CN101857893B - 一种细菌群相同步培养的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，具体公开了一种细菌群相同步培养的方法及试剂盒。本发明所述试剂盒，包含需氧菌类培养增殖液、厌氧菌类培养增殖液、细菌L型类培养增殖液和细胞内细菌类培养增殖液。本发明所述方法及试剂盒进行细菌培养所需样品量仅为常规用量的1-2%，阳性检出率高达95%以上，细菌培养6-8小时即可判断结果，24小时获得致病菌细菌群相药物敏感数据，与循证医学的循证诊治的基本原则相吻合，具有广阔的临床应用前景。

Description

一种细菌群相同步培养的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种细菌群相的同步培养方法和直接药敏试验结果解释说明和技术标准界定设置及试剂盒。

背景技术

临床细菌培养是医院里常用的一种临床细菌病原（因）学检查方法，即用人工的办法提供细菌生长所必需的营养和环境，使人体中的临床致病菌在专门的培养基中繁殖，然后根据菌落的形态，生长特性，对营养的特殊需求和指示剂的变化等生物学特点来判断细菌类别，对细菌种属做出鉴定，指导临床用药，具有很高的应用价值。

近年来，由于广泛使用抗生素，逐渐导致耐药菌株不断出现。某些严重感染依经验疗法使用抗菌药物不当导致致病菌耐药，延误治疗时机，或因盲目追求大剂量治疗而造成药物中毒。此外，长期滥用抗菌药物，往往引起菌群失调症，给临床治疗带来严重困难，特别是广泛滥用抗菌药物导致临床致病菌出现了多层次的变异，如广泛多重耐药、种群变异等及复数菌的联合致病情形。所以当机体任何一个部位有感染时，除了准确地培养出导致感染的细菌以外，还要针对这个细菌做出抗生素敏感实验，以便准确地筛选有效的抗生素，提示所需治疗时日，帮助临床医生选用最佳药物，还可以进行流行病学调查，了解耐药菌株的流行情况，为抗菌药物的社会应用提供有关参考信息。

当前临床常用的细菌培养方法，绝大部分是高选择性需氧菌类培养/或是单一细菌培养的方法，如进行单一需氧菌类（aerobe）、单一厌氧菌类（anaerobe）、单一细菌L型类（bacteria L-form）、其他细菌类的培养，然后逐一进行鉴定后进行药敏试验。

临床医学各科在理论知识和实践经验上，对临床致病菌包括需氧菌类、厌氧菌类、细菌L型类等既可单一感染致病，又能混合感染致病的现象，普遍缺乏客观真实的认识和理解。国内标准的培养方法仍然是单一病菌为主的培养方法，4类细菌分别由医师申请单独培养。因而，当碰到疑难感染病因培养时，需开具4个申请单分别独立申请。尚无全貌查找致病菌的概念，是临床细菌培养阳性检出率过低，影响细菌培养作为感染病临床达到“循证诊、治”的重要原因，临床上出现难诊、难治的感染病例，时时发生。

目前细菌培养的缺陷存在以下几点：

1、采样量大：以血样为例，每一次培养需用检材5-10毫升血液，若同时做4类细菌培养，需抽血20-40毫升，许多病人不愿接受，特别是新生儿感染病的细菌培养；

2、细菌培养报告时间周期长，7天才能出结果；药敏报告需72小时；

3、阳性检出率低，需氧菌类培养阳性检出率小于13%；

4、忽略了临床病菌群相混合感染是临床致病菌重要的客观现象，又忽略了临床致病菌不断变异的实际状态。

5、采用先培养需氧菌如无生长，再培养厌氧菌，如无生长再培养其他细菌，耽误救治时间。

发明内容

本发明针对现有细菌培养的上述缺陷，依据细菌易于混合感染及不断变异的特性，提供一种用于细菌群相同步培养的试剂盒。

本发明所述用于细菌群相同步培养的试剂盒包含：需氧菌类培养增殖液、厌氧菌类培养增殖液、细菌L型类培养增殖液、细胞内细菌类培养增殖液。

本发明所述细菌群相是指将细菌分成需氧菌类、厌氧菌类、细菌L型类、细胞内细菌类等四类，同步培养的每一类细菌即为一类细菌群相。

本发明所述需氧菌类培养增殖液是指适宜于培养需氧菌类如铜绿假单胞菌、埃希大肠杆菌、不动杆菌、葡萄球菌类等的培养液。

本发明所述厌氧菌类培养增殖液是指适宜于培养厌氧菌类如具核梭杆菌、延展消化链球菌、索形梭菌等的培养液。

本发明所述细胞内细菌类培养增殖液是指适宜于培养胞内细菌类如布鲁杆菌、伤寒杆菌、脑膜炎球菌、支原体等的培养液。

本发明所述细菌L型类培养增殖液是指适宜于培养细菌L型类如细菌不稳定L型和细菌稳定L型的培养液。

优选地，所述需氧菌类培养增殖液的制备方法为：新鲜牛肉汤1000毫升加蛋白胨10-15克、氯化钠3.5-5克加热溶解，调PH至7.2-7.8过滤至澄清，118-121℃20-30分钟灭菌备用。

优选地，所述厌氧菌类培养增殖液的制备方法为：新鲜牛肉汤1000毫升加蛋白胨10-17克、酵母浸膏3-5克、葡萄糖5-7克、可溶性淀粉1-2克、氯化钠4-5克、醋酸钠2-3克、盐酸半胱氨酸0.5-1.0克加热溶解，调PH至7.4-7.8，100-112℃20-30分钟灭菌备用。

优选地，所述细菌L型类培养增殖液的制备方法为：新鲜牛肉汤1000毫升，加入氯化钠45-50克、蛋白胨10-15克、加热溶解，调PH至7.2-7.8，过滤至澄清，118-121℃压力下20-30分钟灭菌备用。

优选地，所述细胞内细菌类培养增殖液的制备方法为：新鲜牛肉汤1000毫升，加入蛋白胨10-17克，氯化钠3.5-5克，胆盐0.5-1.5克，加热溶解，调PH至7.2-7.8，过滤至澄清，118-121℃20-30分钟灭菌备用。

本发明还提供一种细菌群相的同步培养方法，将待检样本分别注入需氧菌类培养增殖液、厌氧菌类培养增殖液、细菌L型类培养增殖液、细胞内细菌类培养增殖液中混匀，35℃培育6-8小时。

作为优选，本发明所述同步培养方法的需氧菌类培养增殖液的制备方法为：新鲜牛肉汤1000毫升加蛋白胨10-15克、氯化钠5-7克加热溶解，调PH至7.2-7.8过滤至澄清，118-121℃20-30分钟灭菌备用。

作为优选，本发明所述同步培养方法的厌氧菌类培养增殖液的制备方法为：新鲜牛肉汤1000毫升加蛋白胨10-17克、酵母浸膏1.5-3克、葡萄糖5-7克、可溶性淀粉1-2克、氯化钠3.5-5克、醋酸钠2-3克、盐酸半胱氨酸0.5-1.0克加热溶解，过滤至澄清，调PH至7.2-7.6，118-112℃灭菌20-30分钟备用。

作为优选，本发明所述同步培养方法的细菌L型类培养增殖液的制备方法为：新鲜牛肉汤1000毫升，加入氯化钠45-50克、蛋白胨10-15克、加热溶解，调PH至7.2-7.8，过滤至澄清，118-121℃灭菌20-30分钟备用。

作为优选，本发明所述同步培养方法的细胞内细菌类培养增殖液的制备方法为：新鲜牛肉汤1000毫升，加入蛋白胨10-15克，氯化钠3-5克，胆盐0.5-1.0克，加热溶解，调PH至7.2-7.8，过滤至澄清，118-121℃下灭菌20-30分钟备用。

所述同步培养方法还包含以下步骤：观测接种了样品的四种培养增殖液，如有混浊，在无菌状态下取混浊的菌液进行细菌群相的直接药敏试验。

所述细菌群相直接药敏试验方法包括扩散法。

更优选地，所述细菌群相直接药敏试验步骤为取混浊的菌液转种于对应的药敏测试培养基，贴敷抗菌药敏纸片，在35℃培育16-18小时。所述细菌群相直接药敏试验方法24小时药敏结果报告达到阳性检出结的果60%以上。

传统的药敏试验方法是将细菌分离成纯种，进行试验，若抑菌环内出现菌落，即要重新进行重新分离成纯种，重新进行药敏测试。

本发明所述细菌群相的直接药敏试验是由不同的细菌种、型混合状态下，对不同的抗生素有不同的抗药谱所构成，其抑菌环直径按测量实际比对借鉴WHO K-B法的标准报告之。当全部的细菌出现非同一的生长/或耐药状态时，除借鉴使用WHO推荐的K-B法常规解释标准外，有下列任何情况之一，均予以补充解释说明和技术界定标准设置如下：

①、当【复数菌类】抑菌环的直径符合同一敏感（S），报告为【S】：此种药物临床可使用7日；当此种药物符合中敏（I），报告为【I】：此种药物临床可使用3-4日。

②、当【复数菌类】抑菌环直径达到S，但抑菌环内仍有少数细菌生长/或出现浅淡抑菌环状分层现象，可报告为【S^△】：此药临床可使用5天；当抑菌环内有较多菌落生长/或有多层抑菌环现象，可报告为【S^△△】：此种药物结合临床状况可用于观察治疗3天。

③、当【复数菌类】抑菌环直径达到I，但抑菌环内仍有少数细菌生长/或出现浅淡抑菌环状分层现象，可报告为【I^△】：结合临床实际状况，此药物可用于治疗2-3天。当抑菌环内有较多菌落生长/或有多层抑菌环现象，可报告为【I^△△】：结合临床实际状况，在严密观察下，此种药物可用于临床观察治疗1-2天。

④、当某药物纸片周围无抑菌环（R）或不足中敏以上结果时，应报告为【R】：临床不能用于该病例治疗；若药物纸片周围出现浓厚菌落,或多层较厚抑菌环时（仅在药物溶质的正常扩散区范围内），此种药物报告为【R×】：（疑似药物依赖菌状态）此药禁用于该例病人。

⑤、当全部试验药物均无抑菌环出现，考虑选新的药物品种重新测试，另行报告。

⑥、所述的细菌群相直接药敏试验方法，其特征在于，细菌L型类群相直接药敏测试结果的解释说明和技术界定标准设置如下：

当细菌L型类直接药敏测试平板上可肉眼观察到抑菌环，按K-B法常规标准测量判定并报告结果；当全部的细菌出现非同一的生长/或耐药状态时，除借鉴使用WHO推荐的K-B法常规解释标准外，有上述①；②；③；④；⑤任何情况，均按其解释说明和技术界定标准设置报告执行。

⑦、当细菌L型类直接药敏测试平板上肉眼不能直接观察到抑菌环时，将药敏试验平板放置于药敏测试显微镜的平台上，用物镜（1×）、目镜（5×/10×）观察测量，按下式计算抑菌环直径：

抑菌环直径（mm）=2L+6.35=2×0.05×N＋6.35

注：2L（二倍所测物体长度）＝2×0.05N；

0.05-测微尺分划板上每格相当长度（mm）；

N-所测物体在测微尺分划板上所占格数（长度）

各种抗菌药物敏感测试结果判定试用标准：

敏感【S】（抑菌环直径）≥10mm；可使用该种药物治疗5-7天；

中敏【I】（抑菌环直径）=8.0mm-9.8mm；可使用该种药物治疗3-5天。

耐药【R】（抑菌环直径）≤7.8mm；该种药物不宜用于该病例治疗。

当在显微镜下测量抑菌环并照上述公式计算出抑菌环直径，按标准比对敏感程度的技术标准（或临床可使用天数）报告之。

⑧、当测定结果符合敏感,应报告为【S】：此药物可用于临床治疗5-7天；当抑菌环直径数据符合敏感，但环内仍有少数细菌颗粒生长，此种情况应技术标准界定为【S^△】：可使用该种药物临床治疗3-5天；当抑菌环内有较多细菌颗粒（抑菌环外有更多细菌颗粒）时，应技术标准界定为【S^△△】：可结合临床实际情况使用该种药物观察治疗1-3天。

⑨、当测定结果符合中敏，应技术界定报告为【I】：此种药物可用于临床治疗3-5天；当抑菌环内仍有少数细菌颗粒生长，此种情况技术界定为【I^△】：可使用该种药物临床治疗1-3天；当抑菌环内有较多细菌颗粒（抑菌环外有更多细菌颗粒）时，技术界定为【I^△△】：可结合临床实际情况使用该种药物临床观察治疗1-2天。

⑩、当测定结果符合耐药，应报告为【R】。此药不适宜该患者使用。当测定结果符合耐药，且其药物纸片周围出现生长浓厚菌苔时/或多层抑菌环时（仅在药物溶质的正常扩散区范围内，此种情况疑似药物依赖菌出现的状态），应报告为【R×】：此药物禁用于该例病人。

当全部试验药物均无抑菌环出现，考虑选新的药物品种重新测试，另行报告。

本发明所述方法综合所获得的全部数据，筛选对4类细菌都敏感的药物，并对临床用药时日判定出建议报告，以单品种、足剂量、由静脉给药进行治疗，收到治疗的显著效果，为临床医师动态循证治疗决策提供指导数据。

本发明可用于血、骨髓、中段尿、腹水、胸水、生殖系分泌物（男精液、前列腺液；女阴道炎、子宫内膜炎等）、脑脊液、眼耳鼻喉分泌物、其它穿刺液（羊膜液、透析外排液、心包液、后穹窿、滑膜液等）、脓及术口、插管、引流分泌物、痰及呼吸道灌洗液或分泌物的细菌群相微量同步培养。

与常规细菌培养方法相比，本发明所述方法具有以下优点：

1、仅使用常规用量1-2%的待检样品；

2、阳性检出率高达≥95%以上，而常规培养法仅有≤13%；

3、细菌培养6-8小时即可判断结果，24小时获得致病菌细菌群相药物敏感数据，常规法需72小时或更长；

4、对全貌复数菌设置了需氧菌类、厌氧菌类、细菌L型类、其它菌类，可反映病菌群相混合感染及不断变异的实际状态。

5、比较全貌地培养出了感染致病菌群相并筛选出同一敏感的药物，为临床医师抗感染循证诊断、治疗及动态临床循证决策提供了新的措施。

具体实施方式：

本发明公开了一种细菌群相同步培养的方法及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法及试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明。

本发明所述用于细菌群相同步培养的试剂盒，包含：需氧菌类培养增殖液、厌氧菌类培养增殖液、细菌L型类培养增殖液、细胞内细菌类培养增殖液。

本领域技术人员公知的其它培养增殖液包括：

需氧菌类培养增殖液：牛肉膏3克、氯化钠5克蛋白胨10克蒸馏水1000ml,溶解调PH7.4-7.6，过滤分装，经121℃灭菌15分钟即成。

厌氧菌类培养增殖液：马肉或牛肉渣适量、肉浸汤适量，将做肉浸汤剩下的肉渣2-3克装入试管中，再加入PH7.6肉浸汤5ml，121℃灭菌30分钟，备用。

细菌L型类培养增殖液：牛肉浸液1000ml、氯化钠40-50克\蛋白胨20克,溶解调PH7.4-7.6，分装至小三角瓶中15ml，经121℃灭菌15分钟即成。

细胞内菌类培养增殖液：胨或多价胨5克、碳酸钙10克、蒸馏水1000ml,胆盐1克、硫代硫酸钠30克，混匀分装至试管各10ml，113℃灭菌10分钟备用；临用前每管加入0.2ml碘液，该碘液由碘6克、碘化钾5克溶于20ml蒸馏水储于褐色瓶中，混合后接种标本。

本领域技术人员也可选择其它的适宜于培养需氧菌类、厌氧菌类、细菌L型类、细胞内菌类的培养液。

以下结合实施例对本发明进行具体说明。

实施例1：制备本发明所述试剂盒（简称A_1NBC试剂盒）

①.A(需氧菌类aerobe group,A）培养增殖液-新鲜牛肉汤1000毫升加蛋白胨10-15克、氯化钠3.5-5克加热溶解，调PH至7.2-7.8过滤至澄清，分装到洁净可固定、密封的试剂瓶中，118-121℃压力下20-30分钟灭菌，监察备用。

②.An(厌氧菌类anaerobe group,An)培养增殖液-新鲜牛肉汤1000毫升加蛋白胨10-17克、酵母浸膏1.5-3克、葡萄糖5-7克、可溶性淀粉1-2克、氯化钠3.5-5克、醋酸钠2-3克、盐酸半胱氨酸0.5-1克加热溶解，调PH至7.2-7.6，分装至洁净可固定、密封的试剂瓶中，100-112℃20-30分钟灭菌，监察备用。

③.B(细菌L型类bacteria L-form group,B)培养增殖液-新鲜牛肉汤1000毫升，加入氯化钠45-50克、蛋白胨10-15克、加热溶解，调PH至7.2-7.8，过滤至澄清，分装至洁净可固定、密封的试剂瓶中，118-121℃20-30分钟灭菌，监察备用。

④.C(细胞内细菌类cell bacteria group，C)其它菌增殖培养液（按需要选择适宜培养基）。新鲜牛肉汤1000毫升，加入蛋白胨10-17克，氯化钠3.5-5克，胆盐0.5-1.5克，加热溶解，调PH至7.2-7.8，过滤至澄清，分装至洁净可固定、密封的试剂瓶中，118-121℃20-30分钟灭菌，监察备用。

根据细菌培养结果选择药敏测试系统：如需氧菌类选择MHA药敏测试琼脂、厌氧菌药敏测试血琼脂、细菌L型药敏测试培养基，适宜于其他类细菌的药敏测试培养基，进行药敏试验。

实施例2：用本发明所述方法进行临床样本的细菌培养及药敏试验

1、以无菌手续将血液样本，分别注入实施例1制备的A./An./B./C.瓶中各2滴，立即混匀；各瓶穿刺孔上用无菌棉球遮盖、固定，放入35℃孵箱培育6-8小时，观察结果。

2、如有混浊，以无菌手续分别取混浊的A/或An/或B/或C3滴菌液，立即分别转种于对应的A/An/B/C.药敏测试培养基，按类别贴敷抗菌药物纸片，如A类宜选阿米卡星、庆大霉素、青霉素、氨苄青霉素、妥布霉素、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢三嗪、红霉素、氯霉素、万古霉素、复方新诺明、环丙沙星、亚胺配能等抗菌药物纸片贴敷；如An类/B类/C类另外选择抗菌药物品种；当A、An、B、C等全部浑浊生长时，宜选择同一药物品种进行敏感测试，便于同一选药治疗，放入35℃孵箱培育16-18小时，观察测量结果。

3、.当A/An/B/C的药敏平板上出现肉眼可观察到抑菌环时，利用K-B法制定的“抑菌环直径”测量并判定报告。

如出现其它现象（如抑菌环内尚有生长的菌落或其它现象）则由袁鸿慈的专项解释说明和技术界定标准设置及临床实验经验操作进行。

本发明所述细菌群相的直接药敏试验是由不同的细菌种、型混合状态下，对不同的抗生素有不同的抗药谱所构成，其抑菌环直径按测量实际比对借鉴WHO K-B法的标准报告之。当全部的细菌出现非同一的生长/或耐药状态时，除借鉴使用WHO推荐的K-B法常规解释标准外，有下列任何情况之一，均予以补充解释说明和技术界定标准设置如下：

①、当【复数菌类】抑菌环的直径符合同一敏感（S），报告为【S】：此种药物临床可使用7日；当此种药物符合中敏（I），报告为【I】：此种药物临床可使用3-4日。

②、当【复数菌类】抑菌环直径达到S，但抑菌环内仍有少数细菌生长/或出现浅淡抑菌环状分层现象，可报告为【S^△】：此药临床可使用5天；当抑菌环内有较多菌落生长/或有多层抑菌环现象，可报告为【S^△△】：此种药物结合临床状况可用于观察治疗3天。

③、当【复数菌类】抑菌环直径达到I，但抑菌环内仍有少数细菌生长/或出现浅淡抑菌环状分层现象，可报告为【I^△】：结合临床实际状况，此药物可用于治疗2-3天。当抑菌环内有较多菌落生长/或有多层抑菌环现象，可报告为【I^△△】：结合临床实际状况，在严密观察下，此种药物可用于临床观察治疗1-2天。

④、当某药物纸片周围无抑菌环（R）或不足中敏以上结果时，应报告为【R】：临床不能用于该病例治疗；若药物纸片周围出现浓厚菌落,或多层较厚抑菌环时（仅在药物溶质的正常扩散区范围内），此药物报告为【R×】：（疑似药物依赖菌状态）此药禁用于该例病人。

⑤、当全部试验药物均无抑菌环出现，考虑选新的药物品种重新测试，另行报告。

⑥、所述的细菌群相直接药敏试验方法，其特征在于，细菌L型类群相直接药敏测试结果的解释说明和技术界定标准设置如下：

当细菌L型类直接药敏测试平板上可肉眼观察到抑菌环，按K-B法常规标准测量判定并报告结果；当全部的细菌出现非同一的生长/或耐药状态时，除借鉴使用WHO推荐的K-B法常规解释标准外，有上述①；②；③；④；⑤任何情况，均按其解释说明和技术界定标准设置报告执行。

⑦、当细菌L型类直接药敏测试平板上肉眼不能直接观察到抑菌环时，将药敏试验平板放置于药敏测试显微镜的平台上，用（物镜）1×、目镜5×/10×观察测量，按下式计算抑菌环直径：

抑菌环直径（mm）=2L+6.35=2×0.05×N＋6.35

注：2L（二倍所测物体长度）＝2×0.05N；

0.05-测微尺分划板上每格相当长度（mm）；

N-所测物体在测微尺分划板上所占格数（长度）

各种抗菌药物敏感测试结果判定试用标准：

敏感【S】（抑菌环直径）≥10mm；可使用该种药物治疗5-7天；

中敏【I】（抑菌环直径）=8.0mm-9.8mm；可使用该种药物治疗3-5天。

耐药【R】（抑菌环直径）≤7.8mm；该种药物不宜用于该病例治疗。

当在显微镜下测量抑菌环并照上述公式计算出抑菌环直径，按标准比对敏感程度的技术标准（或临床可使用天数）报告之。

⑧、当测定结果符合敏感,应报告为【S】：此药物可用于临床治疗5-7天；当抑菌环直径数据符合敏感，但环内仍有少数细菌颗粒生长，此种情况应技术标准界定为【S^△】：可使用该种药物临床治疗3-5天；当抑菌环内有较多细菌颗粒（抑菌环外有更多细菌颗粒）时，应技术标准界定为【S^△△】：可结合临床实际情况使用该种药物观察治疗1-3天。

⑨、当测定结果符合中敏，应技术界定报告为【I】：此种药物可用于临床治疗3-5天；当抑菌环内仍有少数细菌颗粒生长，此种情况技术界定为【I^△】：可使用该种药物临床治疗1-3天；当抑菌环内有较多细菌颗粒（抑菌环外有更多细菌颗粒）时，技术界定为【I^△△】：可结合临床实际情况使用该种药物临床观察治疗1-2天。

⑩、当测定结果符合耐药，应报告为【R】。此药不适宜该患者使用。当测定结果符合耐药，且其药物纸片周围出现生长浓厚菌苔时/或多层抑菌环时（仅在药物溶质的正常扩散区范围内，此种情况疑似药物依赖菌出现的状态），应报告为【R×】：此药物禁用于该例病人。当全部试验药物均无抑菌环出现，考虑选新的药物品种重新测试，另行报告。

本发明所述细菌L型类群相，包括细菌稳定L型和细菌不稳定L型。

当全部试验药物均无抑菌环出现，考虑选新的药物品种重新测试，另行报告。

药敏结果报告及时间：依据上述药敏测量数据，单品种、足剂量、由静脉给药治疗的要求，第24小时向临床报告之，按直接药敏试验的数据选中的敏感药物实行治疗。

实施例3：本发明所述方法进行未名热病例临床样本的细菌培养及药敏试验

未名热病例：男，1岁7个月，发热38-40℃，经系统治疗未缓解，转入某儿童医院住院，行血液常规细菌培养，培养出铜绿假单胞菌，经药敏测试，对先锋5号敏感，临床经静脉输注用药31天，无缓解，体温仍波动于38-39℃之间。

用本发明所述方法和试剂盒进行血液培养，采颈静脉血0.5毫升，以无菌手续注入A.An.B.C.各2滴立即混匀，放置35℃孵箱培育6-8小时，观察A.An.B.三瓶均有浑浊，结果显示，该未名热病人应为复数菌混合感染（需、厌氧菌、细菌L型混合感染），即转种于各相对应的药敏培养基，分别贴敷药敏纸片，放置35℃孵箱培育16-18小时，观察测量结果，如表1：

表1、直接药敏试验测试结果

注：A-需氧菌类；An-厌氧菌类；B-细菌L型类；

S-敏感；I-中度敏感；R-耐药；

CZ-先锋5号；C-氯霉素；AN-阿米卡星；TM-妥布霉素；SXT-复方新诺明；E-红霉素；CFP-头孢哌酮；PIP-氧哌嗪青霉素；CFX-头孢氨苄；CB-羧苄青霉素；CIP-环丙沙星；OFL氧氟沙星；P-青霉素；NOR-诺氟沙星；VA-万古霉素。

选用阿米卡星（AN）按患儿体重计算用药，第一次由静脉给药，1小时后体温即下降至37.2℃，继续用药六天，体温完全恢复正常。出院后随访3个月未复发。

经细菌实验室继续分离细菌至纯种及细菌L型回复成细菌型并分离至纯种，鉴定为如表2：

表2细菌种群分纯分类鉴定结果

注：N-未培养 BLU-细菌不稳定L型 BLS-细菌稳定L型

未名热/不明原因发热（FUO）是细菌感染为重要的病因，经过多年的研究和临床实践，基本上做到了在不使用解热镇痛剂和任何免疫抑制剂参与下，抗感染治疗7-12天体温恢复至正常，并经随访无复发的。

实施例4：本发明所述方法进行银屑病病例临床样本的细菌培养及药敏试验

银屑病（Psoriasis）西医曾称牛皮癣，中医称白疕，是一种病因不清，诱因繁杂，症状具有红斑、丘疹、鳞屑等慢性、炎症性、反复发作的皮肤病，同一病理过程，临床不同阶段出现不同表现，临床分为寻常、脓疱、红皮病、关节病等四型。银屑病被认为是病菌诱发，天然免疫功能失调而长期形成的疾病过程。

选择1992年12月至2000年6月明确诊断为银屑病的病例，治疗全程均经血流细菌群相同步培养并选敏感药物治疗的病例26例，其中男性12例、女性14例；年龄最大72岁、最小6岁，平均32.21岁；患病时间最长60年、最短4个月，平均14.80年；治疗时间最长260d、最短48d，平均104.12d。

诊断标准：入院体检皮损覆银白色鳞屑、薄膜现象、出血点（Auspitz’s征）等症齐全；或薄膜和出血点现象缺如，皮损仅有银白色鳞屑，过去曾被诊断为银屑病，并长期按银屑病治疗者。

治愈标准

⑴治愈：皮损全部愈合，原皮损部位仅遗留较正常皮肤色泽浅淡的“色素减退斑”或皮损部位因涂擦外用药物遗留“色素沉着斑”；

⑵好转：愈合面积≥95%中止治疗；

⑶未愈：愈合面积≤5%中止治疗。

以无菌手续采静脉血0.5ml同步进行需氧菌类（Aerobe group,A）、厌氧菌类（anaerobe group,An）、细菌L型类（bacteria L-form group,L）、细胞内菌类（cell bacteria group,C）增殖培养，然后分别按细菌类群相直接进行药敏测试。培养周期每7-12天培养一次。

依据药敏测试结果，选敏感的抗菌药物单品种、足剂量由静脉给药，住院治疗，三个月为一个疗程。

银屑病26例，全身性皮损25例，其中特重6例，严重8例，中等6例，较轻6例；结果痊愈17例，好转8例，未愈1例。（见表3）好转的病例大多因治疗中不能准确休息或过分挠抓，迁延治疗周期，影响愈合效果，中止治疗。

表3治疗结果

用细菌群相同步培养方法和直接药敏测试技术，对患者静脉血进行培养和药敏测试，选敏感药单品种、足剂量由静脉给药，3个月为一个疗程。

细菌培养结果：26例银屑病患者培养出蜡样芽孢杆菌、玫瑰微球菌各1株；从细菌L型回复成细菌型鉴定出蜡样芽孢杆菌、卡他布兰汉氏菌、埃希氏大肠杆菌各1株，其余（357例次）为细菌稳定L型。痊愈17例（65.38%），好转8例（30.77%），未愈1例（3.85%）。

从循证医学（Evidenci-based medicine,EBM）出发，本文26例患者的血流培养结果全部同步培养出需氧菌或厌氧菌或缺壁细菌、胞内细菌等，每例次均作了复数菌的直接药物敏感试验，选敏感药物单品种、足剂量由静脉给药，收到了比较显著的治疗效果，按期治愈了17例（65.39%），好转8例（30.77%），该学术思路和临床治疗措施设计及临床实践过程，符合EBM客观的实际要求。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在遵循、不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为在本发明基础之上的改进与润饰，属本发明的权利要求保护范围。

Claims (5)

1.一种用于细菌群相同步培养的试剂盒，包含：需氧菌类培养增殖液、厌氧菌类培养增殖液、细菌L型类培养增殖液、细胞内细菌类培养增殖液； 

所述需氧菌类培养增殖液的制备方法为：新鲜牛肉汤1000毫升加蛋白胨10-15克、氯化钠5-7克加热溶解，调pH至7.2-7.8过滤至澄清，118-121℃灭菌20-30分钟备用； 

所述厌氧菌类培养增殖液的制备方法为：新鲜牛肉汤1000毫升加蛋白胨10-17克、酵母浸膏1.5-3克、葡萄糖5-7克、可溶性淀粉1-2克、氯化钠3.5-5克、醋酸钠2-3克、盐酸半胱氨酸0.5-1.0克加热溶解，过滤至澄清，调pH至7.2-7.6，118-112℃灭菌20-30分钟备用； 

所述细菌L型类培养增殖液的制备方法为：新鲜牛肉汤1000毫升，加入氯化钠45-50克、蛋白胨10-15克、加热溶解，调pH至7.2-7.8，过滤至澄清，118-121℃灭菌20-30分钟备用； 

所述细胞内细菌类培养增殖液的制备方法为：新鲜牛肉汤1000毫升，加入蛋白胨10-15克，氯化钠3-5克，胆盐0.5-1.0克，加热溶解，调pH至7.2-7.8，过滤至澄清，118-121℃下灭菌20-30分钟备用。 

2.一种非疾病诊断或治疗目的的细菌群相的同步培养方法，其特征在于，将样本分别接种于权利要求1所述需氧菌类培养增殖液、厌氧菌类培养增殖液、细菌L型类培养增殖液、细胞内细菌类培养增殖液中混匀，35℃培育6-8小时。 

3.根据权利要求2所述的同步培养方法，其特征在于，还包含以下步骤：观测接种了样品的四种培养增殖液，如有混浊，在无菌状态下取混浊的菌液进行细菌群相的直接药敏试验。 

4.根据权利要求3所述的同步培养方法，其特征在于，所述细菌群相的直接药敏试验方法包括扩散法。 

5.根据权利要求3所述的同步培养方法，其特征在于，所述细菌群相的直接药敏试验步骤为取混浊的菌液转种于对应的药敏测试培养基，贴敷抗菌药物纸片，于35℃培育16-18小时。