CN102973633B

CN102973633B - 一种抗细菌粘附口服液的制备

Info

Publication number: CN102973633B
Application number: CN201210581948.1A
Authority: CN
Inventors: 杨再昌; 杜润孜; 陆伦维; 杨小生
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2032-12-28
Also published as: CN102973633A

Abstract

本发明公开了一种筛选抗细菌粘附抑制剂的新方法和一种本发明的抗细菌粘附口服液的制备，本发明所述的新方法为使用特殊形状的载玻片浸入液体培养基中供细菌粘附，培养基中加入被筛选样本，通过显微图像分析判断抗细菌粘附药效；本发明涉及的抗细菌粘附口服液的原料为冷水花、金银花和茯苓，经过提取、配液、发酵、冷冻、离心工艺制备，具有抗细菌粘附、抗肠道、尿道感染和抗感冒的药效。

Description

一种抗细菌粘附口服液的制备

技术领域

本发明涉及一种筛选抗细菌粘附抑制剂的新方法和一种抗细菌粘附口服液的制备。

背景技术

抗生素为治疗和预防细菌感染做出了重大贡献，但是由于抗生素的广泛使用（包括滥用），细菌耐药性问题已经成为严重威胁人类健康的重大问题。现有抗菌药物的特征是破坏细菌的生命功能，如干扰细菌细胞壁的合成、破坏细菌DNA的复制或蛋白质的合成等，正是这些作用机制的选择压力，促进了耐药菌株的出现。为解决细菌的耐药性问题，一种新的抗菌药物研发思路逐渐形成，即研究以抑制细菌毒力因子或阻断细菌与宿主细胞的联系为作用机制的新型抗菌药物。

细菌都能表达粘附素（adhesin），环境中的大部分细菌都能粘附到一定界面而形成固定群落。粘附素有两类，即菌毛（pili，fimbriae）和非菌毛粘附物质（afimbrial adhesin）。病原菌粘附到宿主细胞表面是细菌感染的关键步骤，比如呼吸道、泌尿道、消化道的细菌感染都涉及粘附问题。此外，在细菌形成生物膜（biofilm）的初期，细菌粘附起重要作用。细菌生物膜能保护细菌逃避机体的免疫应答、屏蔽抗菌药物、削弱机体内部流体剪切力对细菌的作用，并引起二次感染。因此，细菌粘附抑制剂的研究近年来受到广泛关注。

目前筛选细菌粘附抑制剂的方法主要采用结晶紫染色比色法，具体方法如下：将细菌接种在含液体培养基的96孔板中，试验样本加入液体培养基中，不加样本的做阴性对照，培养一定时间后，漂洗培养板，去除悬浮细菌，自然干燥，往板孔内加入结晶紫溶液，再洗去结晶紫溶液，然后加入一定量甲醇溶液，在540nm测定吸光值，吸光值越大表明粘附在孔表面的细菌越多，抗细菌粘附抑制剂能防止细菌粘附，因此，被筛选样本如果有抑制细菌粘附的作用，则吸光值小。这种方法的优点是能一次完成多个样本的筛选，缺点是可能出现假阴性结果，因为一些样本自身可被孔表面吸附，并能被结晶紫着色，显示的吸光值并不是因细菌粘附形成的。发现更客观的方法对筛选抗细菌粘附抑制剂具有重大意义。

尽管对细菌的粘附现象及其危害已经取的较大进展，但是迄今为止，没有一种抗细菌粘附抑制剂进入临床，目前，对细菌引起的消化道、呼吸道、泌尿道感染的治疗依然依赖大剂量给予抗生素的策略，加剧了耐药菌的出现和二次感染的发生。所以发现具有抗细菌粘附的制剂具有重要的社会价值和经济利益。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：制备抗细菌粘附的口服液。

本发明的另外一个目的是：克服传统方法在筛选抗细菌粘附抑制剂时可能导致假阴性的缺点，本发明提供了一种能直观判断被筛选样本是否具有抗细菌粘附的方法。

本发明的技术方案：

一种抗细菌粘附口服液，配方包含：冷水花40克、金银花60克和茯苓100克，并制成口服液。

一种抗细菌粘附口服液的制备方法，冷水花、金银花混合，水煎煮3次，合并煮液，浓缩后干燥，得到混合水提取A；茯苓用水煎煮，煮液冷却后过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，萃取物回收乙酸乙酯后干燥，得到浅黄色干粉B；取10克的混合水提取A和2克干粉B，加入100ml自来水中，加热溶解后灭菌，冷却后加入1ml的红茶菌菌液，置30℃培养箱静置培养7-9天，待pH值降到4时，停止发酵，过滤得到发酵液，发酵液冷冻处理48小时，解冻后高速离心除菌，上清液无菌罐装，置4℃冰箱保存。

一种筛选抗细菌粘附抑制剂的方法，将灭菌的普通肉汤加入无菌培养皿中，放入一张五边形的无菌载玻片，载玻片的一端浸入肉汤中，另一端架在培养皿边缘上，先加入灭菌上述上清液，再加入细菌悬液，阴性对照不加样本溶液；将培养皿置37℃培养箱培养24小时，然后，取出载玻片，在无菌水中漂洗，将接触肉汤一面火焰固定，结晶紫染色，置显微镜下观察，导出图像。

本发明达到的有益效果

本发明制备的抗细菌粘附口服液能抑制大肠杆菌的粘附，最小有效浓度为1%（V/V）。小鼠实验表明，本发明的抗细菌粘附口服液能终止肠炎沙门氏菌、大肠杆菌的人工感染，能有效治疗兔尿道大肠杆菌的人工感染。志愿者试验表明，本发明的抗细菌粘附口服液具有抗肠道感染、尿道感染的作用，还具有治疗感冒的药效。

水提取A和干粉B在水中加热溶解后，口感不佳，用红茶菌发酵后，口味以酸为主，口感得到提高。

本发明能直观显示细菌粘附的图像，直观判断被筛选样本是否抗细菌粘附。

本发明的抗细菌粘附口服液志愿者口服治疗效果

案例一，彭某，男，49岁，贵州大学教师，长期胃肠道不适，腹泻，口服本发明的抗细菌粘附口服液10毫升，仅服用3次，腹泻停止，消化功能正常，体况变好。

案例二，田某，男，34岁，贵州大学教师，感冒不适，咽喉肿痛，口服本发明的抗细菌粘附口服液20毫升，仅服用1次即痊愈。

案例三，杨某，男，17岁，中学生，因吃烤肉，上吐下泻，口服本发明的抗细菌粘附口服液10毫升，仅服用1次即痊愈。

案例四，杨某，男，49岁，贵州大学教师，尿道感染，排尿有烧妁感，尿频，口服本发明的抗细菌粘附口服液20毫升，仅服用1次即痊愈。

案例五，杨某，53岁，公务员，长期饮酒，胃肠不适多年，口服本发明的抗细菌粘附口服液10毫升，服用73次，消化功能正常，体况变好。

具体实施方式

实施例1：本发明的抗细菌粘附口服液的制备

一、材料与方法

（1）材料：冷水花根茎采自贵阳市雷打岩峡谷、金银花采自贵阳市情人谷、茯苓购自贵州省黎平县九潮乡。冷水花根茎切碎后阴干，金银花阴干，茯苓去皮后切成丁或片，阴干备用。红茶菌购自湖南岳阳市红茶菌培育研究中心。

（2）方法：冷水花干燥颈根400克、金银花600克，加水6升分三次煎煮，得到滤液4升，浓缩得到浸膏，浸膏置水浴蒸干，得到水提物A80克。茯苓1000克用水4升分三次煎煮，得到滤液2升，静置过夜，虹吸得到上清液1.8升，用乙酸乙酯萃取，萃取液回收后干燥得到浅黄色干粉B20克。取10克的水提取A和2克干粉B，加入100ml自来水中，加热溶解后灭菌，冷却后加入1ml的红茶菌菌液，置30℃培养箱静置培养7天左右，待pH值降到4时，停止发酵，过滤得到发酵液80ml。发酵液置三角烧瓶-20℃冰箱放置48小时后，室温解冻，解冻液离心（4000转/分）10分钟，收集上清液（60ml），置三角烧瓶用硅胶塞加盖，0-4℃冰箱保存，即为本发明的抗细菌粘附口服液。定期（7、15、30、60日）检测pH值、细菌总数、霉菌总数、大肠杆菌数。

二、结果

本发明的抗细菌粘附口服液为棕红色液体，口味酸、微苦。pH值、细菌总数、霉菌总数、大肠杆菌数检测见表1。

经定期检测，本发明的抗细菌粘附口服液存放60天，pH值升高，估计与酸性成分的挥发有关，因为硅胶塞系有孔材料。另外存放60天后可见少许沉淀物。

三、讨论

红茶菌是酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的共生体，能利用碳源发酵产生葡萄糖醛酸、醋酸、乳酸等酸性物质。水提取A和干粉B在水中加热溶解后，口感不佳，用红茶菌发酵后，口味以酸为主，口感得到提高。因为发酵液体的酸性物质有挥发性，保存时应密闭，保质期以60日为宜。

实施例2：本发明的抗细菌粘附口服液抗细菌感染动物试验

一、材料与方法

（1）材料：大肠杆菌 U07、肠炎沙门氏菌 ATCC 13076、昆明小鼠、新西兰白兔。

（2）方法

a、小鼠人工感染大肠杆菌、肠炎沙门氏菌试验与治疗试验。昆明小鼠购自贵阳医学院动物中心。小鼠分为感染模型组(给水)、本发明的抗细菌粘附口服液组（三个计量，0.1、0.3、0.6 ml/mouse）、阿莫西林组（10mg/mouse），红茶菌液组（0.6 ml/mouse），冷金苓水溶液组（即未经红茶菌发酵）（0.6 ml/mouse），每组12只小鼠，雌雄各半。小鼠禁食12小时后，口服0.2ml（1×10⁸CFU/ml）细菌悬液（钝针头插入胃中注射），1小时后，开始口服给药（3次/日），连续给药3天。每天观察记录小鼠的发病死亡情况。试验结束后对发病或死亡小鼠小肠触片镜检。

b、兔尿道人工细菌感染与治疗试验。新西兰白兔购自贵阳医学院动物中心。兔禁食、水12小时，用乙醚麻醉，腹部剪毛消毒，行开腹术，暴露膀胱，用注射器抽出余尿，再从输尿管注入大肠杆菌 U07（1×10⁸CFU/ml）0.5ml，缝合创口，第二天开始用导尿管收集尿液并镜检。如发现大肠杆菌并伴随白细胞或脓细胞，视为尿道人工感染成功（与正常兔尿液对照）。将感染成功的兔分为三组，即模型组（给水）、本发明的抗细菌粘附口服液组（三个计量，2、4、6 ml/rabbit）、阿莫西林组（100mg/ rabbit），红茶菌液组（6 ml/ rabbit），冷金苓水溶液组（即未经红茶菌发酵）（6 ml/ rabbit），每组5只（均为雌性），每天口服给药3次，连续给药3天，最后一次给药12小时后，检查尿液的大肠杆菌数和炎性细胞数。

二、结果

从表3看出，模型组小鼠死亡严重，死亡主要发生在感染后第1和第2天。本发明的抗细菌粘附口服液（0.3-0.6ml/mouse）能明显降低死亡情况，与阿莫西林基本持平。红茶菌液也能降低小鼠死亡数，说明红茶菌液本身也有抗感染作用，本发明的抗细菌粘附口服液低剂量组（0.1ml/mouse）与红茶菌液的保护效果较接近。冷金苓水溶液未经发酵同样具有抗感染作用，但在同等剂量下，比发酵液效果差。从镜检结果看，正常小鼠12指肠粘膜细胞基本无细菌存在，人工感染大肠杆菌后，大量细菌粘附在细胞表面，本发明的抗细菌粘附口服液治疗后，粘附在细胞表面的细菌大大减少。从表4看出，本发明的抗细菌粘附口服液具有抗尿道感染的作用，尤其在抗炎方面优于阿莫西林，说明本发明的抗细菌粘附口服液除抗细菌粘附外，还有抗炎药效。阿莫西林在减少尿液大肠杆菌数量方面效果最好，但是尿液中的炎性细胞降低不明显。红茶菌液具有抗菌作用，抗炎作用不强。冷金苓水溶液未经发酵任然具有抗尿道感染作用，但在同等剂量下，其药效没有发酵液强。

表2 本发明的抗细菌粘附口服液对小鼠人工感染大肠杆菌、肠炎沙门氏菌的保护效果

组别	N	第1天死亡数	第2天死亡数	第3天死亡数	总死亡数
						模型组	12	4/5*	6/6	0/0	10/11
冷金苓组0.1ml/mouse	12	3/4	1/2	0/0	4/6
						冷金苓组0.3ml/mouse	12	2/2	0/0	0/0	2/2
冷金苓组0.6ml/mouse	12	1/1	0/0	0/0	1/1
						阿莫西林组	12	1/1	0/1	0/0	1/2
红茶菌液组0.6ml/mouse	12	3/4	2/2	0/0	5/6
						冷金苓水溶液0.6ml/mouse	12	2/2	0/1	0/0	2/3

*注：4/5指的是4只小鼠死于大肠杆菌感染，5只死于沙门氏菌感染。

表3 本发明的抗细菌粘附口服液对人工尿道感染的治疗效果

组别	N	大肠杆菌数（个/毫升）	炎性细胞数（个/毫升）	总死亡数
					模型组	5	1000±202	612±108	1
冷金苓组2ml/ rabbit	5	704±120	206±142	0
					冷金苓组4ml/ rabbit	5	106±48	112±118	0
冷金苓组6ml/ rabbit	5	34±28	88±42	0
					阿莫西林组	5	28±12	486±122	0
红茶菌液组6ml/ rabbit	5	136±24	406±104	0
					冷金苓水溶液6ml/ rabbit	5	104±62	102±78	0

三、讨论

体内抗感染试验表明，本发明的抗细菌粘附口服液具有抗肠道和尿道感染作用。本发明的抗细菌粘附口服液的杀菌作用并不强，远远不如阿莫西林，但是体内作用并不比阿莫西林弱，单纯依靠杀菌这一因素是无法解释其药效的。结合体外抗细菌粘附试验和镜检图像，本发明的抗细菌粘附口服液抗细菌粘附是其发挥抗感染的机制之一。

红茶菌具有抗菌作用，冷金苓水溶液经红茶菌发酵后，不但改善了其口感，还提高了抗感染药效，红茶菌液与冷金苓水溶液存在相加效应。

实施例3：基于培养液载玻片浸入法测定药物的抗细菌粘附作用

一、材料与方法

（1）实验材料：普通肉汤、利福霉素、本发明的抗细菌粘附口服液、大肠杆菌 U07株（分离自临床尿道感染病人）。

（2）实验方法

（a）结晶紫显色法（传统方法）：利福霉素为阳性对照药，利福霉素先用少量DMSO（二甲基亚砜）溶解，再用普通肉汤稀释（DMSO终浓度小于0.5%）成2、4、8

的溶液（实验前测得利福霉素对大肠杆菌 U07株的最小抑菌浓度（MIC）为16

）。本发明的抗细菌粘附口服液用普通肉汤稀释成0.5、1、2%（V/V）的溶液（试验前测得，其对大肠杆菌 U07株的最小抑菌浓度为5%），阴性对照为不含药物的普通肉汤。分别取上述不同普通肉汤加入96孔板，每孔190

，然后每孔加入大肠杆菌 U07株细菌悬液（1×10⁸CFU/ml）10

，每孔总体积为200

。培养板放入37℃培养箱中培养24小时。培养结束后，弃去培养液，用灭菌磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗培养板3次，将培养板吹干，每孔加入结晶紫溶液（0.4%）100

染色10分钟，弃去结晶紫溶液，用PBS液漂洗3次，每孔加入甲醇250，用酶标仪测定540nm的吸光值（OD）。

抑制率（%）=（OD_阴性对照值-OD_样本值）/ OD_阴性对照值×100%

(b) 载玻片浸入法：将载玻片制备成5边形，灭菌备用。实验样本的浓度、稀释方法同上。在直径为60mm的培养皿中分别加入阳性对照肉汤、样本肉汤和阴性对照肉汤10ml，将载玻片浸入肉汤中，玻片一端架在培养皿边缘，加入上述菌液1ml，盖上培养皿，放入37℃培养箱中培养24小时。培养结束后，弃去培养液，用灭菌磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗载玻片3次，用结晶紫染色2分钟，置显微镜下观察，并记录图像。

二、结果

从表4看出，结晶紫显色法试验表明，本发明的抗细菌粘附口服液具有抗细菌粘附作用，但是随着浓度增加，抗细菌粘附作用反而逐渐下降。在亚抑菌浓度下，利福霉素能有效抑制细菌粘附，呈典型的量效关系。

采用载玻片浸入法测定本发明的抗细菌粘附口服液的抗细菌粘附作用。阴性对照有大量细菌粘附在载玻片上，加利福霉素（8

）的玻片未见细菌，仅有极少量渣滓，本发明的抗细菌粘附口服液（1%）有大量药物渣滓，仅见极个别细菌。

三、讨论

按照结晶紫显色法的试验结果，本发明的抗细菌粘附口服液具有抗细菌粘附作用，但是随着浓度增加，抗细菌粘附作用反而逐渐下降。毫无疑问，这是非常荒唐的结果。采用载玻片浸入法，当本发明的抗细菌粘附口服液浓度为1%时，仅见个别细菌粘附在玻片上，但是可见大量药物渣滓粘附。可见，药物渣滓能被粘附并被结晶紫染色。用96孔板试验时，大量药物渣滓被着色，测定所得的吸光值包含了药物的背景颜色，因此随着浓度增加，抗细菌粘附作用反而逐渐下降。因为浓度越高，被粘附的成分越多，OD值越大，即使样本具有抗细菌粘附作用，也会被样本的背景颜色干预而得出无效的结论。中草药粗提物成分十分复杂，采用96孔板进行试验，肯定有部分成分被粘附到孔壁或孔底。对中草药进行抗细菌粘附筛选不能采用结晶紫显色法，必须采用本发明的载玻片浸入法才能得出客观结论。

Claims

1.一种抗细菌粘附口服液，其特征在于：配方由冷水花40克、金银花60克和茯苓100克组成，并制成口服液；其制备方法为，冷水花、金银花混合，水煎煮3次，合并煮液，浓缩后干燥，得到混合水提取A；茯苓用水煎煮，煮液冷却后过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，萃取物回收乙酸乙酯后干燥，得到浅黄色干粉B；取10克的混合水提取A和2克干粉B，加入100ml自来水中，加热溶解后灭菌，冷却后加入1ml的红茶菌菌液，置30℃培养箱静置培养7-9天，待pH值降到4时，停止发酵，过滤得到发酵液，发酵液冷冻处理48小时，解冻后高速离心除菌，上清液无菌罐装，置4℃冰箱保存。