CN108300756A - 硝呋太尔胶囊的微生物限度检查方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种硝呋太尔胶囊的微生物限度检查方法。所述方法如下：(1)菌液制备；(2)供试液制备：取硝呋太尔胶囊供试品10g，剪碎，加50mL的十四烷酸异丙酯，震摇，再加入100mL的45℃pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液，震摇，倒入无菌带过滤网均质袋中，取滤液静置，待油水分层，取水层制成1:10的供试液；取1:10的供试液10mL，加含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液40mL，即为1:50的供试液；(3)需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定；(4)控制菌的检查。本发明解决了硝呋太尔胶囊微生物检验中的假阴性现象，患者用药安全性高。

Description

硝呋太尔胶囊的微生物限度检查方法
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种硝呋太尔胶囊的微生物限度检查方法。
背景技术
阴道病(BV)的典型临床症状为：阴道异常，分泌物明显增多，呈稀薄均质状或稀糊状，为灰白色、灰黄色或乳黄色，带有特殊的鱼腥臭味。由于碱性前列腺液可造成胺类释放，故表现为性交时或性交后臭味加重。硝呋太尔胶囊治疗阴道病能够取得较好的疗效。
硝呋太尔胶囊适用于细菌性阴道病、滴虫性阴道炎、念珠菌性外阴阴道病、阴道混合感染的治疗，并且疗效值得信赖。为确保硝呋太尔胶囊疗效能正常发挥，患者使用需谨慎。
非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及中药的特殊性而制订的。微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
发明内容
本发明的目的是提供一种硝呋太尔胶囊的微生物限度检查方法，解决硝呋太尔胶囊微生物检验中的假阴性现象，患者用药安全性高。
本发明所述的硝呋太尔胶囊的微生物限度检查方法，步骤如下：
(1)菌液制备
分别制备金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液；
(2)供试液制备
取硝呋太尔胶囊供试品10g，剪碎，加50mL的十四烷酸异丙酯，震摇，再加入100mL的45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，震摇，倒入无菌带过滤网均质袋中，取滤液静置，待油水分层，取水层制成1:10的供试液；取1:10的供试液10mL，加含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液40mL，即为1:50的供试液；
(3)需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定
①试验组：取1:50的供试液1mL，加入到含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠白胨缓冲液100mL中，经薄膜过滤法处理，用含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠白胨缓冲液分次冲洗，每膜不少于400mL，在最后一次过滤时分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液，取下滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，置30-35℃培养箱中培养3天；另外，再将加入白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液的滤膜贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，置20-25℃培养箱中培养5天；
②菌液组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，按试验组操作加入菌液，测定所加的菌液的菌数；
③供试品组：取1:50的供试液，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，其他同试验组操作；胰酪大豆胨琼脂培养基置30-35℃培养箱中培养5天；沙氏葡萄糖琼脂培养基置20-25℃培养箱中培养7天；
④培养后进行需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定
试验组菌落数减去供试品组菌落数的值与菌液组菌落数的比值在0.5～2范围内即为合格；
(4)控制菌的检查
①菌液制备：
制备大肠埃希菌菌悬液；
②检查方法：
供试品组：取1：10的供试液10mL加入到含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL中，经薄膜过滤法处理，用含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，每膜不少于400mL，取滤膜，置胰酪大豆胨液体培养基500mL中，混匀，30～35℃培养18～72小时，得到培养物；取上述培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判定供试品组未检出大肠埃希菌；
阳性对照组：取1：10的供试液10mL加入到含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL中，经薄膜过滤法处理，用含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，每膜不少于400mL，取滤膜，置胰酪大豆胨液体培养基500mL中，加入10-100cfu大肠埃希菌混匀，30～35℃培养18～72小时，得到培养物；取上述培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判定阳性对照组未检出大肠埃希菌；
阴性对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10mL置含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL中，经薄膜过滤法处理，用含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，每膜不少于400mL，取滤膜，置胰酪大豆胨液体培养基500mL中，混匀，30～35℃培养18～72小时，得到培养物；取上述培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判定阴性对照组未检出大肠埃希菌。
步骤(1)中金黄色葡萄球菌菌悬液的制备方法是取经30～35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液。
步骤(1)中铜绿假单胞菌菌悬液的制备方法是取经30～35℃培养18～24小时的铜绿假单胞菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液。
步骤(1)中枯草芽孢杆菌菌悬液的制备方法是取经30～35℃培养18～24小时的枯草芽孢杆菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液。
步骤(1)中白色念珠菌菌悬液的制备方法是取经20～25℃培养2～3天的白色念珠菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液。
步骤(1)中黑曲霉孢子悬液的制备方法是取经20～25℃培养5～7天的黑曲霉的新鲜培养物，加3～5mL含0.05％聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数为50～100cfu的孢子悬液。
步骤(4)中大肠埃希菌菌悬液的制备方法是取经30～35℃培养18～24小时的大肠埃希菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50-100cfu的菌悬液。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明提供一种硝呋太尔胶囊的微生物限度检查方法，解决了硝呋太尔胶囊微生物检验中的假阴性现象，患者用药安全性高。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
(1)菌液制备
①金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌
取经30～35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液；
②白色念珠菌
取经20～25℃培养2～3天的白色念珠菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液；
③黑曲霉
取经20～25℃培养5～7天的黑曲霉的新鲜培养物，加3～5mL含0.05％(mL/mL)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数为50～100cfu的孢子悬液。
(2)供试液制备
取取硝呋太尔胶囊供试品10g，剪碎，加十四烷酸异丙酯50mL，震摇，再加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL，震摇至供试品分散均匀，倒入无菌带过滤网均质袋中，取滤液静置待油水分层，取水层制成1:10的供试液；取1:10的供试液10mL，加含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液40mL，即为1:50的供试液；
(3)需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定
①试验组：取1:50的供试液1mL，加入到含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠白胨缓冲液100mL中，经薄膜过滤法处理，用含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠白胨缓冲液分次冲洗，每膜不少于400mL，在最后一次过滤时分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液，取下滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，置30-35℃培养箱中培养3天，结果见表1，比值见表4；另外，再将加入白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液的滤膜贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，置20-25℃培养箱中培养5天，结果见表5，比值见表7；
②菌液组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，按试验组操作加入菌液，测定所加的菌液的菌数；胰酪大豆琼脂培养基上的菌数见表3，沙氏葡萄糖琼脂培养基上的菌数见表6。
③供试品组：取1:50的供试液，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，其他同试验组操作；胰酪大豆胨琼脂培养基置30-35℃培养箱中培养5天，计数结果见表2；沙氏葡萄糖琼脂培养基置20-25℃培养箱中培养7天，计数结果见表2。
④培养后进行需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定
试验组菌落数减去供试品组菌落数的值与菌液组菌落数的比值在0.5～2范围内即为合格；测定结果见表4、表7。需氧菌、霉菌和酵母菌的比值均在0.5～2范围内，检测供试品合格。
表1需氧菌试验组结果(单位：cfu)
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉
64 90 79 76 53
表2供试品组结果(单位：cfu)
需氧菌(1:40) 霉菌和酵母菌(1:40)
0 0
表3需氧菌菌液组结果(单位：cfu)
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉
70 93 85 79 56
表4需氧菌比值
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉
0.91 0.97 0.93 0.96 0.95
表5霉菌和酵母菌试验组结果(单位：cfu)
白色念珠菌 黑曲霉
69 50
表6霉菌和酵母菌菌液组结果(单位：cfu)
白色念珠菌 黑曲霉
75 58
表7霉菌和酵母菌比值
白色念珠菌 黑曲霉
0.92 0.86
(4)控制菌的检查
①菌液制备：
制备大肠埃希菌菌悬液：取经30～35℃培养18～24小时的大肠埃希菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50-100cfu的菌悬液。
②检查方法：
供试品组：取1：10的供试液10mL加入到含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL中，经薄膜过滤法处理，用含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，每膜不少于400mL，取滤膜，置胰酪大豆胨液体培养基500mL中，混匀，30～35℃培养18～72小时，得到培养物；取上述培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判定供试品组未检出大肠埃希菌；
阳性对照组：取1：10的供试液10mL加入到含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL中，经薄膜过滤法处理，用含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，每膜不少于400mL，取滤膜，置胰酪大豆胨液体培养基500mL中，加入10-100cfu大肠埃希菌混匀，30～35℃培养18～72小时，得到培养物；取上述培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判定阳性对照组未检出大肠埃希菌；
阴性对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10mL置含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL中，经薄膜过滤法处理，用含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，每膜不少于400mL，取滤膜，置胰酪大豆胨液体培养基500mL中，混匀，30～35℃培养18～72小时，得到培养物；取上述培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判定阴性对照组未检出大肠埃希菌。
试验结果见表8。
表8大肠埃希菌试验结果
供试品组 阳性对照组 阴性对照组
- + -

Claims (7)

1.一种硝呋太尔胶囊的微生物限度检查方法，其特征在于步骤如下：
(1)菌液制备
分别制备金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液；
(2)供试液制备
取硝呋太尔胶囊供试品10g，剪碎，加50mL的十四烷酸异丙酯，震摇，再加入100mL的45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，震摇，倒入无菌带过滤网均质袋中，取滤液静置，待油水分层，取水层制成1:10的供试液；取1:10的供试液10mL，加含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液40mL，即为1:50的供试液；
(3)需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定
①试验组：取1:50的供试液1mL，加入到含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠白胨缓冲液100mL中，经薄膜过滤法处理，用含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠白胨缓冲液分次冲洗，每膜不少于400mL，在最后一次过滤时分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液，取下滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，置30～35℃培养箱中培养3天；另外，再将加入白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液的滤膜贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，置20～25℃培养箱中培养5天；
②菌液组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，按试验组操作加入菌液，测定所加的菌液的菌数；
③供试品组：取1:50的供试液，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，其他同试验组操作；胰酪大豆胨琼脂培养基置30～35℃培养箱中培养5天；沙氏葡萄糖琼脂培养基置20～25℃培养箱中培养7天；
④培养后进行需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定
试验组菌落数减去供试品组菌落数的值与菌液组菌落数的比值在0.5～2范围内即为合格；
(4)控制菌的检查
①菌液制备：
制备大肠埃希菌菌悬液；
②检查方法：
供试品组：取1：10的供试液10mL加入到含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL中，经薄膜过滤法处理，用含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，每膜不少于400mL，取滤膜，置胰酪大豆胨液体培养基500mL中，混匀，30～35℃培养18～72小时，得到培养物；取上述培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判定供试品组未检出大肠埃希菌；
阳性对照组：取1：10的供试液10mL加入到含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL中，经薄膜过滤法处理，用含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，每膜不少于400mL，取滤膜，置胰酪大豆胨液体培养基500mL中，加入10～100cfu大肠埃希菌混匀，30～35℃培养18～72小时，得到培养物；取上述培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判定阳性对照组未检出大肠埃希菌；
阴性对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10mL置含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL中，经薄膜过滤法处理，用含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，每膜不少于400mL，取滤膜，置胰酪大豆胨液体培养基500mL中，混匀，30～35℃培养18～72小时，得到培养物；取上述培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判定阴性对照组未检出大肠埃希菌。
2.根据权利要求1所述的硝呋太尔胶囊的微生物限度检查方法，其特征在于步骤(1)中金黄色葡萄球菌菌悬液的制备方法是取经30～35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液。
3.根据权利要求1所述的硝呋太尔胶囊的微生物限度检查方法，其特征在于步骤(1)中铜绿假单胞菌菌悬液的制备方法是取经30～35℃培养18～24小时的铜绿假单胞菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液。
4.根据权利要求1所述的硝呋太尔胶囊的微生物限度检查方法，其特征在于步骤(1)中枯草芽孢杆菌菌悬液的制备方法是取经30～35℃培养18～24小时的枯草芽孢杆菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液。
5.根据权利要求1所述的硝呋太尔胶囊的微生物限度检查方法，其特征在于步骤(1)中白色念珠菌菌悬液的制备方法是取经20～25℃培养2～3天的白色念珠菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液。
6.根据权利要求1所述的硝呋太尔胶囊的微生物限度检查方法，其特征在于步骤(1)中黑曲霉孢子悬液的制备方法是取经20～25℃培养5～7天的黑曲霉的新鲜培养物，加3～5mL含0.05％聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数为50～100cfu的孢子悬液。
7.根据权利要求1所述的硝呋太尔胶囊的微生物限度检查方法，其特征在于步骤(4)中大肠埃希菌菌悬液的制备方法是取经30～35℃培养18～24小时的大肠埃希菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50-100cfu的菌悬液。
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