CN108037286A - 一种检测β-内酰胺酶的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品安全检测领域，涉及一种检测β‑内酰胺酶的方法。该方法对现有方法中涉及的各参数进行了优化，由此将对β‑内酰胺酶的检测限优化到低至1U/mL或0.2IU/L，提高了系统的稳定性和灵敏度，拓宽了现有方法的适用范围。

Description

一种检测β-内酰胺酶的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于食品安全检测领域。更具体地，本发明涉及一种检测β-内酰胺酶的方法及试剂盒。

背景技术

β-内酰胺酶(β-lactamase)是细菌产生的可水解β-内酰胺环抗生素的酶，通过水解或非水解方式破坏进入菌体内的β-内酰胺环，导致β-内酰胺类抗生素失活，这些酶的基因存在于细菌的染色体或质粒中。

β-内酰胺酶一般用于抗生素过敏、抗生素效价测定、抗生素残留器具清洗等，20世纪80年代中期，国外开始使用β-内酰胺酶处理青霉素超标牛乳。由于国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购的原则，针对这种情况，市场上出现了“抗生素分解剂”，该分解剂经百万倍稀释后可选择性分解牛奶中残留的β-内酰胺抗生素，其成分就是β-内酰胺酶。近些年在经济利益的驱动下，一些不法奶站利用β-内酰胺酶降解乳中所含抗生素，生产人造“无抗奶”，从而掩蔽抗生素超标的事实。生鲜乳中添加β-内酰胺酶能引起人的过敏反应、增加人体耐药性和助长抗生素滥用等危害。

2009年，我国少数乳制品中检出含有该物质，同年2月4日，卫生部等九部门组成的全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治领导小组将β-内酰胺酶列为《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第二批)》，并进行全国性监控。

β-内酰胺酶是由多种酶组成的酶家族，它的种类和数量现已超过了400种，以青霉素酶为例，由蜡状芽孢杆菌培养中得到的青霉素酶结晶分子量从31500到35200不等，因此一般的测定方法主要有微生物学法(杯碟法)和免疫学法(试纸条或试剂盒)，也有液质联用法、碘量法、酸量法等。微生物学法(杯碟法)也称牛津杯法、管碟法，由于其具有技术成熟、定性准确等特点，因此是国内外测定抗生素效价的通用方法，也是各国药典规定的方法，例如卫生部“乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法(杯碟法)”、河北省地方标准《DB 13/T 1080-2009乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定》等。而对于上述的检测方法，目前依然存在诸多问题。例如，上述检测体系并不稳定，有时能够成立，而有时却不成立，这对于检测效率而言是非常不利的。再例如，现有方法的检测限是4U/mL，该检测限不足够低至准确地反映出样品中的β-内酰胺酶的存在情况。又再例如，现有的方法仅采用以U作为计量单位的β-内酰胺酶作为标准品。正如本领域技术人员所知晓的那样，目前本领域并不清楚酶活单位U和国际酶活单位IU之间的换算关系。在这种情况下，若是希望采用IU表示的β-内酰胺酶时，则不知晓如何调整该系统能够进行有效的检测。

针对上述问题，本领域亟需一种检测β-内酰胺酶的方法，用于确定乳及乳制品特别是生鲜乳中β-内酰胺酶的存在与否，该方法应该更为精确、稳定，并且适用范围更为广，从而实现快速、准确地鉴别乳及乳制品特别是生鲜乳中是否非法添加有β-内酰胺酶，提高对检测能力和质量安全控制，确保上市乳品质量安全。

发明内容

如背景技术部分所详细阐述的那样，本领域亟需一种检测β-内酰胺酶的方法，用于确定乳及乳制品特别是生鲜乳中β-内酰胺酶的存在与否，该方法应该更为精确、稳定，并且适用范围更为广，从而实现快速、准确地鉴别乳及乳制品特别是生鲜乳中是否非法添加有β-内酰胺酶，提高对检测能力和质量安全控制，确保上市乳品质量安全。

因此，在一方面，本发明提供了一种检测β-内酰胺酶的方法，所述方法包括以下步骤：

a)利用含有1×10⁸-9×10⁸CFU/mL藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的抗生素检测用培养基铺板，由此制备检验用平板；

b)制备四个样品用检测系，分别为第一样品用检测系、第二样品用检测系、第三样品用检测系和第四样品用检测系，其中，

所述第一样品用检测系包含：待测样品、青霉素，

所述第二样品用检测系包含：待测样品、舒巴坦、青霉素，

所述第三样品用检测系包含：待测样品、β-内酰胺酶、青霉素，

所述第四样品用检测系包含：待测样品、β-内酰胺酶、舒巴坦、青霉素，

并且在所述四个样品用检测系中，在所述待测样品为1000微升的情况下，所述β-内酰胺酶在存在时为33.75-75U或者0.01-0.015IU，所述舒巴坦在存在时为20-30微克，所述青霉素为0.1-0.25微克；

制备四个对照用检测系，分别为第一对照用检测系、第二对照用检测系、第三对照用检测系和第四对照用检测系，其中除将待测样品替换为无菌水外，所述四个对照用检测系的其余组分及其含量与所述四个样品用检测系的组分和含量相同；

c)将步骤b)的四个样品用检测系和四个对照用检测系分别加至步骤a)制备的检验用平板的不同位置，之后培养一段时间，随后测量各抑菌圈直径；

d)对检测结果进行判定：

若对照结果如下：

(1)第一对照用检测系、第二对照用检测系、第三对照用检测系所在位置处均产生抑菌圈；

(2)第一对照用检测系所在位置处的抑菌圈与第二对照用检测系所在位置处的抑菌圈差异小于等于3.0mm；

(3)第三对照用检测系所在位置处的抑菌圈小于第四对照用检测系所在位置处的抑菌圈且差异大于等于3.0mm；

则系统成立，此时对样品结果判断如下：

(1)若第一样品用检测系所在位置处的抑菌圈小于第二样品用检测系所在位置处的抑菌圈且差异大于等于3mm，则判断该待测样品中添加有β-内酰胺酶，检验结果为阳性；

(2)若第一样品用检测系所在位置处的抑菌圈与第二样品用检测系所在位置处的抑菌圈之间的差异小于3mm时，则判断该待测样品中未添加有β-内酰胺酶，检验结果为阴性；

(3)若第一样品用检测系所在位置处与第二样品用检测系所在位置处均不产生抑菌圈，则对待测样品进行稀释，再重复步骤a)-步骤d)。

在第二方面，本发明提供了一种试剂盒，用于实施本发明第一方面的检测β-内酰胺酶的方法，所述试剂盒包括：

a)0.05mg/mL的青霉素标准溶液，

b)1mg/mL的舒巴坦标准溶液，

c)2650U/mL或500IU/L的β-内酰胺酶标准溶液；

d)实施本发明第一方面所述的检测β-内酰胺酶的方法的使用说明书。

与目前现有卫生部“乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法(杯碟法)”、河北省地方标准《DB 13/T 1080-2009乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定》等方法相比，本发明的检测方法主要具有以下一个或者多个技术效果：

1、优化了体系中β-内酰胺酶的含量；例如，对于1000μL待测样品，对应的β-内酰胺酶含量从400U降低至33.75-75U，优选66.25U，从而保证了试验整体系统的始终成立；

2、优化了体系中青霉素的含量，例如，对于1000μL待测样品，青霉素的含量从原来的0.5μg降低至例如0.1-0.25μg，这使各个抑菌圈之间的分离度更好；

3、把铺两层培养基的程序简化为铺一层培养基，提高了工作效率；

4、通过对一系列参数的优化，检测限由原来的4U/mL降低到了1U/mL，提高了试验灵敏度；

5、还另外增加了以Sigma公司为代表的按照国际酶活单位定义的β-内酰胺酶的检测参数，并确定了其检测限为0.2IU/L，提高了方法的适应性；

6、增加了藤黄微球菌菌种复活、菌种鉴别、菌种传代、菌种保存、菌悬液最佳浓度确定方法等内容，对新上岗人员成功完成试验具有很大指导意义。

附图说明

现在将仅通过参考附图的非限制性示例来描述本发明，其中：

图1示出青霉素标准溶液的最适浓度及培养基层数对结果的影响；

图2示出添加不同浓度的β-内酰胺酶(酶活：U/mL)的抑菌圈直径；

图3示出添加不同浓度的β-内酰胺酶(酶活：IU/L)的抑菌圈直径；

图4示出空白水对照和添加10U/mL样品的检测图。

具体实施方式

下面参照附图对本发明的具体实施方案作进一步清楚和完整的描述。需要理解的是，本文中具体描述的实施方案仅用于示例目的，无意于以任何方式对本发明的保护范围进行限制。在不背离本发明的精神和宗旨的情况下，可以对本发明进行修改。本发明的保护范围由随附的权利要求来进行限定。

现有的检测β-内酰胺酶的标准方法原理如下：采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，利用舒巴坦特异性抑制β-内酰胺酶的活性，并以青霉素作为指示物，通过比对添加β-内酰胺酶抑制剂与未添加β-内酰胺酶抑制剂的样品所产生的抑菌圈的大小来间接测定样品中的β-内酰胺酶。

然而，该标准方法尚且存在很多缺陷，例如其检测限为4U/mL，不能检测样品中更低含量的β-内酰胺酶，灵敏度低。又例如，现有的标准方法中采用16000U/mL的β-内酰胺酶，该浓度过高，常常会导致系统不成立(参见实施例部分)，使系统不稳定。再又例如，现有的标准方法所采用的青霉素标准溶液的浓度为0.1mg/mL，在该浓度下，各抑菌圈的分离度不好，从而也导致系统不稳定，不可用。再有，现有的标准方法仅适合用于检测以U作为酶活单位的β-内酰胺酶，而对于以国际酶活单位IU定义的β-内酰胺酶，并不适用。同时，本领域目前尚无IU和U之间如何进行换算的教导。在这种情况下，若是希望采用IU表示的β-内酰胺酶时，则不知晓如何调整该系统能够进行有效的检测。

为解决现有的检测β-内酰胺酶的标准方法上述的缺陷，以及上文没有述及的其他缺陷，本发明人对该标准方法进行了反复优化，由此获得了本发明。

因此，在一方面，本发明提供了一种检测β-内酰胺酶的方法，所述方法包括以下步骤：

a)利用含有1×10⁸-9×10⁸CFU/mL藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的抗生素检测用培养基铺板，由此制备检验用平板；

b)制备四个样品用检测系，分别为第一样品用检测系、第二样品用检测系、第三样品用检测系和第四样品用检测系，其中，

所述第一样品用检测系包含：待测样品、青霉素，

所述第二样品用检测系包含：待测样品、舒巴坦、青霉素，

所述第三样品用检测系包含：待测样品、β-内酰胺酶、青霉素，

所述第四样品用检测系包含：待测样品、β-内酰胺酶、舒巴坦、青霉素，

并且在所述四个样品用检测系中，在所述待测样品为1000微升的情况下，所述β-内酰胺酶在存在时为33.75-75U或者0.01-0.015IU，所述舒巴坦在存在时为20-30微克，所述青霉素为0.1-0.25微克；

制备四个对照用检测系，分别为第一对照用检测系、第二对照用检测系、第三对照用检测系和第四对照用检测系，其中除将待测样品替换为无菌水外，所述四个对照用检测系的其余组分及其含量与所述四个样品用检测系的组分和含量相同；

c)将步骤b)的四个样品用检测系和四个对照用检测系分别加至步骤a)制备的检验用平板的不同位置，之后培养一段时间，随后测量各抑菌圈直径；

d)对检测结果进行判定：

若对照结果如下：

(1)第一对照用检测系、第二对照用检测系、第三对照用检测系所在位置处均产生抑菌圈；

(2)第一对照用检测系所在位置处的抑菌圈与第二对照用检测系所在位置处的抑菌圈差异小于等于3.0mm；

(3)第三对照用检测系所在位置处的抑菌圈小于第四对照用检测系所在位置处的抑菌圈且差异大于等于3.0mm；

则系统成立，此时对样品结果判断如下：

(1)若第一样品用检测系所在位置处的抑菌圈小于第二样品用检测系所在位置处的抑菌圈且差异大于等于3mm，则判断该待测样品中添加有β-内酰胺酶，检验结果为阳性；

(2)若第一样品用检测系所在位置处的抑菌圈与第二样品用检测系所在位置处的抑菌圈之间的差异小于3mm时，则判断该待测样品中未添加有β-内酰胺酶，检验结果为阴性；

(3)若第一样品用检测系所在位置处与第二样品用检测系所在位置处均不产生抑菌圈，则对待测样品进行稀释，再重复步骤a)-步骤d)。

步骤a)中的抗生素用培养基可以是任何合适的抗生素培养基，例如抗生素2号培养基。抗生素2号培养基可以通过例如如下方式配制：将以下成分加入到1000mL蒸馏水中，搅拌均匀并调整pH至6.6：蛋白胨10g；牛肉浸膏3g；氯化钠5g；酵母膏3g；葡萄糖1g；琼脂14g。

在一个实施方案中，该培养基中的藤黄微球菌可以为1×10⁸CFU/mL、2×10⁸CFU/mL、3×10⁸CFU/mL、4×10⁸CFU/mL、5×10⁸CFU/mL、6×10⁸CFU/mL、7×10⁸CFU/mL、8×10⁸CFU/mL、9×10⁸CFU/mL，或由这些端点形成的任意区间；但是优选为5×10⁸CFU/mL。

在一个实施方案中，可以采用双层培养基。此时，可以先用不含藤黄微球菌的抗生素检测用培养基铺板，待其凝固形成第一平板之后，再用含有藤黄微球菌的抗生素检测用培养基铺板，由此制备获得检验用平板。需要指出的是，尽管在本检测方法中也可以采用双层培养基，但是从本申请给出的结果(参见实施例部分)可以看出，采用双层培养基和单层培养基，所获得的结果没有差异，或者说是相当的。在这种情况下，出于简化程序之目的，优选采用单层培养基进行培养。

在一个实施方案中，其中在所述四个样品用检测系中，在所述待测样品为1000微升的情况下，所述β-内酰胺酶在存在时为66.25U或者0.0125IU，所述舒巴坦在存在时为25微克，所述青霉素为0.25微克。

在一个实施方案中，也可以先进行步骤b)，再进行步骤a)。

在一个实施方案中，步骤d)中的培养在36±1℃进行一段时间，例如16-24小时，如18-22小时。

在一个实施方案中，所述待测样品可以为任何被怀疑含有β-内酰胺酶的样品，例如生鲜乳、乳粉或酸性乳制品。在所述待测样品为乳粉时，可以在将其按1:10的比例稀释之后再进行检测。在所述待测样品为酸性乳制品时，可以在将其pH调节至6-7之后再进行检测。

在一个实施方案中，其中步骤b)中的各检测系可以按照如下方式进行制备：

i)利用pH6.0的磷酸盐缓冲液，将青霉素配制成浓度为0.02-0.05mg/mL的标准溶液，将舒巴坦配制成0.8-1.2mg/mL例如1mg/mL的标准溶液，将β-内酰胺酶配制成浓度为1350-3000U/mL例如2650U/mL或400-600IU/L例如500IU/L的标准溶液；

ii)利用i)中配制的各标准溶液，先制备第一样品用检测系、第二样品用检测系、第三样品用检测系、第四样品用检测系：

-所述第一样品用检测系包含：1000μL待测样品、5μL青霉素标准溶液，

-所述第二样品用检测系包含：1000μL待测样品、25μL舒巴坦标准溶液和5μL青霉素标准溶液，

-所述第三样品用检测系包含：1000μL待测样品、25μLβ-内酰胺酶和5μL青霉素标准溶液，

-所述第四样品用检测系包含：1000μL待测样品、25μLβ-内酰胺酶标准溶液、25μL舒巴坦标准溶液、和5μL青霉素标准溶液；

iii)按照ii)中的方式制备第一对照用检测系、第二对照用检测系、第三样品用检测系、第四样品用检测系，所不同的是将其中的待测样品替换为无菌水。

在步骤i)中，所使用的pH6.0的磷酸盐缓冲液可以通过如下方式进行配制：称取无水磷酸二氢钾8.0g和无水磷酸氢二钾2.0g于100mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀。

在一个优选的实施方案中，在步骤i)中，将青霉素配制成浓度为0.05mg/mL的标准溶液，将舒巴坦配制成1mg/mL的标准溶液，将β-内酰胺酶配制成浓度为2650U/mL或500IU/L的标准溶液。

在一个具体实施方案中，本发明的检测β-内酰胺酶的方法包括以下步骤：

a)将含有5×10⁸CFU/mL藤黄微球菌的抗生素检测用培养基(例如抗生素2号培养基)在直径至少为90mm的培养皿中铺板，待其凝固之后在其上均匀地放置四个牛津杯，由此制备获得检验用平板；

b)利用pH6.0的磷酸盐缓冲液，将青霉素配制成浓度为0.05mg/mL的标准溶液，将舒巴坦配制成1mg/mL的标准溶液，将β-内酰胺酶配制成浓度为2650U/mL或500IU/L的标准溶液；

c)根据下表添加各成分，并混合均匀，由此获得第一样品用检测系、第二样品用检测系、第三样品用检测系和第四样品用检测系，以及第一对照用检测系、第二对照用检测系、第三对照用检测系和第四对照用检测系：

d)将所述第一样品用检测系、第二样品用检测系、第三样品用检测系和第四样品用检测系分别加入到步骤a)中制备获得的一个检验用平板上的四个牛津杯中，并将所述第一对照用检测系、第二对照用检测系、第三对照用检测系和第四对照用检测系分别加入到步骤a)中制备获得的另一个检验用平板上的四个牛津杯中，随后36±1℃培养18-22小时，之后测量抑菌圈直径；

e)对检测结果进行判定：若对照结果如下：

(1)第一对照用检测系、第二对照用检测系、第三对照用检测系所在位置处均产生抑菌圈；

(2)第一对照用检测系所在位置处的抑菌圈与第二对照用检测系所在位置处的抑菌圈差异小于等于3.0mm；

(3)第三对照用检测系所在位置处的抑菌圈小于第四对照用检测系所在位置处的抑菌圈且差异大于等于3.0mm；

则系统成立，此时对样品结果判断如下：

(1)若第一样品用检测系所在位置处的抑菌圈小于第二样品用检测系所在位置处的抑菌圈且差异大于等于3mm，则判断该待测样品中添加有β-内酰胺酶，检验结果为阳性；

(2)若第一样品用检测系所在位置处的抑菌圈与第二样品用检测系所在位置处的抑菌圈之间的差异小于3mm时，则判断该待测样品中未添加有β-内酰胺酶，检验结果为阴性；

(3)若第一样品用检测系所在位置处与第二样品用检测系所在位置处均不产生抑菌圈，则对待测样品进行稀释，再重复步骤a)-步骤e)。

在所述具体实施方案中，如上所述，可以先进行步骤b)和步骤c)，再进行步骤a)。

在第二方面，本发明提供了一种试剂盒，用于实施本发明第一方面所述的检测β-内酰胺酶的方法，所述试剂盒包括：a)0.05mg/mL的青霉素标准溶液，b)1mg/mL的舒巴坦标准溶液，c)2650U/mL或者500IU/L的β-内酰胺酶标准溶液；和d)实施本发明第一方面所述的检测β-内酰胺酶的方法的使用说明书。

实施例

下面通过实施例并结合说明书附图对本发明进行详细阐述。应理解，在此所给出实施例仅出于示例之目的，无意于以任何方式限制本发明的范围。本发明的范围由随附的权利要求书所限定。

试剂和材料

实验室用水规格和试验方法应符合GB/T 6682。微生物实验室常规灭菌、培养设备和操作方法应符合GB 4789.1。其他设备和材料如下：

设备和材料

抑菌圈测量仪或测量尺(精确至0.01mm)

恒温培养箱

高压灭菌器

无菌培养皿：内径90mm，具陶瓦盖

无菌牛津杯：外径(8.0±0.l)mm，内径(6.0±0.1)mm，高度(10.0±0.l)mm

牛津杯放置器：同时放4个杯子

麦氏比浊仪或标准比浊管

无菌吸管：1mL(0.01mL刻度值)，10mL(0.1mL刻度值)

加样器：5μL、20μL、50μL、200μL及配套吸头

电子天平(精确至0.01mg)

试剂和培养基

实验菌种:藤黄微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001，传代次数不得超过14次。

磷酸盐缓冲液(pH＝6.0)：称取无水磷酸二氢钾8.0g和无水磷酸氢二钾2.0g于1000mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀。

生理盐水(8.5g/L)：氯化钠8.5g、蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌15min。

营养琼脂：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15-20g、蒸馏水100mL；将上述成分加入蒸馏水中，搅混均匀，分装试管，每管约5-8mL，120℃高压灭菌15min，灭菌后摆放斜面。

抗生素2号培养基：蛋白胨10g；牛肉浸膏3g；氯化钠5g；酵母膏3g；葡萄糖1g；琼脂14g；蒸馏水1000mL，将上述成分加入蒸馏水中，搅混均匀，其最终pH值约为6.6。

脑心浸液培养基：称取33.0g于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至46℃左右时制成平板或斜面备用。

标准品:

青霉素标准品，纯度≥92.2％。

β-内酰胺酶标准品：酶活力达到100万IU/mL以上或同等活力标准品。

舒巴坦标准品，纯度≥98.0％。

对比例1.乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶的检验方法——杯碟法(现有技术)

菌悬液的制备

将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经36±1℃培养18-24小时，用生理盐水洗下菌苔即为菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度大于1×10¹⁰CFU/mL，4℃保存，贮存期限2周。

样品和对照的制备

将待测样品充分混匀，取1mL待检测样品于1.5mL离心管中共4管，分别标为：A、B、C、D，每个样品管做三个平行，共12管。如样品为乳粉，则将乳粉按1:10的比例稀释。如样品为酸性乳制品，则应调节pH至6-7。另外，同时每次检验应取无菌纯水1mL加入到1.5mL离心管中，分别标为：A、B、C、D，每次实验均做三个平行作为阴性对照。

检验用平板的制备

取90mm灭菌玻璃培养皿，底层加10mL灭菌的抗生素检测用培养基II，凝固后上层加入5mL含有浓度为1×10⁸CFU/mL藤黄微球菌的抗生素检测用培养基II，凝固后备用。

样品的测定

按照下列顺序分别将青霉素标准溶液(0.1mL，用磷酸盐缓冲液(pH6.0)配制)、β-内酰胺酶标准溶液(16000U/ml，用磷酸盐缓冲液(pH6.0)配制)、舒巴坦标准溶液(1mg/ml，用磷酸盐缓冲液(pH6.0)配制)加入到待测样品及对照中：

A、青霉素5μL

B、舒巴坦25μL、青霉素5μL

C、β-内酰胺酶25μL、青霉素5μL

D、β-内酰胺酶25μL、舒巴坦25μL、青霉素5μL

混匀后，将上述A-D试样各200μL加入放置于检验用平板上的4个无菌牛津杯中，以陶瓦盖代替培养皿原盖，36±1℃培养18-22小时，之后测量抑菌圈直径。每个样品取三次平均试验平均值。

结果判定

各平行试验结果应小于2.0mm。实验数据按照下面进行处理：

纯水样品结果应为：A、B和D均应产生抑菌圈；A抑菌圈与B抑菌圈相比差异≤3mm，且重复性良好；C抑菌圈小于D抑菌圈，且差异≥3mm，且重复性良好。

如果为此结果，则系统成立，可对样品结果进行如下判定：

如果样品结果中B和D均产生抑菌圈，且C和D抑菌圈差异在3mm以上(含3mm)时，可以按照如下判定结果：

1.A抑菌圈小于B抑菌圈，且差异≥3mm，且重复性良好，应判定该试样添加有β-内酰胺酶，检验结果为阳性；

2.A抑菌圈小于B抑菌圈，且差异＜3mm，且重复性良好，应判定该试样未添加β-内酰胺酶，检验结果为阴性。

如果A和B均不产生抑菌圈，则应将样品稀释后再进行检测。

上述方法的检出限为4U/mL。

实施例1.藤黄微球菌菌悬液的制备

菌种复活:将配置好的脑心浸液培养基分装成每管5mL，121℃高压灭菌15min，备用。无菌操作将藤黄微球菌标准菌株冻干粉，转移至脑心浸营养肉汤中，混匀，37℃±1℃培养24h，观察生长状况(培养基呈浑浊)。

菌种鉴别：取复活后的菌液，在营养琼脂平板上划线分离，37℃±1℃培养24h，观察菌落形态是否符合该菌株形态特征(黄色，粗糙粒状，圆形，突起，湿润)。对单个菌株进行制片，并进行革兰氏染色，镜检观察菌体形态是否符合菌株特征(菌体卵球形，0.5～1.0μm，革兰氏阳性，沿两个垂直的平面分裂，分裂后每四个细胞在一起呈“田”字形)。

菌种传代：如果复活后的菌种符合要求，用接种针挑取营养琼脂平板上的单菌落，于营养琼脂斜面上转接培养，36℃±1℃培养18-24小时，传代次数不超过14次。

菌悬液浓度：用生理盐水洗下营养琼脂斜面上的菌苔，即为菌悬液。将菌悬液放在比色管中，与标准麦氏比浊管进行比对，其浊度略高于5号比浊管，也可用分光光度计或酶标仪在450nm处测量，吸光度在2.8-3.2之间，符合终浓度应大于1×10¹⁰CFU/mL。菌悬液在4℃保存，保存期限为2周。

菌种保存：如果复活后的菌种符合要求，用接种针挑取营养琼脂平板上的单个菌落于灭菌营养肉汤中，37℃培养24h～48h，观察生长状况(培养基呈浑浊)，然后将此菌悬液与40-50％甘油1:1混合，分装在菌种冻存管中，-80℃以下保存，保存期限1-2年。使用时，取出1管，重新按上述各步骤复活、传代、保存。保存菌种一般传代不超过5代。

实施例2.藤黄微球菌菌悬液最佳浓度的确定

藤黄微球菌作为本试验的指示菌，其浓度对试验结果影响很大，过浓则抑菌作用不明显，过稀则抑菌圈边缘不清晰，难以准确测量，所以要求菌悬液浓度大于10¹⁰CFU/mL左右。

菌悬液浓度的确定：用生理盐水洗下营养琼脂斜面上的菌苔，即为菌悬液。依次用灭菌的生理盐水进行10倍稀释，共稀释9个梯度。然后分别进行菌落计数培养，确定菌悬液浓度后再稀释成约1×10¹⁰CFU/mL的菌悬液，与麦氏比浊管进行比对。用分光光度计对菌悬液进行260nm-800nm全扫描，确定在450nm吸光度最强，记录三次菌悬液吸光度，如表1。

表1.菌悬液(浓度约为1×10¹⁰CFU/mL)紫外分光光度计测定结果

序号	WL450(吸光度)
		第一次	2.897
第二次	3.097
		第三次	3.260

通过以上试验，确定浓度约为1×10¹⁰CFU/mL的菌悬液，其浊度略高于5号比浊管；用分光光度计或酶标仪在450nm处测量，吸光度在2.8-3.3之间。建议每次试验前，将菌悬液在450nm下测定吸光值，数值控制在3.000左右。

实施例3.青霉素标准溶液的最适浓度及培养基层数对测试结果的

影响

首先，将青霉素标准品配制成如下浓度的青霉素标准溶液：0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.50mg/mL、1.00mg/mL。

其次，准备对照组和处理组，其中对照组为1mL灭菌水+5μL磷酸盐缓冲液，处理组为1mL灭菌水+5μL不同浓度的青霉素标准溶液。

对于培养基，若采用一层培养基，则菌悬液按1:20添加，共15ml；若采用双层培养基，则底层为10mL无菌培养基，上层菌悬液比例为1:50，5mL。

表2.不同浓度的青霉素标准溶液以及培养基层数对抑菌圈直径的影响

从上表可以看出：在90mm的培养皿中同时点4个样品时，青霉素浓度在0.05mg/mL时，抑菌圈在29.8-33.0mm之间，青霉素浓度在0.02mg/mL时，抑菌圈在21.8-23.5mm之间，均比较合适。若青霉素的浓度过低，则产生的抑菌圈过小，会影响检测灵敏度；相反，若青霉素的浓度过高，则产生的抑菌圈过大，培养皿上的四个抑菌圈会互相重叠，无法判定结果。

另外，对于采用一层培养基(用15mL添加1:20菌悬液的培养基铺一层)和两层培养基(底层为10mL无菌培养基+上层5mL菌悬液添加比例为1:50的双层培养基)，经比较发现，各浓度梯度试验的结果之间差异均不显著(P>0.5)。因此，为了减少试验操作步骤，建议采用一层培养基即可。

实施例4.β-内酰胺酶标准工作溶液的最适浓度的确定

目前市场上常用β-内酰胺酶标准品主要有两种，一种为中国食品药品检定研究院研制，酶活性单位U参照中国药典的定义：37℃，每小时分解青霉素活性单位的量，规范化的β-内酰胺酶活性浓度表示为U/mL；另一种为sigma公司研制，酶活性单位按照1976国际生化协会酶学委员会推荐采用的酶活性单位IU，定义为：在25℃、pH＝7，1min能转化1μmol底物的酶量，即1IU＝1μmol.min-1，活性浓度常用IU/L来表示。

在确定了检测限、优化了青霉素标准溶液浓度后，以卫生部的判定标准，为确保试验体系成立，C抑菌圈应小于D抑菌圈，且差异在3mm以上，也就是舒巴坦对20倍检测限的β-内酰胺酶抑制作用明显。

在卫生部“乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法(杯碟法)”以及河北省地方标准《DB 13/T 1080-2009乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定》等方法中β-内酰胺酶标准工作液浓度均为16000U/mL。本发明人在实际工作中发现，这个浓度太高，C抑菌圈和D抑菌圈经常没有差异，导致系统不成立。因此，本发明人在没有改变舒巴坦标准溶液浓度的基础上对β-内酰胺酶溶液浓度进行了优化，把原来16000U/mL的标准液进行2倍、3倍、6倍、12倍稀释，试验如下：

β-内酰胺酶为中国食品药品检定研究院研制，300万U/mL；

1mL灭菌水、0.05mg/mL青霉素标准溶液、1mg/mL舒巴坦标准溶液；

β-内酰胺酶的标准溶液浓度分别为16000U/mL、8000U/mL、5300U/mL、2650U/mL、1350U/mL，每个浓度做3个重复。

上述物质按照表3的顺序添加：

表3 样品中添加的试剂与添加顺序

	β-内酰胺酶标准溶液	舒巴坦标准溶液	青霉素标准溶液
				A	—	—	5μL
B	—	25μL	5μL
				C	25μL	—	5μL
D	25μL	25μL	5μL

试验结果如满足以下条件，则系统成立：A、B、C均应产生抑菌圈；A抑菌圈与B抑菌圈相比差异≤3mm，且重复性良好；C抑菌圈＜D抑菌圈，差异≥3mm，且重复性良好。

表4.β-内酰胺酶(酶活：U/mL)标准工作液浓度试验结果

通过表4的试验结果可以看出，β-内酰胺酶标准溶液浓度为2650U/mL和1350U/mL时，C抑菌圈与D抑菌圈差异明显≥3.0mm，系统成立。β-内酰胺酶标准溶液浓度由原来的16000U/mL进行约6倍稀释到2650U/mL时或者进行约12倍稀释至1350U/mL时比较合适。同时对sigma公司(1KU)β-内酰胺酶标准溶液也进行了相应计算和试验，使用500IU/L或者250IU/L的标准溶液时，系统也能很好的成立。

实施例5.最低检测限确定

1.活性单位为U的β-内酰胺酶检测限的确定

β-内酰胺酶：中国食品药品检定研究院，300万U/mL

设置最终的点板浓度梯度：0.05U/mL、0.1U/mL、0.5U/mL、1U/mL、2U/mL、4U/mL

对照组：1mL灭菌水+5μL 0.05mg/mL青霉素标准溶液；

处理组：5μL 0.05mg/mL青霉素+1mL不同浓度的β-内酰胺酶溶液(在生鲜乳中配制)

表5.添加不同浓度的β-内酰胺酶(酶活：U/mL)的抑菌圈直径

参照卫生部的判断标准，当抑菌圈直径差异不小于3.0mm时即为“有显著性差异”。通过表5的试验数据可以看出，生鲜乳中β-内酰胺酶添加浓度在1U/mL时，处理组与对照组之间的抑菌圈差异为3.5mm，达到判定要求，所以将1U/mL作为检测限。

为了进一步确定该检测限的试验效果以及试验的精密度，进行β-内酰胺酶添加浓度在1U/mL的多个重复试验，试验结果见表6。

表6.β-内酰胺酶(酶活：U/mL)检测限和精密度试验结果

通过

表6试验结果可以看出，当β-内酰胺酶添加浓度在1U/mL时，抑菌圈A与抑菌圈B的差值在3.5mm至4.0mm之间，均值为3.9mm，同时抑菌圈C与抑菌圈D之间的差值也满足判定要求，各抑菌圈RSD的变化范围在0至1.084％之间，说明检测限设为1U/mL时，检测结果稳定、重复性符合要求。

2.活性单位为IU的β-内酰胺酶检测限确定

β-内酰胺酶购自Sigma公司，1KU/支

设置最终的点板浓度梯度依次为：0.05IU/L、0.10U/L、0.20IU/L、0.25IU/L、0.5IU/L、1.0IU/L

对照组：5μL 0.05mg/mL青霉素溶液+1mL灭菌水；

处理组：5μL 0.05mg/mL青霉素溶液+1mL不同浓度的β-内酰胺酶溶液(在生鲜乳中配制)

表7.添加不同浓度β-内酰胺酶(酶活：IU/L)的抑菌圈直径

参照卫生部的判断标准，当抑菌圈直径差异不小于3.0mm时为“有显著性差异”。通过表7的试验数据可以看出，生鲜乳中β-内酰胺酶添加浓度在0.2IU/L时，试验组与空白组抑菌圈差异3.3mm，即可达到判定要求，所以0.2IU/L可以作为检测限。

为了进一步确定该检测限的试验效果以及试验的精密度，进行β-内酰胺酶添加浓度在0.2IU/L的多个重复试验，试验结果见表8。

表8.β-内酰胺酶(酶活：IU/L)检测限和精密度试验结果

通过表8试验结果可以看出，当生鲜乳中β内酰胺酶添加浓度在0.2IU/L时，抑菌圈A与抑菌圈B的差值在4.0mm-4.3mm之间，均值为4.14mm，同时抑菌圈C与抑菌圈D之间的差值也满足判定要求，各抑菌圈RSD的变化范围在0-2.031％之间，说明检测限设为0.2IU/L时，检测结果稳定、重复性符合要求。

因为不同来源酶的活性单位定义不同，导致不同酶的检测限差异也很大。不同酶之间如何进行换算，还有待于进一步研究。

实施例6.本发明方法的适用性、准确性和精密度试验

检测方法确定后，通过适用性、准确度和精密度试验对本发明方法进行验证。为了验证本方法的适用性，课题组购买了不同来源的β-内酰胺酶或青霉素酶进行试验，分别进行空白样和1U/mL、5U/mL、10U/mL添加；为了考察方法的准确性和精密度，针对不同的酶进行了空白样和添加重复性试验。

青霉素标准溶液浓度为0.05mg/mL、舒巴坦标准溶液浓度用1mg/mL、β-内酰胺酶标准溶液浓度为2650U/mL或500IU/L。添加顺序和添加量按照

表3进行。

1.不同来源的β-内酰胺酶试验比较

表9.不同来源的β-内酰胺酶

表10.不同来源β-内酰胺酶试验结果

从表10结果可以看出，不同来源的酶检测结果相似，除去对照组因A和B抑菌圈差值均小于3mm，差值太小，RSD数值偏大以外，各添加组A和B抑菌圈差值均大于3mm，RSD在1.763-6.942％之间，符合试验要求，说明该方法适用性强。

2.准确度和精密度试验

按不同酶活性单位Sigma公司β-内酰胺酶(1KU)和中国食品药品检定研究院β-内酰胺酶(300万U/ml)设置2组实验，每组试验设置2个添加浓度处理，每个处理5个平行，同时做空白试验，检验结果如下：

表11.β-内酰胺酶(酶活：U/mL)重复性试验结果

表12.β-内酰胺酶(酶活：U/mL)检测限和精密度试验结果

表13.β-内酰胺酶(酶活：IU/L)重复性试验结果

表14.β-内酰胺酶(酶活：IU/L)重复性试验结果

表11至表14的试验结果表明：不同酶活性单位的β-内酰胺酶检测结果中未出现假阴性或假阳性，试验结果准确度高；各添加水平A、B、C、D抑菌圈5个平行结果RSD在0-4.176％之间，方法重复性满足要求。

实施例7.生鲜乳中β-内酰胺酶测定的标准流程——本发明的杯碟法

菌悬液的制备

藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经36±1℃培养18-24小时，用生理盐水洗下菌苔，即为菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度大于1×10¹⁰CFU/mL，4℃保存，贮存期限2周。

样品和对照的制备

将待测样品充分混匀，取1mL待检测样品于1.5mL离心管中，共4管，分别标为：A、B、C、D，每个样品管做三个平行，共12管。

另外，每次检验应取无菌水1mL加入到1.5mL离心管中，共4管，也标为：A、B、C、D，每次实验均做三个平行，作为阴性对照。

检验平板制备

含菌悬液培养基：将制备好的菌悬液(参见实施例1“菌悬液浓度”部分)按菌悬液1:20的比例加入灭菌后冷却至50℃-55℃的抗生素2号培养基中，充分混匀。

检验平板：向无菌培养皿中加入15mL含藤黄微球菌菌悬液的抗生素检测用抗生素2号培养基中，凝固后每个检验用平板上均匀放置4个无菌牛津杯，备用。

样品测定

按照

表3顺序分别将青霉素标准溶液、β-内酰胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液加入到已经加入待测样品和水空白的各离心管中。

将

表3所列出的A-D试样混匀后各取200μL加入放置于检验用平板上的4个无菌牛津杯中，以陶瓦盖代替培养皿原盖，36℃±1℃培养18小时-22小时，测量抑菌圈直径。取三组平行试验平均值。

结果判定

各平行试验结果差异应小于2.0mm；试验数据按照下面进行处理：

空白结果应为：A、B、D均应产生抑菌圈，A抑菌圈与B抑菌圈差异≤3.0mm，且重复性良好；C抑菌圈＜D抑菌圈，差异≥3.0mm。如为此结果，则系统成立，可对样品结果进行如下判定：

A抑菌圈小于B抑菌圈，差异≥3mm时，且重复性良好，应判定该试样添加有β-内酰胺酶，检验结果为阳性；A抑菌圈同B抑菌圈，差异＜3mm时，且重复性良好，应判定该试样未添加有β-内酰胺酶，检验结果为阴性。

如果A和B均不产生抑菌圈，应将样品稀释后再进行检验。

结论

该方法增加了适用于不同酶活单位、不同厂家来源的β-内酰胺酶，适应性强；通过对青霉素等相关试剂和酶最佳使用量的优化，检测限提高，不同酶活性单位的β-内酰胺酶检测限不同，分别为0.2IU/L和1U/mL，灵敏度高；不同酶活性单位的β-内酰胺酶检测结果中未出现假阴性或假阳性，试验结果准确度高；各添加水平A、B、C、D抑菌圈5个平行结果RSD在0～4.176％之间，方法重复性满足要求；同时对菌悬液制备、试剂材料配制、样品制备、分析步骤、分析结果的判定和表述等多项内容进行了更为具体的规定和说明，使方法更具有可操作性。

结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。本文中的说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。

Claims (10)

1.一种检测β-内酰胺酶的方法，所述方法包括以下步骤：

a)利用含有1×10⁸-9×10⁸/mL藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的抗生素检测用培养基铺板，由此制备检验用平板；

b)制备四个样品用检测系，分别为第一样品用检测系、第二样品用检测系、第三样品用检测系和第四样品用检测系，其中，

所述第一样品用检测系包含：待测样品、青霉素，

所述第二样品用检测系包含：待测样品、舒巴坦、青霉素，

所述第三样品用检测系包含：待测样品、β-内酰胺酶、青霉素，

所述第四样品用检测系包含：待测样品、β-内酰胺酶、舒巴坦、青霉素，

并且在所述四个样品用检测系中，在所述待测样品为1000微升的情况下，所述β-内酰胺酶在存在时为33.75-75U或者0.01-0.015IU，所述舒巴坦在存在时为20-30微克，所述青霉素为0.1-0.25微克；

制备四个对照用检测系，分别为第一对照用检测系、第二对照用检测系、第三对照用检测系和第四对照用检测系，其中除将待测样品替换为无菌水外，所述四个对照用检测系的其余组分及其含量与所述四个样品用检测系的组分和含量相同；

c)将步骤b)的四个样品用检测系和四个对照用检测系分别加至步骤a)制备的检验用平板的不同位置，之后培养一段时间，随后测量各抑菌圈直径；

d)对检测结果进行判定：

若对照结果如下：

(1)第一对照用检测系、第二对照用检测系、第三对照用检测系所在位置处均产生抑菌圈；

(2)第一对照用检测系所在位置处的抑菌圈与第二对照用检测系所在位置处的抑菌圈差异小于等于3.0mm；

(3)第三对照用检测系所在位置处的抑菌圈小于第四对照用检测系所在位置处的抑菌圈且差异大于等于3.0mm；

则系统成立，此时对样品结果判断如下：

(1)若第一样品用检测系所在位置处的抑菌圈小于第二样品用检测系所在位置处的抑菌圈且差异大于等于3mm，则判断该待测样品中添加有β-内酰胺酶，检验结果为阳性；

(2)若第一样品用检测系所在位置处的抑菌圈与第二样品用检测系所在位置处的抑菌圈之间的差异小于3mm时，则判断该待测样品中未添加有β-内酰胺酶，检验结果为阴性；

(3)若第一样品用检测系所在位置处与第二样品用检测系所在位置处均不产生抑菌圈，则对待测样品进行稀释，再重复步骤a)-步骤d)。

2.根据权利要求1所述的检测β-内酰胺酶的方法，其中在所述四个样品用检测系中，在所述待测样品为1000微升的情况下，所述β-内酰胺酶在存在时为66.25U或者0.0125IU，所述舒巴坦在存在时为25微克，所述青霉素为0.25微克。

3.根据权利要求1至2任一项所述的检测β-内酰胺酶的方法，其中可以先进行步骤b)，再进行步骤a)。

4.根据权利要求1-3任一项所述的检测β-内酰胺酶的方法，其中步骤d)中的培养在36±1℃进行16-24小时。

5.根据权利要求1-4任一项所述的检测β-内酰胺酶的方法，其中所述待测样品为生鲜乳、乳粉或酸性乳制品。

6.根据权利要求5所述的检测β-内酰胺酶的方法，其中所述待测样为乳粉，将其按1:10比例稀释之后使用。

7.根据权利要求5所述的检测β-内酰胺酶的方法，其中所述待测样品为酸性乳制品时，将其pH调节至6-7之后使用。

8.根据权利要求1-7任一项所述的检测β-内酰胺的方法，所述方法包括先用不含藤黄微球菌的抗生素检测用培养基铺板，待其凝固形成第一平板，然后根据步骤a)在所述第一平板上继续铺板，由此制备检验用平板。

9.根据权利要求1-8任一项所述的检测β-内酰胺的方法，其中在步骤b)中，

i)将青霉素配制成浓度为0.02-0.05mg/mL、优选0.05mg/mL的标准溶液，将舒巴坦配制成0.8-1.2mg/mL、优选1mg/mL的标准溶液，将β-内酰胺酶配制成浓度为1350-3000U/mL、优选2650U/ml、或400-600IU/L、优选500IU/L的标准溶液，

ii)利用i)中配制的各标准溶液，先配制第一样品用检测系、第二样品用检测系、第三样品用检测系、第四样品用检测系：

-所述第一样品用检测系包含：1000μL待测样品、5μL青霉素标准溶液，

-所述第二样品用检测系包含：1000μL待测样品、25μL舒巴坦标准溶液和5μL青霉素标准溶液，

-所述第三样品用检测系包含：1000μL待测样品、25μLβ-内酰胺酶和5μL青霉素标准溶液，

-所述第四样品用检测系包含：1000μL待测样品、25μLβ-内酰胺酶标准溶液、25μL舒巴坦标准溶液、和5μL青霉素标准溶液，

iii)按照ii)中的方式制备第一对照用检测系、第二对照用检测系、第三样品用检测系、第四样品用检测系，所不同的是将其中的待测样品替换为无菌水。

10.一种试剂盒，用于实施权利要求1-9任一项所述的检测β-内酰胺酶的方法，所述试剂盒包括：

a)0.05mg/mL的青霉素标准溶液，

b)1mg/mL的舒巴坦标准溶液，

c)2650U/mL或者500IU/L的β-内酰胺酶标准溶液；

d)实施权利要求1-9任一项所述的检测β-内酰胺酶的方法的使用说明书。