CN103344769A - 一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品检测领域，具体涉及定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的试剂盒。本发明公开了一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含包被有青霉素结合蛋白的酶标板、标记物偶联β-内酰胺类抗生素、底物对照1为β-内酰胺类抗生素浓度为0ppb的脱脂奶粉冻干品、底物对照2为含标定浓度β-内酰胺类抗生素的脱脂奶粉冻干品、β-内酰胺类抗生素标准品。本发明所述试剂盒具有良好的特异性和灵敏性，可检出大约0.5U/ml浓度的β-内酰胺酶，线性检出范围为1U/ml～16U/ml；试剂盒批内CV%<10%，批间CV%<20%，体现了良好的精密度；检测步骤简洁、耗时短、费用低廉；本发明所述的试剂盒既能精确定量又能快速、高通量地检测出β-内酰胺酶残留量，满足了企业和检测机构的需求。

Description

一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的试剂盒

技术领域

本发明属于食品检测领域，具体涉及定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的试剂盒。

背景技术

β-内酰胺酶是一种近年来才开始引起大家关注的食品添加剂，主要添加在牛奶中以生产无抗奶（指用不含抗生素的原料生产出来的牛奶）。β-内酰胺酶作为牛奶中抗生素分解剂（解抗剂），最初是科研人员作为一项科研成果推出的。这种做法可有效分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素。但是应用β-内酰胺酶分解牛奶中抗生素的风险在于：（1）人体大量摄入β-内酰胺酶可能会导致人体产生细菌耐药性，因此行政主管部门已经明令禁止在生鲜乳中添加；（2）在分解β-内酰胺药物后，可能引进其他有害物质（青霉素噻唑酸等）；（3）解抗剂的添加纵容了奶牛饲养过程中抗生素的滥用。

正因为如此，卫生部于2009年2月正式公布了《食品中可能违法添加的非食用物质名单（第二批）》，其中明确认定β－内酰胺酶是属于违法添加的非食用物质，其作用就是掩蔽抗生素。

虽然卫生部已经明文规定β-内酰胺酶属于不安全食品添加剂，但是，由于细菌耐药产生的内源性β-内酰胺酶有300多种，且内源性、外源性β-内酰胺酶的区别鉴定检测技术尚未见报道。而目前各检测机构正在研究的生鲜牛乳中β-内酰胺酶的检测方法无论是仪器分析、色谱法、配体-受体法还是微生物法，都存在一个不确定因素，即：测出的β-内酰胺酶无法判定是人为添加（外源性）的或是耐药细菌产生（内源性）的。也就是说，乳制品中检出的β-内酰胺酶有可能是非法添加的，也有可能是细菌产生的。在尚未制定β-内酰胺酶残留限量标准的前提下，获得完整的定量检测数据将是监督部门制定限量标准的重要依据。因此β-内酰胺酶定量检测方法的研究应运而生。

生鲜牛乳中的β-内酰胺酶残留检测从方法学上可以分为以下两种：1）通过测定未分解的酶促反应底物（青霉素）的含量来间接推算体系中β-内酰胺酶的浓度。该方法以生物测定法（杯碟法）及配体-受体检测法为代表，其特点是原理明确、特异性强。2）通过测定底物青霉素分解产物的方法，青霉素经过β-内酰胺酶的分解之后生成稳定的中间产物—青霉噻唑酸，通过测定体系中青霉噻唑酸的含量将能够计算出β-内酰胺酶的含量。该方法以碘量法、产色头孢菌素法为代表。

但是，上述两类检测方法都存在一定的缺陷。无论上述哪一种方法都还不能做到定量化，而测定未分解的酶促反应底物的方法又存在时间长、成本高的缺陷。同时，β-内酰胺酶作为一类小分子的蛋白（29kDa～39kDa）混在大量的蛋白、氨基酸乳浊液（牛奶）中，如果缺乏有效的检测手段则很难将其特异性分离。因此，找到一种既能精确定量又能快速、高通量地检测出β-内酰胺酶残留的方法势在必行。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种定量检测生鲜牛乳中β-内酰胺酶残留的试剂盒，能快速、高通量地检测出β-内酰胺酶残留量。

为此，本发明公开了一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含包被有青霉素结合蛋白的酶标板、标记物偶联β-内酰胺类抗生素、底物对照1为β-内酰胺类抗生素浓度为0ppb的脱脂奶粉冻干品、底物对照2为含标定浓度β-内酰胺类抗生素的脱脂奶粉冻干品、β-内酰胺类抗生素标准品。

本发明的定量检测生鲜牛乳中β-内酰胺酶残留试剂盒，利用β-内酰胺酶可分解牛奶样品中β-内酰胺类抗生素的原理，通过测定与β-内酰胺酶反应后剩余的β-内酰胺类抗生素的含量来检测牛奶中残留的β-内酰胺酶。

在一些实施例中，所述青霉素结合蛋白为重组青霉素结合蛋白PBP2x或PBP3；

在一些实施例中，所述标记物为本领域所常见的检测标记物，包括但不限于酶、核素、量子点、荧光素、胶体金或荧光微球中之一；

在一些实施例中，所述酶为辣根过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或6-磷酸葡糖脱氢酶中之一。

在一些实施例中，所述核素为³H、¹⁸⁸Re或¹³¹I中之一。

在一些实施例中，所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或3价镧系螯合物中之一。

在一些实施例中，所述荧光微球为时间分辨荧光微球，其制备参考中国专利ZL03819391.4。

在一些实施例中，所述β-内酰胺类抗生素为青霉素类抗生素、头孢类抗生素、或碳青霉烯类抗生素，其中优选为阿莫西林或氨苄西林。

本发明所述试剂盒具有良好的特异性和灵敏性，可检出大约0.5U/ml浓度的β-内酰胺酶，线性检出范围为1U/ml～16U/ml；试剂盒批内CV%<10%，批间CV%<20%，与现行的杯碟法、碘量法-比色法相比，检出限由原来的4U/ml降低为0.5U/ml，显著的提高了方法的灵敏度；有更好的精密度；检测步骤简洁、耗时短、费用低廉；本发明所述的试剂盒既能精确定量又能快速、高通量地检测出β-内酰胺酶残留量，满足了企业和检测机构的需求。

附图说明

图1为本发明包被有重组青霉素结合蛋白PBP2x或PBP3重组蛋白酶标板的结构示意图，其中a为酶标板的平面示意图，b为酶标板中小孔的放大图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明的试剂和材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂；实验用水应符合GB/T6682中三级水要求或相当纯度的水。重组青霉素结合蛋白PBP2x或PBP3为市售产品或参考现有技术制备，如李铁柱;青霉素结合蛋白克隆表达及在牛乳青霉素残留检测中的应用[D];吉林大学;2008年。

实施例1

试剂盒关键组分的制备

1）酶标板的制备

图1为本发明的酶标板的结构示意图。其中a为酶标板的平面示意图，是一个96孔面板。用浓度为0.05mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液（CBS）将青霉素结合蛋白PBP2x或PBP3稀释到0.05-0.5μg/mL，加入酶标板孔中（见图1b），每孔150μL，37℃温育2h后4℃静置过夜。倾去包被缓冲液后用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后每孔加入200μL10%的小牛血清封闭液，37℃温育1.5h，倾去封闭液，拍干后用真空抽干机4℃抽干4h，最后用铝箔膜真空密封包装，2-8℃干燥保存。

2）酶标记物的制备

取9mg氨苄青霉素溶于1mL PBS（0.05M，pH8.5）中，加入8mg辣根过氧化物酶（HRP），5mg水溶性碳二亚胺（EDPC），室温下磁力搅拌反应24h，然后过Sephadex G-25凝胶柱纯化，收集所得酶标记物，100μL/管分装置于-20℃保存。

实施例2

试剂盒的组成

（1）包被了青霉素结合蛋白PBP2x或PBP2x重组蛋白的酶标板；

（2）酶标记物，即辣根过氧化物酶标记的氨苄青霉素结合物，浓度为0.1μg/mL～1μg/mL；

（3）底物对照1和底物对照2，每种各6瓶，分别为含有0ppb青霉素的12%脱脂牛奶冻干品和含有20ppb青霉素的12%脱脂牛奶冻干品；

（4）20倍浓缩清洗缓冲液，即含有1%（v/v）Tween-20的0.1moL/L的PBS溶液；

（5）酶标稀释液，即浓度为0.05mol/L、pH为7.4的PBS溶液；

（6）显色液，包括底物液A和底物液B，其中底物液A为0.1‰～1‰H₂O₂溶液，底物液B为1mg/mL～5mg/mL的二甲基联苯胺（TMB）溶液；

（7）反应终止液，即0.15moL/L硫酸和0.1moL/L盐酸的混合溶液。

本发明的具体测定步骤如下：

1）待测样品底物的添加：取20uL1000ng/mL的青霉素标准品溶液，加入1mL待测奶样中，震荡混匀1min即可；

2）温育反应：将底物对照1、底物对照2和已添加底物的待测样品同时放入43℃（±1℃）恒温箱中避光温育30min；

3）上板检测：

①于微孔中，加入100uL经过温育的底物对照1和底物对照2，于其它微孔中加入100uL经过温育的待测样品，然后每孔再加入50uL已配制好的工作酶标记物；

②轻轻侧敲板架30s，放入43℃（±1℃）恒温箱中避光温育30min；

③温育结束后，倾倒微孔内液体，加入清洗缓冲液350uL/孔，第一次洗板迅速倾倒孔中清洗缓冲液，第二次和第三次洗板静置30s后倾倒清洗缓冲液，每次用拍板纸排干；

④洗板三次后每孔加入已配制好的显色液100uL（显色液配制方法见溶液配制6）；

⑤放入43℃（±1℃）恒温箱中避光温育15min；

⑥加入终止液50uL/孔，用酶标仪于450nm处读数；

4）进行定量计算。

实施例3

β-内酰胺酶参照物质活力的测定

本发明标定β-内酰胺酶活力浓度的方法是参考《中国药典》（2005版二部）定义的β-内酰胺酶活力测定方法：37℃、60分钟内β-内酰胺酶转化底物（青霉素）成为青霉噻唑酸，青霉噻唑酸竞争与淀粉竞争结合I₂。淀粉作为专属指示剂；硫代硫酸钠溶液为标准溶液；精确测定β-内酰胺酶的活性浓度。

本发明采用上述测定方法标定了β-内酰胺酶的校准品、标准品、质控品。

实施例4

方法学验证

1）检测限和定量限

①最小检测限

β-内酰胺酶含量为0U/ml的标准溶液的20次测定OD值如下表1所示。

表1

2.190	2.191	2.181	2.165	2.154	2.164	2.135	2.221	2.193	2.143
										2.143	2.156	2.134	2.169	2.200	2.165	2.161	2.195	2.176	2.164

平均值 $\stackrel{\&OverBar;}{X}=\frac{\mathrm{\&Sigma;}{X}_i}{n}(i=1~n)$

换算成β-内酰胺酶含量平均值

标准差 $\mathrm{SD}=\sqrt{\frac{\mathrm{n\&Sigma;}{x_i}^2-{\left(\mathrm{\&Sigma;}{x}_i\right)}^2}{n(n-1)}}$

灵敏度 $\mathrm{LOD}=\stackrel{\&OverBar;}{X}+3\mathrm{SD}$

 SD=0.02327 LOD=2.136

代入曲线计算得：灵敏度=0.023U/ml

②定量线性范围

以20U/ml、16U/ml、8U/ml、4U/ml、2U/ml、1U/ml、0.5U/ml、0U/ml的标准溶液添加至经检测为空白的生鲜牛乳样品中，恢复至室温，充分混匀后备用，测定6次进行验证，结果如下表2所示。

表2

实验结果表明：在1～16U/mL的线性范围区间内，样品添加回收率除了低浓度0.5U/mL以及高浓度32U/mL超出了120%外，中间浓度均在80%～120%以内，达到了《农业部文件》农医发[2005]17号附件2试剂盒备案参考评判标准中第4点准确度的要求。

③精密度和准确度

分别用三个批次的，进行相同质控样品的检测。

其中质控样品1为1U/ml，质控样品2为4U/ml，质控样品3为10Uml，每份样品做3次重复。

0	2.346	0
					5	1.407	5	3.6	-
样品1	2.132	1.14	5.6	114.0%
					样品2	1.569	4.14	7.0	103.4%
样品3	0.478	9.95	3.3	99.5%

三次试验结果的统计学分析如下，计算结果如表3所示。

统计学中用变异系数（CV%）来反映试验数据波动误差

变异系数（CV%）=标准差（s）/平均数

其中

$S=\sqrt{\frac{\mathrm{n\&Sigma;}{x_i}^2-{\left(\mathrm{\&Sigma;}{x}_i\right)}^2}{n-(n-1)}}$

表3

标准U/ml	CV1%	CV2%	CV3%	批间CV%
					0	-	-	-	-
5	3.1	4.7	3.6	7.7
					样品1	2.3	3.5	5.6	14.2
样品2	5.6	1.8	7.0	13.7
					样品3	1.7	4.5	3.3	13.7

结果显示本试剂盒批内CV%<10%，批间CV%<20%，体现了良好的精密度。

④与现行的杯碟法、碘量法-比色法比较

分别用三个批次的，进行相同质控样品的不同方法检测。

其中质控样品1为1U/ml，质控样品2为4U/ml，质控样品3为10Uml，每份样品做3次重复。

三次试验结果的统计学分析如下，计算结果如表4所示。

统计学中用变异系数（CV%）来反映试验数据波动误差

变异系数（CV%）=标准差（s）/平均数

其中

$S=\sqrt{\frac{\mathrm{n\&Sigma;}{x_i}^2-{\left(\mathrm{\&Sigma;}{x}_i\right)}^2}{n-(n-1)}}$

表4

结果显示本试剂盒的方法灵敏度、批内CV%及批间CV%，与杯碟法、碘量法-比色法比较，显著的提高了方法的灵敏度及精密度。

实施例5

试剂盒保质期测试

1）2-8℃正常保存

将本发明的试剂盒放置于2-8℃干燥环境中，在一年内不同月份检测，测试所得标准点OD数值、标准曲线形态、样品浓度、添加回收率均无显著性变化。体现了该试剂盒在正确保存条件下，实验数据良好的再现性。

2）室温放置实验

结果显示本发明的试剂盒在室温（25-28℃）放置2个月内实验OD值及IC50均无显著性变化。

3）反复冻融破坏实验

对本发明的试剂盒进行冻融实验，将试剂盒各组份置-18℃三天，解冻后测定各标准浓度的OD值（10次平均值），结果显示该试剂盒各组分经冻融后OD值及IC50无显著性变化。

4）37℃加速破坏实验

对本发明的试剂盒进行加速试验，37℃放置，分别于1天、2天、3天、4天、5天、6天、9天、12天16天、20天后测定各标准浓度的OD值（10次重复的平均值）结果显示该试剂盒组分经37摄氏度后OD值及IC50无显著性变化。

Claims (10)

1.一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含包被有青霉素结合蛋白的酶标板、标记物偶联β-内酰胺类抗生素、底物对照1为β-内酰胺类抗生素浓度为0ppb的脱脂奶粉冻干品、底物对照2为含标定浓度β-内酰胺类抗生素的脱脂奶粉冻干品、β-内酰胺类抗生素标准品。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述青霉素结合蛋白为重组青霉素结合蛋白PBP2x或PBP3。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述标记物为酶、核素、量子点、荧光素、胶体金或荧光微球中之一。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述酶为辣根过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或6-磷酸葡糖脱氢酶中之一。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述核素为³H、¹⁸⁸Re或¹³¹I中之一。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或3价镧系螯合物中之一。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于荧光微球为时间分辨荧光微球。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述β-内酰胺类抗生素为青霉素类抗生素、头孢类抗生素、或碳青霉烯类抗生素。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述β-内酰胺类抗生素为阿莫西林或氨苄西林。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述底物对照2中β-内酰胺类抗生素青霉素的标定浓度为20ppb。

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