1L含卡那霉素50μg/mL的XY1培养基中，37℃200r/min震摇培养3h至对数生长期，加入IPTG至终浓度为0.5mM后，37℃200r/min震摇培养，3h后收集菌体。用500mL 20mM Tris-Cl(pH 8.0)重悬菌体，经超声波破碎，13000转/min离心15min，收取上清备用。分别取上清和沉淀，进行SDS-PAGE检测。

5)PBP 2x_a和PBP 2x_b重组蛋白GST标签的切除与纯化

收集经SDS-PAGE检测确证有带GST标签的PBP 2x_a和PBP 2x_b重组蛋白的破菌上清，过GST亲和柱层析，用还原型谷胱甘肽溶液洗脱，收集洗脱液，然后将GST洗脱样品透析到酶切体系中，加入EK酶37℃酶切1h，切除GST标签蛋白片段，再用GST亲和柱纯化，收集流出液(目标蛋白不挂柱)，最后通过离子交换、疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化PBP 2x_a和PBP 2x_b重组蛋白。

实施例2

试剂盒关键组分的制备

1)酶标板的制备

图1为本发明的酶标板的结构示意图。其中a为酶标板的平面示意图，是一个96孔面板。用浓度为0.05mol/L，pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)将青霉素结合蛋白PBP 2x_a或PBP 2x_b稀释到0.05-0.5μg/mL，加入酶标板孔中(见图1b)，每孔150μL，37℃温育2h后4℃静置过夜。倾去包被缓冲液后用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后每孔加入200μL 10％的小牛血清封闭液，37℃温育1.5h，倾去封闭液，拍干后用真空抽干机4℃抽干4h，最后用铝箔膜真空密封包装，2-8℃干燥保存。

2)酶标记物的制备

取9mg氨苄青霉素溶于1mL PBS(0.05M，pH8.5)中，加入8mg辣根过氧化物酶(HRP)，5mg水溶性碳二亚胺(EDPC)，室温下磁力搅拌反应24h，然后过Sephadex G-25凝胶柱纯化，收集所得酶标记物，100μL/管分装置于-20℃保存。

实施例3

试剂盒的组成

(1)包被了青霉素结合蛋白PBP 2x_a或PBP 2x_b重组蛋白的酶标板；

(2)酶标记物，即辣根过氧化物酶标记的氨苄青霉素结合物，浓度为0.1μg/mL～1μg/mL；

(3)氨苄青霉素钠标准品溶液，共6瓶，浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L；

(4)20倍浓缩清洗缓冲液，即含有1％(v/v)Tween-20的0.1moL/L的PBS溶液；

(5)酶标稀释液，即浓度为0.05mol/L、pH为7.4的PBS溶液；

(6)20倍浓缩样品提取液，即pH为7.4、0.1moL/L的PBS缓冲液溶液；

(7)显色液，包括底物液A和底物液B，其中底物液A为0.1‰～1‰H₂O₂溶液，底物液B为1mg/mL～5mg/mL的二甲基联苯胺(TMB)溶液；

(8)反应终止液，即0.15moL/L硫酸和0.1moL/L盐酸的混合溶液。

实施例4

牛奶中β-内酰胺类抗生素的检测方法

1)样品前处理

取2mL鲜牛奶于5mL离心管，加入50μL 0.36M亚硝基铁氰化钠，振荡90s后加入50μL 1M硫酸锌，振荡1min，10℃4000rpm离心10min，取50μL中间层按1∶19(v/v)稀释后取100μL进行上板检测分析。

2)试剂盒操作步骤

①于适当微孔中分别加入100μL氨苄青霉素钠标准品溶液(0，0.1，0.3，0.9，2.7和8.1μg/kg)。

②在另外的微孔中加入100μL已完成前处理的样品溶液。

③再于每一微孔中另再加入50μL已完全回溶的酶标记物。

④轻敲酶标板四周，使其充分混合后于室温下避光静置温育30分钟。

⑤将微孔中的反应液甩掉，再将浓缩清洗缓冲液加满每一微孔后甩掉，重复洗3次。

⑥最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。

⑦将底物液A和B液等体积混合，于每一微孔中加入混合好的底物液A、B溶液100μL后，轻敲酶标板四周，使其充分混合。

⑧于室温下避光静置温育15分钟。

⑨于每一微孔中加入50μL反应终止液。

⑩用酶标仪于波长450nm下判读。

3)结果分析

①计算B/B₀值，用氨苄青霉素钠标准品溶液或样品吸光度值(B)除以零标准吸光度值(B₀)再乘以100％。

②以B/B₀值为纵坐标，以氨苄青霉素钠标准品浓度的对数值为横坐标，做标准半对数曲线，图4为本发明试剂盒的标准曲线。

③根据每个样品的B/B₀值就可从曲线上读出相对应样品的浓度。

实验表明：本发明的试剂盒对几种主要的β-内酰胺类抗生素的检测限分别如下：青霉素、氨苄青霉素、头孢菌素≥1μg/kg、阿莫西林、邻氯青霉素≥3μg/kg，头孢唑啉≥7μg/kg，头孢哌酮≥5μg/kg，头孢噻呋≥10μg/kg，与其他常见抗生素交叉反应率均≤0.01％。检测时间50分钟以内，并且能同时检测多个样品，实现大通量检测。

实施例5

试剂盒准确性测试

1、向鲜牛奶中添加氨苄青霉素钠标准品溶液，使其浓度分别达到0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL，通过实施例4的样品前处理方式处理样品。

2、通过实施例4的检测方法对不同浓度的鲜牛奶样品进行检测，并通过标准曲线计算样品中氨苄青霉素钠的浓度。

3、重复以上实验10次。

实验结果如下表1所示。

表1

实验结果表明：在0.1～8.1ng/mL的线性范围区间内，样品添加回收率除了低浓度0ng/mL、0.1ng/mL以及高浓度10ng/mL超出了120％外，中间浓度均在80％～120％以内，达到了《农业部文件》农医发[2005]17号附件2试剂盒备案参考评判标准中第4点准确度的要求。

实施例6

试剂盒交叉反应率实验

1)向鲜牛奶中添加青霉素、头孢菌素、阿莫西林、邻氯青霉素、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢噻呋以及链霉素、氯霉素、四环素标准品溶液，使其浓度分别达到5ng/ml，通过实施例4的样品前处理方式处理样品。

2)通过实施例4的检测方法对添加不同药物的鲜牛奶样品进行检测，并通过标准曲线计算样品中各药物的浓度。

3)重复以上实验10次。

实验结果如下表2所示。

表2

标准品及交叉  反应药物浓度	十次平均OD值	添加浓度   (ng/mL)	实测浓度   (ng/mL)	交叉反应率％
					0	2.139	0	0	-
0.1ng/mL	1.745	0.1	0.1	-
					0.3ng/mL	1.357	0.3	0.3	-
0.9ng/mL	0.961	0.9	0.9	-
					2.7ng/mL	0.655	2.7	2.7	-
8.1ng/mL	0.327	8.1	8.1	-
					+5ng青霉素	0.451	5	5.07	≈101％
+5ng头孢菌素	0.438	5	5.30	≈106％
					+5ng阿莫西林	0.495	5	4.44	≈88％
+5ng邻氯青霉素	0.503	5	4.33	≈86.6％
					+5ng头孢唑啉	0.581	5	3.40	≈68％
+5ng头孢哌酮	0.564	5	3.58	≈71.6％
					+5ng头孢噻呋	0.685	5	2.46	≈49.2％
+5ng链霉素	2.135	5	＜0.01	＜0.01％
					+5ng氯霉素	2.131	5	＜0.01	＜0.01％
+5ng四环素	2.137	5	＜0.01	＜0.01％

由实验结果可以看出：试剂盒对8种β-内酰胺类抗生素均有较高的交叉反应率，因此可以对牛奶中β-内酰胺类抗生素总量进行筛查。同时，与其他常见抗生素如四环素、链霉素、氯霉素等无交叉反应率，保证了检测结果的准确性。

实施例7

试剂盒保质期测试

1)2-8℃正常保存

将本发明的试剂盒放置于2-8℃干燥环境中，在一年内不同月份检测，测试所得标准点OD数值、标准曲线形态、样品浓度、添加回收率均无显著性变化。体现了该试剂盒在正确保存条件下，实验数据良好的再现性。

2)室温放置实验

结果显示本发明的试剂盒在室温(25-28℃)放置2个月内实验OD值及IC₅₀均无显著性变化。

3)反复冻融破坏实验

对本发明的试剂盒进行冻融实验，将试剂盒各组份置-18℃三天，解冻后测定各标准浓度的OD值(10次平均值)，结果显示该试剂盒各组分经冻融后OD值及IC₅₀无显著性变化。

4)37℃加速破坏实验

对本发明的试剂盒进行加速试验，37℃放置，分别于1天、2天、3天、4天、5天、6天、9天、12天16天、20天后测定各标准浓度的OD值(10次重复的平均值)结果显示该试剂盒组分经37摄氏度后OD值及IC₅₀无显著性变化。

序列表    

<110>上海优你生物科技股份有限公司

 

<120>牛奶中β-内酰胺类抗生素配体受体法检测试剂盒及其检测方法

 

<160>2

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>SEQ ID No 1

<211>2163

<212>DNA

<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)

 

ATGAAATGGACCAAACGTGTTATCCGTTACGCTACCAAAAACCGTAAATCCCCGGGTACCGGTACCCG

TTTCGGTACCGACCTGGCTAAAGAAGCTAAAAAAGTTCACCAGACCACCCGTACCGTTCCGGCTAAA

CGTGGTACCATCTACGACCGTAACGGTGTTCCGATCGCTGAAGACGCTACCTCCTACAACGTTTACGC

TGTTATCGACGAAAACTACAAATCCGCTACCGGTAAAATCCTGTACGTTGAAAAAACCCAGTTCAACA

AAGTTGCTGAAGTTTTCCACAAATACCTGGACATGGAAGAATCCTACGTTCGTGAACAGCTGTCCCAG

CCGAACCTGAAACAGGTTTCCTTCGGTGCTAAAGGTAACGGTATCACCTACGCTAACATGATGTCCAT

CAAAAAAGAACTGGAAGCTGCTGAAGTTAAAGGTATCGACTTCACCACCTCCCCGAACCGTTCCTAC

CCGAACGGTCAGTTCGCTTCCTCCTTCATCGGTCTGGCTCAGCTGCACGAAAACGAAGACGGTTCCA

AATCCCTGCTGGGTACCTCCGGTATGGAATCCTCCCTGAACTCCATCCTGGCTGGTACCGACGGTATCA

TCACCTACGAAAAAGACCGTCTGGGTAACATCGTTCCGGGTACCGAACAGGTTTCCCAGCGTACCAT

GGACGGTAAAGACGTTTACACCACCATCTCCTCCCCGCTGCAGTCCTTCATGGAAACCCAGATGGAC

GCTTTCCAGGAAAAAGTTAAAGGTAAATACATGACCGCTACCCTGGTTTCCGCTAAAACCGGTGAAAT

CCTGGCTACCACCCAGCGTCCGACCTTCGACGCTGACACCAAAGAAGGTATCACCGAAGACTTCGTT

TGGCGTGACATCCTGTACCAGTCCAACTACGAACCGGGTTCCACCATGAAAGTTATGATGCTGGCTGC

TGCTATCGACAACAACACCTTCCCGGGTGGTGAAGTTTTCAACTCCTCCGAACTGAAAATCGCTGAC

GCTACCATCCGTGACTGGGACGTTAACGAAGGTCTGACCGGTGGTCGTACCATGACCTTCTCCCAGGG

TTTCGCTCACTCCTCCAACGTTGGTATGACCCTGCTGGAACAGAAAATGGGTGACGCTACCTGGCTGG

ACTACCTGAACCGTTTCAAATTCGGTGTTCCGACCCGTTTCGGTCTGACCGACGAATACGCTGGTCAG

CTGCCGGCTGACAACATCGTTAACATCGCTCAGTCCTCCTTCGGTCAGGGTATCTCCGTTACCCAGAC

CCAGATGATCCGTGCTTTCACCGCTATCGCTAACGACGGTGTTATGCTGGAACCGAAATTCATCTCCGC

TATCTACGACCCGAACGACCAGACCGCTCGTAAATCCCAGAAAGAAATCGTTGGTAACCCGGTTTCCA

AAGACGCTGCTTCCCTGACCCGTACCAACATGGTTCTGGTTGGTACCGACCCGGTTTACGGTACCATG

TACAACCACTCCACCGGTAAACCGACCGTTACCGTTCCGGGTCAGAACGTTGCTCTGAAATCCGGTAC

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GTTCTGATCCTGTCCGACAAAGCTGAAGAAGTTCCGGACATGTACGGTTGGACCAAAGAAACCGCTG

AAACCCTGGCTAAATGGCTGAACATCGAACTGGAATTCCAGGGTTCCGGTTCCACCGTTCAGAAACA

GGACGTTCGTGCTAACACCGCTATCAAAGACATCAAAAAAATCACCCTGACCCTGGGTGACTAG

 

<210>SEQ ID No 2

<211>1050

<212>DNA

<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)

 

TCCTCCCCGCTGCAGTCCTTCATGGAAACCCAGATGGACGCTTTCCAGGAAAAAGTTAAAGGTAAATA

CATGACCGCTACCCTGGTTTCCGCTAAAACCGGTGAAATCCTGGCTACCACCCAGCGTCCGACCTTCG

ACGCTGACACCAAAGAAGGTATCACCGAAGACTTCGTTTGGCGTGACATCCTGTACCAGTCCAACTA

CGAACCGGGTTCCACCATGAAAGTTATGATGCTGGCTGCTGCTATCGACAACAACACCTTCCCGGGTG

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CCCTGCTGGAACAGAAAATGGGTGACGCTACCTGGCTGGACTACCTGAACCGTTTCAAATTCGGTGT

TCCGACCCGTTTCGGTCTGACCGACGAATACGCTGGTCAGCTGCCGGCTGACAACATCGTTAACATCG

CTCAGTCCTCCTTCGGTCAGGGTATCTCCGTTACCCAGACCCAGATGATCCGTGCTTTCACCGCTATCG

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CGTAAATCCCAGAAAGAAATCGTTGGTAACCCGGTTTCCAAAGACGCTGCTTCCCTGACCCGTACCA

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GTTACCGTTCCGGGTCAGAACGTTGCTCTGAAATCCGGTACCGCTCAGATCGCTGACGAAAAAAACG

GTGGTTACCTGGTTGGTCTGACCGACTACATCTTCTCCGCTGTTTCCATGTCCCCGGCTGAAAACCCG

GACTTCATCCTGTACGTTACCGTTCAGCAGCCGGAACACTACTCCGGTATCCAGCTGGGTGAATTCGC

TAACCCGATCCTGGAACGTGCTTCCGCTATGAAA

Claims (14)

1.一种牛奶中β-内酰胺类抗生素配体受体法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：

(1)包被了青霉素结合蛋白PBP 2x_a或PBP 2x_b重组蛋白的酶标板；

(2)酶标记物；

(3)氨苄青霉素钠标准品溶液；

(4)20倍浓缩清洗缓冲液；

(5)酶标稀释液；

(6)20倍浓缩样品提取液；

(7)显色液；

(8)反应终止液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述青霉素结合蛋白PBP 2x_a或PBP 2x_b是根据肺炎链球菌Streptococcus pneumonia R6菌株青霉素结合蛋白PBP 2x的基因序列，通过人工基因合成的两种不同氨基酸序列的重组青霉素结合蛋白。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PBP 2x_a重组蛋白的人工合成基因序列为19～750aa，删去了1～19aa跨膜区基因序列；所述PBP 2x_b重组蛋白的人工合成基因序列为266～615aa，为PBP 2x与β-内酰胺类抗生素的结合功能区序列，删去了其他非结合功能区蛋白序列。

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述PBP 2x_a或PBP 2x_b重组蛋白在构建质粒时均加上谷胱甘肽转移酶GST标签，将质粒转入工程菌中诱导表达带GST标签的PBP 2x_a和PBP 2x_b重组蛋白，然后通过肠激酶将融合的GST标签切除。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，通过肠激酶将融合的GST标签切除后，再通过亲和、离子交换、疏水及凝胶过滤，即获得高纯度青霉素结合蛋白PBP 2x_a或PBP 2x_b重组蛋白。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的氨苄青霉素结合物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记的氨苄青霉素结合物是将辣根过氧化物酶HRP和氨苄青霉素AMP通过碳二亚胺的方法偶联成结合物，其浓度为0.1μg/mL～1μg/mL。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氨苄青霉素钠标准品溶液包括6瓶，浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述20倍浓缩清洗缓冲液为含有1％(v/v)Tween-20的0.1moL/L的磷酸盐PBS缓冲溶液。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标稀释液为浓度为0.05moL/L、pH为7.4的磷酸盐PBS缓冲溶液。

11.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩样品提取液是pH为7.4、0.1moL/L的磷酸盐PBS缓冲液。

12.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液包括底物液A和底物液B，其中底物液A为0.1‰～1‰H₂O₂溶液，底物液B为1mg/mL～5mg/mL的二甲基联苯胺TMB溶液。

13.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应终止液是含有0.15moL/L硫酸和0.1moL/L盐酸的混合溶液。

14.权利要求1所述试剂盒的检测方法，其特征在于，利用配体受体特异性识别反应原理对抗生素残留进行检测，具备步骤如下：

首先对样品进行前处理，然后向包被了青霉素结合蛋白PBP 2x_a或PBP 2x_b重组蛋白的微量测试孔中加入苄青霉素钠标准溶液或样品溶液和酶标记物，竞争反应后用清洗缓冲液洗涤酶标板，再加入等体积混合的底物溶液A和B，显色，然后加入反应终止液终止反应，用酶标仪于450nm波长测定吸光度值，最后通过半对数法模拟标准曲线，计算样品中β-内酰胺类抗生素的浓度值。

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