CN106868094A - 一种原料乳中抗生素残留的快速检测方法 - Google Patents

一种原料乳中抗生素残留的快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种原料乳中抗生素残留的快速检测方法，属于生物技术领域。本发明将冷冻干燥保存的嗜热脂肪地芽胞杆菌加入到营养肉汁琼脂培养基中进行活化培养，将活化后的嗜热脂肪地芽胞杆菌接种到磷酸盐缓冲液中获得悬浮液；在溴甲酚紫蛋白胨培养基中加入嗜热脂肪地芽胞悬浮液，获得测试培养基；将测试培养基与待检测原料乳按照体积比为1:2‑1:3混合均匀，在75℃‑80℃下水浴培养2.0h‑2.2h，观察培养基颜色的变化。本发明通过将水浴培养温度调整为75℃，并且配合相应合理的测试培养基与原料乳的体积比进而大大缩短了体系变色反应时间，将时间缩短了近20％左右，进一步提高了检测效率。

Description

一种原料乳中抗生素残留的快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种原料乳中抗生素残留的快速检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
原料乳中抗生素是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及其代谢物，及与兽药有关的杂质。泌乳动物在饲养过程中由于不合理使用治疗药物，导致其乳中广泛存在原料乳中抗生素残留。目前，原料乳中抗生素残留仍然是全球控制牛奶安全最为重要的问题之一，尤其是对中国来说，奶牛疾病的发生率高，奶牛专用药剂比较少，奶牛用药较混乱，致使有些疾病治疗的效果不理想，原料奶药检超标时有出现。虽然中国在兽药残留标准体系建设和兽药残留方法检测方面已经取得了长足的进步，但与相关国际组织和发达国家相比，与近年来发生的重大乳品安全事件所引起的民众恐慌相比，中国的牛奶中兽药残留体系建设还不完善，还需要进一步健全。
快速检测方法首先是能缩短检测时间，以及在样品制备、实验准备、操作过程简化和自动化上简化方法。无论在重大社会活动中，还是在日常卫生监督过程中，除感官检测外，针对常见引发急性中毒的有毒物质或重要控制环节开展现场快速检测，对某些慢性伤害物质可能大量超标以及劣质食品的快速检测，对餐饮具、食物加工器具表面洁净度的快速检测，对化学消毒剂有效成分的快速检测等，能在现场及时发现可疑问题，迅速采取相应措施，这对提高监督工作效率和力度，保障卫生安全有着重要的意义。
根据《GB/T 4789.27-2008鲜乳中抗生素残留检验》第二方法嗜热脂肪地芽胞杆菌抑制法中，但是此种方法检测时间较长，不利于现场的快速检测，不利于提高检测效率。
发明内容
为解决现有技术检测时间长、检测效率低的问题，本发明提供了一种原料乳中抗生素残留的检测方法，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种原料乳中抗生素残留的检测方法，该方法包括如下步骤：
1)将冷冻干燥保存的嗜热脂肪地芽胞杆菌加入到营养肉汁琼脂培养基中进行活化培养，将活化后的嗜热脂肪地芽胞杆菌接种到磷酸盐缓冲液中，并进行计数，使其浓度约为1×108CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞悬浮液；
2)在溴甲酚紫蛋白胨培养基中加入嗜热脂肪地芽胞悬浮液，混合均匀后进行计数，使芽孢的终浓度约为1×106CFU/mL-2×106CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞杆菌测试培养基，备用；
3)将测试培养基与待检测原料乳按照体积比为2:1-3:1混合均匀，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为与待检测原料乳的体积相同的抗生素标准参照溶液，阴性对照为与待检测原料乳的体积相同的无抗生素的脱脂乳，在75℃-80℃下水浴培养2.0h-2.2h，观察培养基颜色的变化，如果颜色没有变化，须再于水浴中培养30min作最终观察。
优选地，步骤1)所述营养肉汁琼脂培养基包含蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0。
优选地，步骤1)所述活化培养的温度为55℃。
优选地，步骤1)所述活化培养过程中加入5mg MnSO4·H2O。
优选地，步骤3)所述水浴培养的温度为75℃。
更优选地，本发明的测试体积(测试培养基和待检测原料乳的总体积)为600μL。
更优选地，本发明所述的方法，包括如下步骤：
1)将冷冻干燥保存的嗜热脂肪地芽胞杆菌加入到营养肉汁琼脂培养基中进行活化培养，将活化后的嗜热脂肪地芽胞杆菌接种到磷酸盐缓冲液中，并进行计数，使其浓度约为1×108CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞悬浮液；
2)在溴甲酚紫蛋白胨培养基中加入嗜热脂肪地芽胞悬浮液，混合均匀后进行计数，使芽孢的终浓度约为1×106CFU/mL-2×106CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞杆菌测试培养基，备用；
3)将测试培养基与待检测原料乳按照体积比为2:1混合均匀，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为与待检测原料乳的体积相同的抗生素标准参照溶液，阴性对照为与待检测原料乳的体积相同的无抗生素的脱脂乳，在75℃下水浴培养2.0h-2.2h，观察培养基颜色的变化，如果颜色没有变化，须再于水浴中培养30min作最终观察。
本发明有益效果：
本发明通过优化国标方法，将水浴培养的温度从65℃调整为75℃，发现在75℃下，产生了意料不到的技术效果，获得了较短的体系变色反应时间，能够大大缩短检测时间，将2.5±0.2h缩短至2.2h±0.2h，将时间缩短了近12％左右，最短可以将时间缩短至2.0h，将时间缩短了近20％，进一步提高了检测效率，并能满足原料乳中抗生素检测要求，本发明通过调整水浴时间并且配合相应合理的测试培养基与原料乳的体积比进而缩短了体系变色反应时间，取得了意料不到的技术效果。
附图说明
图1为水浴温度对体系变色时间的影响。
图2为测试培养基与原料乳的体积比对体系变色时间的影响。
图3为两因素交互作用对时间的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例1：
1实验
2.1材料
2.1.1菌种选择
嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)：根据《GB/T 4789.27-2008鲜乳中抗生素残留检验》采用的阳性对照菌株，用于牛奶中青霉素及其他抑制剂的检测。
2.1.2试剂及材料
营养肉汤、营养琼脂、蛋白胨、琼脂粉，生化试剂，溴甲酚紫，化学纯，青霉素钠，红霉素，头孢氨苄，四环素，土霉素，阿莫西林，头孢噻呋，磷酸二氢钠，磷酸二氢钾，氯化钠，氢氧化钠。
2.2仪器和设备
洁净工作台，全自动高压灭菌器，电热恒温培养箱，特勒台式PH计，电热数字显示恒温水浴锅，涡旋混合器，微量进样器。
2.3培养方法
2.3.1嗜热脂肪地芽胞杆菌活化培养
将冷冻干燥保存的嗜热脂肪地芽胞杆菌加入到营养肉汁琼脂中。培养基成分如下：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH 7.0。在培养芽孢杆菌时加入5mg的MnSO4·H2O，有利于产生芽孢。培养温度55℃。需氧类型为好氧。
2.3.2嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢悬浮液制备
将活化斜面菌种接种到磷酸盐缓冲液中，75℃加热10min，置于营养琼脂培养18～20h，用生理盐水洗下菌苔,将菌液移种于盛有250mL芽孢培养基的克氏瓶内，55℃培养4d，用10mL生理盐水洗下菌苔,并进行充分混合。以转速4 000r/min离心15min,弃去上清液。悬浮液以转速8 000r/min离心15min。并与80℃水浴10min，备用。并进行计数，使其浓度约为1×108CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞悬浮液。
2.3.3嗜热脂肪地芽胞杆菌菌落总数的测定
取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。然后在显微镜下找到计数室。将嗜热脂肪地芽胞杆菌悬浮液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。静置片刻，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。
2.3.4嗜热脂肪地芽胞杆菌测试培养基的制备
在溴甲酚紫蛋白胨培养基中加入嗜热脂肪地芽胞悬浮液，并进行计数，使其浓度约为1×108CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞悬浮液,然后加入到EP管中备用。
2.3原料乳中抗生素检测的影响条件优化
根据国标第二方法中，测试培养基与原料乳的体积比(溴甲酚紫蛋白胨培养基中最终芽孢浓度约为1×106～2×106CFU/mL)和水浴温度，本研究就上述几项内容进行优化。
2.3.1水浴温度对原料乳中抗生素检测的影响
根据国标第二方法中，推荐出的水浴温度为65℃，本研究拟将水浴温度梯度设定为55，60，65，70，75℃和80℃，保持其他条件不变，考察将温度升高对反应时间的影响。
2.3.2体积比对原料乳中抗生素检测的影响
根据国标第二方法中，推荐的溴甲酚紫蛋白胨培养基中嗜热脂肪地芽胞杆菌的接种量为最终芽孢浓度约为1×106～2×106CFU/mL，本研究拟将测试培养基与原料乳的体积比设定为1:1，2:1，3:1，4:1，5:1。测试体系体积设定为600μL，保持其他条件不变。考察测试培养基与原料乳的体积比对原料乳中抗生素检测的影响。
2.3.3两因素交互作用对原料乳中抗生素检测的影响
根基上述单因素优化的结果，选定多因素交互作用对原料乳中抗生素检测的影响的条件如下：水浴温度因素(55，65℃和75℃)，测试培养基与原料乳的体积比因素(1:1，2:1，3:1)，其中，溴甲酚紫蛋白胨培养基中，脂肪地芽胞杆菌的接种量为最终芽孢浓度约为1×106～2×106CFU/mL不变。
2.3.5原料乳中抗生素检测方法建立
将上述优化的条件如下：测试体系体积为600μL，其中嗜热脂肪地芽胞杆菌测试培养基为400μL，原料乳为200μL，测试培养基与原料乳的体积为(2:1)，检测温度为75℃。制成测试培养基，转入到EP管中，加入待测原料乳样品，进行检测。
2.4原料乳中抗生素检测限值确定
根据《动物性食品中兽药最高残留限量(农业部2002年235号公告)》[6]中规定的不同的抗生素的最高残留限量(MRL:Maximum Residue Limit)，将抗生素配制成浓度梯度，进行原料乳中抗生素检测限值确定，具体如下：
将青霉素配制成不同质量浓度梯度，分别为1，2，4，6，8μg/L；加入原料乳0.15mL中，研究抗生素青霉素检测限质量浓度。
2.6数据分析
本研究结果采用SAS6.12版本进行统计分析。
2.7结果判定：
在白色背景下从侧面和底部观察EP管中培养基颜色的变化，如果反应体系保持原有的紫色为阳性结果，反应体系变成黄色或者黄绿色为阴性结果。颜色处于二者之间，为可以结果。对于可以的结果，应继续培养30min，再次进行观察，如果反应体系仍为黄色或者黄绿色，则需再次检测。
3结果与分析
3.1嗜热脂肪地芽胞杆菌的获得与活化
根据国标第二方法中的阳性对照菌株，嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)菌粉用于牛奶中青霉素及其他抑制剂的检测，并采用营养肉汁琼脂培养及对其进行活化。
3.2嗜热脂肪地芽胞杆菌的培养及计数
将活化后的嗜热脂肪地芽胞杆菌接种到磷酸盐缓冲液中，进行计数，使其浓度约为1×108CFU·mL-1。
3.3嗜热脂肪地芽胞杆菌测试培养基的制备
在溴甲酚紫蛋白胨培养基中加入嗜热脂肪地芽胞悬浮液，并进行计数，使芽孢的终浓度为1×106～2×106CFU/mL。然后加入到EP管中备用。
3.4原料乳中抗生素检测的影响条件优化
3.4.1水浴温度对原料乳中抗生素检测的影响
水浴温度梯度设定为55，60，65，70，75℃和80℃，考察将温度升高对反应时间的影响，其他条件不变，结果如表1和图1所示。
表1水浴温度对原料乳中抗生素检测的影响
注：相同字母表示差异不显著(P﹥0.05)。下同。
由图1可以看出，随着水浴温度的提高可以缩短变色反应的时间，但是反应体系温度过高反应时间没有明显缩短，因此选择75℃，既能保证缩短变色反应时间，又不会导致反应体系温度过高。
3.4.2体积比对原料乳中抗生素检测的影响
测试培养基与原料乳的体积比设定为1:1，2:1，3:1，4:1和5:1；测试体系体积设定为600μL其中，溴甲酚紫蛋白胨培养基中，脂肪地芽胞杆菌的接种量为最终芽孢浓度约为1×106～2×106CFU/mL不变，考察测试培养基与原料乳的体积比对原料乳中抗生素检测的影响，其他条件不变，结果如表2和图2所示。
表2测试培养基与原料乳的体积比对原料乳中抗生素检测的影响
由图2可以看出，随着测试培养基与原料乳的体积比的提高可以缩短变色反应的时间，但是当体积比过高时，变色反应时间没有明显缩短，因此选择3:1，既能保证缩短变色反应时间，又不会导致反应体系中溴甲酚紫蛋白胨培养基浓度过高，显色反应不明显，不利于结果观察。
3.4.3原料乳中抗生素检测的影响条件
根据上述单因素优化的结果，选定多因素交互作用对原料乳中抗生素检测的影响的条件如下：水浴温度因素(55，65℃和75℃)，测试培养基与原料乳的体积比因素(1:1，2:1和3:1，其中，溴甲酚紫蛋白胨培养基中，脂肪地芽胞杆菌的接种量为最终芽孢浓度约为1×106～2×106CFU/mL不变)，结果如表3和图3所示。
表3两因素交互作用对原料乳中抗生素检测的影响
由图3可以看出，反应条件为水浴温度75℃，测试培养基与原料乳的体积比因素2:1，其中，溴甲酚紫蛋白胨培养基中，脂肪地芽胞杆菌的接种量为最终芽孢浓度约为1×106～2×106CFU/mL不变)，反应时间最短，并能满足体系变色反应要求。
3.5原料乳中抗生素检测限值确定
根据《动物性食品中兽药最高残留限量(农业部2002年235号公告)》[6]中规定的不同的抗生素的最高残留限量(MRL:Maximum Residue Limit)，将抗生素配制成浓度梯度，进行原料乳中抗生素检测限值确定。
3.5.1原料乳中青霉素检测限值确定
将青霉素配制成不同质量浓度梯度，分别为1，2，4，6μg/L和8μg/L，加入原料乳0.15mL中，研究抗生素青霉素检测限质量浓度，结果如表4所示。
表4原料乳中青霉素检测限值确定
由表4可以看出，本方法在优化国标第二方法的基础上，缩短了反应体系的变色时间，检出限为2～4μg/L可以，满足原料乳中抗生素检出限的要求。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种原料乳中抗生素残留的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将冷冻干燥保存的嗜热脂肪地芽胞杆菌加入到营养肉汁琼脂培养基中进行活化培养，将活化后的嗜热脂肪地芽胞杆菌接种到磷酸盐缓冲液中，并进行计数，使其浓度约为1×108CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞悬浮液；
2)在溴甲酚紫蛋白胨培养基中加入嗜热脂肪地芽胞悬浮液，混合均匀后进行计数，使芽孢的终浓度约为1×106CFU/mL-2×106CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞杆菌测试培养基，备用；
3)将测试培养基与待检测原料乳按照体积比为2:1-3:1混合均匀，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为与待检测原料乳的体积相同的抗生素标准参照溶液，阴性对照为与待检测原料乳的体积相同的无抗生素的脱脂乳，在75℃-80℃下水浴培养2.0h-2.2h，观察培养基颜色的变化，如果颜色没有变化，须再于水浴中培养30min作最终观察。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述营养肉汁琼脂培养基包含蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述活化培养的温度为55℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述活化培养过程中加入5mgMnSO4·H2O。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述水浴培养的温度为75℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述测试培养基和待检测原料乳的总体积为600μL。
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