CN112472740B - 用于制备防治奶牛乳房炎的中草药复方制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于制备防治奶牛乳房炎的中草药复方制剂及其应用,通过对33味药材进行筛选,最终采骆驼蓬子、黄连、小檗果、阿魏相配伍,形成组方用于制备防治奶牛乳房炎的中草药复方制剂,该中草药方剂的各组复方提取物均对临床常见3种奶牛乳房炎致病菌有较好的抑制作用。通过无菌检查法及装量检查,证明复方乳房灌注剂,可应用于后续临床试验。通过进行较为全面的实验室安全性评价,发现各组复方乳房灌注剂对试验动物未产生急性毒性反应、过敏性反应、对皮肤和黏膜不具有刺激性,这对于防治奶牛乳房炎的具有广泛的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及中兽药的研发技术领域。具体地,本发明涉及一种防治奶牛乳房炎的中草药方剂技术领域。
背景技术
奶牛乳房炎由多种病原微生物感染引起,是奶牛生产中最常见、造成经济损失最大的疾病之一。人吃了患乳房炎的牛奶,会引起腹泻、呕吐和发烧等症状。因此,加强对奶牛乳房炎,在生产实践中具有重大意义。现有的奶牛乳房炎治疗多采用抗生素注射的方式,但存在抗生素残留的问题会严重影响奶品质,采用中草药进行治疗可以克服抗生素残留的问题。现有部分使用中草药进行奶牛乳房炎治疗的技术方案,但多采用熬煮灌服的方式,作用缓慢药效不显著。且现有报道中的用于防治奶牛乳房炎的中草药方剂菌存在成份复杂,药品质控制较难,治疗效果并不理想。
发明内容
针对现有技术中在防治奶牛乳房炎的方式成份复杂、易残留、具有刺激性的技术现状,现有技术也未见有关专门针对用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂的中草药方剂的报道。本发明旨在于提供一种用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂的中草药方剂及其应用,以骆驼蓬子、黄连、小檗果、阿魏为主要组分,创造性的提供一种用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂的中草药方剂及其应用,与现有技术相比,该中草药方剂对临床常见3种奶牛乳房炎致病菌有较好的抑制作用。且对试验动物未产生急性毒性反应、过敏性反应、对皮肤和黏膜不具有刺激性,这对于防治奶牛乳房炎的具有广泛的实用价值。
本发明提供一种用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂的中草药方剂,该方剂包括:骆驼蓬子、黄连、小檗果、阿魏。
优选的,本发明提供一种用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂,按照重量份数计,包括骆驼蓬子60-15份、黄连20-5份、小檗果60-15份、阿魏10-5份。
更优选的,本发明提供一种于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂,按照重量份数计,包括骆驼蓬子60份、黄连20份、小檗果15份、阿魏10份。
进一步,本发明提供的上述中用于制备防治奶牛乳房炎的中草药复方制剂水溶液在制备防治奶牛乳房炎治疗药物中的应用。
本发明充分依据骆驼蓬子能够祛风湿,解郁;黄连能够清热燥湿,泻火解毒,用于湿热痞满,痈肿疔疮,外治湿疹,湿疮,耳道流脓;小檗果具有清热燥湿泻火解毒抗菌消炎的功效。阿魏能够消积,化瘕,散痞。如何根据上述采用的药材能够进行组方,不是随意选择中草药组方,特别是根据发明验证采用特定的用量配比,确保实现用于制备防治奶牛乳房炎具有显著突出的技术效果,经过系列发明获得上述选定的药材和选择的用量配比。
本发明通过提供骆驼蓬子、黄连、小檗果、阿魏按照特定配比相配伍,采用以上诸药合用特定用量配比,清热解毒、消肿散结、活血化瘀相辅相成。按照该方,制定恰当配比,便可实现既能对症又能对因,使用中草药方剂达到治疗防治奶牛乳房炎病变目的,通过乳房灌注机黏膜试验炎,验证了采用本发明提供一种全新组成、疗效快、疗效好、药效稳定、成本低廉的防治奶牛乳房炎的中草药方剂,使用无毒副作用,基本无复发,成本较低和方便施治的防治奶牛乳房炎的中草药方剂,具有巨大的应用前景。
通过实施本发明具体的发明内容,可以达到以下效果:
1、本发明提供一种用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂,经临床观察,确证是一种全新组成、疗效快、疗效好、药效稳定、成本低廉的用于防治奶牛乳房炎的中草药方剂,该中草药方剂能够有效的防治奶牛乳房炎,这对于防治奶牛乳房炎的具有广泛的实用价值。
2、本发明提供一种用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂,经临床观察,体外抗菌和体内抗炎活性显著,检测各组复方提取物对奶牛乳房炎致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌具有较好的抑制作用。
3、本发明提供一种用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂,经临床观察,本发明所提供的各个复方乳房灌注剂对试验动物未产生急性毒性反应、过敏性反应、对皮肤和黏膜不具有刺激性,可安全用于实验动物。
附图说明
图1所示为复方对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响图。
图2所示为复方对大肠杆菌生长曲线的影响图。
图3所示为复方对无乳链球菌生长曲线的影响图。
图4所示为对照组乳腺组织病理切片(H.E.200×)图。
其中图A~C分别为阴性对照组24h、48h和72h乳腺组织病理切片。
图5所示为模型组Ⅰ乳腺组织病理切片(H.E.200×)图。
其中图D~F分别为模型组Ⅰ24h、48h和72h乳腺组织病理切片。
图6所示为生理盐水对照组乳腺组织病理切片(H.E.200×)图。
其中图A~D分别为阴性对照组0h、24h、48h和72h乳腺组织病理切片。
图7所示为环丙沙星组乳腺组织病理切片(H.E.200×)图。
其中图A~D分别为阴性对照组0h、24h、48h和72h乳腺组织病理切片。
图8所示为复方乳腺组织病理切片(H.E.200×)图。
其中图A~D分别为阴性对照组0h、24h、48h和72h乳腺组织病理切片。
具体实施方式
下面,举实施例说明本发明,但是,本发明并不限于下述的实施例。
本发明中涉及的设备和材料:
本发明所采用的试剂为:骆驼篷子、黄连、小檗实、蓝堇、甘草、睡莲花、苦蒿茎、香青兰、龙葵果、紫草、马齿苋、牛舌草、破布木实、猫儿草、无花果叶、玉米须、车前草、苦豆子、苍耳、药蜀葵、菝葜、芦根、一枝蒿、黄蒿、天山堇菜花、菊苣子、车前子、洋甘菊、苦蒿根、苦蒿子、苦蒿全草、蒸馏水、乙醇、环丙沙星、氧佛沙星、庆大霉素、林可霉素、青霉素、链霉素、头孢噻肟、头孢唑肟、交叉菜胶、二甲苯。
本发明所采用的设备为:游标卡尺、生化仪(爱德士VT8008)、血常规仪(深圳市普康电子有限公司)、高速离心机(TG16W型,上海)、移液器(Eppendorf)、秒表、采血针、EDTA采血管、高原普通采血管,H/P/cosmos便携式血乳酸分析仪、日立Z180全自动生化分析仪。
本发明中选用的所有原辅料都为本领域熟知选用的,但不限制本发明的实施。
实施例一:用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂
本发明提供一种用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂的中草药方剂,该方剂包括:骆驼蓬子、黄连、小檗果、阿魏。
优选的,本发明提供一种用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂,按照重量份数计,包括骆驼蓬子60-15份、黄连20-5份、小檗果60-15份、阿魏10-5份。
实施例二:用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂
采用骆驼蓬子6g、黄连2g、小檗果6g、阿魏1g组方用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂。
实施例三:用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂
采用骆驼蓬子6g、黄连2g、小檗果1.5g、阿魏1g组方用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂。
实施例四:用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂
采用骆驼蓬子3g、黄连1g、小檗果3g、阿魏1g组方用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂。
实施例五:用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂
采用骆驼蓬子1.5g、黄连0.5g、小檗果1.5g、阿魏1g组方用于制备防治奶牛乳房炎的中草药方剂。
实施例六:组方筛选
1.抗奶牛乳房炎主要致病菌单味药的筛选
筛选32味作用显著的中草药单味药,以乙醇和水为溶媒分别进行了提取,以致奶牛乳房炎常见致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌为指标,通过打孔法、牛津杯法、MIC以及MBC的测定初步筛选出广谱抗牛乳房炎菌的单味药。
1.1打孔给药法抑菌结果
表1:各单味药提取物的打孔法抑菌效果
1.2牛津杯法抑菌结果
表2:各单味药提取物的牛津杯法抑菌效果(mm)
1.3西药抑菌结果
表3:抗生素对奶牛乳房炎主要致病菌的抑菌效果(mm)
药物 | 大肠杆菌 | 金黄色葡萄球菌 | 无乳链球菌 |
环丙沙星(5μg) | 28.52±1.15 | 31.83±0.47 | 10.00±2.30 |
氧佛沙星(5μg) | 26.55±0.59 | 30.06±0.51 | 8.31±1.05 |
庆大霉素(10μg) | 14.91±0.56 | 21.97±0.68 | 16.18±2.05 |
林可霉素(2μg) | 11.50±0.62 | 25.20±1.22 | 22.53±1.51 |
青霉素(10μg) | ― | 17.84±0.68 | 26.43±2.76 |
链霉素(10μg) | 15.87±0.85 | 21.47±1.22 | 8.78±0.66 |
头孢噻肟(30μg) | 29.20±1.33 | 30.05±1.02 | 32.50±3.00 |
头孢唑肟(30μg) | 31.50±0.48 | 29.54±0.81 | 31.21±2.43 |
1.4敏感单味药MIC和MBC的测定结果
表4:部分敏感单味药MIC测定结果(mm)
表5:敏感单味药MBC测定结果(mg/mL)
1.5小结
从打孔给药法和牛津杯法的结果可知,骆驼篷子、黄连、小檗实水提物和醇提物均对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌表现出广谱的抗菌效果;通过MIC和MBC的结果进一步确定了抑菌效果,当单味药骆驼篷子、黄连、小檗实的浓度达到一定得水平时能够明显的抑制致奶牛乳房炎主要致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及无乳链球菌的生长。
2.广谱抗奶牛乳房炎菌单味药的抗炎效果的评价
本发明为了评价广谱抗奶牛乳房炎菌的3味药的抗炎功效,通过耳廓炎性肿胀炎症模型,检测3味敏感中药对二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀的抑制作用,检测其抗奶牛乳房炎致病菌单味药的抗炎效果,结果表明,各药物对小鼠耳廓肿胀均表现出不同抑制作用。
表6:部分敏感单味药对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀抑制率
组别 | 给药剂量 | 肿胀度(mg) | 抑制率(%) |
模型组 | 10mL/kg | 8.01±3.82 | ― |
阿司匹林组 | 600mg/kg | 3.80±1.22* | 52.56 |
骆驼篷子水提物组 | 200mg/kg | 5.15±3.29 | 35.71 |
骆驼篷子醇提物组 | 200mg/kg | 6.58±3.30 | 17.85 |
小檗实水提物组 | 600mg/kg | 2.23±1.21** | 72.16 |
小檗实醇提物组 | 600mg/kg | 3.33±1.50** | 58.43 |
黄连水提物组 | 200mg/kg | 4.30±2.34* | 46.32 |
黄连醇提物组 | 200mg/kg | 5.98±2.03 | 25.34 |
注:与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01。
2.2小结
根据从32味药筛选出的具有广谱抗奶牛乳房炎菌的骆驼篷子、小檗实、黄连3味药,通过耳廓炎性肿胀炎症模型,检测3味敏感药对二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀的抑制率,评价其具有抗奶牛乳房炎致病菌的单味药的抗炎功效。抗炎试验结果显示,骆驼篷子、小檗实、黄连水提及醇提物有不同的抗炎作用,小檗实水提物及醇提物能够明显的减轻二甲苯所致小鼠耳廓肿胀,其抑制率明显高于阿司匹林组,抑制率分别为72.16%、58.43%。
3.三味抗奶牛乳房炎菌单味药的配伍组方的体外抑菌实验
通过棋盘法对筛选出的3味抗奶牛乳房炎菌单味药,以1:1的比例进行两两组合,以致奶牛乳房炎常见致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌为指标,测定其MIC,并对各配伍的协同或拮抗作用进行了比较,以期为筛选有效的抗奶牛乳房炎复方提供参考依据。
表7:正交设计表
药物 | 骆驼篷子 | 小檗果 | 黄连 |
骆驼篷子 | ― | ― | ― |
小檗果 | + | ― | ― |
黄连 | + | + | ― |
注:表中“+”表示用药,“―”表示不用药。
3.1结果
表8:单味药水提物MIC与其配伍组合MIC值比较(mg/mL)
表9:单味药醇提物MIC与其配伍组合MIC值比较(mg/mL)
表10:不同单味药水提物配伍对3种致病菌体外抑菌的协同或拮抗作用比较
表11:不同单味药醇提物配伍对3种致病菌体外抑菌的协同或拮抗作用比较
3.2结果
通过棋盘法对筛选出的3味抗奶牛乳房炎菌单味药,进行了两两组合,以致奶牛乳房炎常见致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌为指标检测出了MIC值,并对各配伍的协同或拮抗作用进行了比较。水提物配伍组合结果表明,骆驼篷子与黄连、小檗实与黄连等配伍达多均体现出协同或增效作用;醇提物配伍组合结果表明,组合多均为具有协同或增效作用的配伍;基于对试验结果、提取方法、提取成本等多方面的考虑,最后确定了应用单味药水提物进行配伍成方。
实施例七:最佳组方优化
为了筛选出有效的抗奶牛乳房炎组方,根据上述实施例的抗炎结果,与中医药理学理论相结合,进行了合理的组合并确定了组方,通过SPSS软件进行了正交试验设计,并采用体外抑菌试验对其进行了用药剂量的优化。
1.1.测定方法
以成人每天服药的最高剂量(按《中国药典》药品说明书,骆驼篷子6g/d、小檗果6g/d、黄连2g/d作为次实验的高剂量,高剂量的1/2为中剂量,中剂量的1/2为低剂量,药物剂量水平设置见表12。通过SPSS软件进行L9(33)正交设计,按正交设计将药液配成9种溶液,并采用打孔给药法分别进行体外抑菌圈直径的测定。
表12:剂量水平设置
1.2结果
表13:体外抑制大肠杆菌组方成分剂量优化
注:表中t1、t2、t3分别表示各因素1水平、2水平、3水平药效之和的均值;R为极差;n为组内重复数,下同。
表14:体外抑制金黄色葡萄球菌组方成分剂量优化
表15:体外抑制无乳链球菌组方成分剂量优化
表16:组方体外抑菌筛选
组方 | 组合结构 | 大肠杆菌 | 金黄色葡萄球菌 | 无乳链球菌 |
组方 | A<sub>1</sub>B<sub>3</sub>C<sub>1</sub> | 16.09±0.59<sup>b</sup> | 17.77±0.80<sup>b</sup> | 21.44±0.24<sup>b</sup> |
组方 | A<sub>1</sub>B<sub>1</sub>C<sub>3</sub> | 21.00±0.57a | 31.11±1.08<sup>a</sup> | 28.85±1.48<sup>a</sup> |
组方 | A<sub>3</sub>B<sub>1</sub>C<sub>3</sub> | 16.01±0.37<sup>b</sup> | 30.96±1.65a | 28.67±2.16a |
1.3小结
治疗奶牛乳房炎中药组方成分剂量的优化结果表明,组方Ⅰ最佳体外抑菌剂量组合为A1B1C3,即因素A(骆驼篷子6g)、B(黄连2g)、C(小檗实1.5g)以上剂量组为各组方分别对致奶牛乳房炎常见致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌的抑菌作用最佳,可作为抗奶牛乳房炎组方的最佳剂量组。
2.治疗奶牛乳房炎中药复方加味及剂量的优化
根据中草药医药理论,选取红花、新疆阿魏、洋甘菊、龙葵果,结合体外抑菌试验、通过SPSS软件进行L9(34)正交设计,将确立的中药组方进行加味成方及优化入药剂量,从而确立治疗奶牛乳房炎有效中药复方。
2.1测定方法
药物剂量水平以成人每天服药的最高剂量的1/2(按《中国药典》按药品说明书,新疆阿魏1g/d、洋甘菊5g/d、龙葵果5g/d)作为次实验的高剂量(水平1),高剂量的1/2为中剂量(水平2),不加药(水平3),药物剂量水平设置见表17。通过SPSS软件进行L9(34)正交设计,按正交设计将药液配成9种溶液,并采用打孔给药法分别进行体外抑菌圈直径的测定。
表17:复方加味及剂量水平设置
注:表中“/”表示不用药
2.2结果
表18:复方体外抑制大肠杆菌复方加味及剂量优化
注:表中t1、t2、t3分别表示各因素1水平、2水平、3水平药效之和的均值;R为极差;n为组内重复数,下同。
表19:复方体外抑制金黄色葡萄球菌复方加味及剂量优化
表20:复方体外抑制无乳链球菌复方加味及剂量优化
表21:治疗奶牛乳房炎中药有效复方体外抑菌筛选(mm)
药物 | 大肠杆菌 | 金黄色葡萄球菌 | 无乳链球菌 |
复方Ⅰ(组方Ⅰ+B<sub>1</sub>) | 19.59±0.31 | 28.20±0.44 | 28.77±0.72 |
2.3小结
根据为了调整和恢复机体的机能,根据维医药理论进行对症多重辩证、多层次和系统性的考虑并通过正交设计对组方进行了合理的加味和剂量优化的试验。试验结果表明,复方Ⅰ最佳体外抑菌剂量组合为Ⅰ+B1,因此确定正交中药复方Ⅰ由组方Ⅰ9.5g和新疆阿魏1g组成,该组合是组方Ⅰ加味后同时抗奶牛乳房炎3种致病菌的最佳组合;本实验证明了,通过中草药医理论与体外试验相结合,而确立的抗奶牛乳房炎中药复方,能够很好的抑制致奶牛乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及无乳链球菌的生长。
3.治疗奶牛乳房炎中药复方的体外抑菌及其抗炎作用的检测
为了考察治疗奶牛乳房炎中药复方的体外抑菌作用和抗炎功效,通过MIC及MBC的测定和耳廓炎性肿胀及胸膜炎性炎症模型,观察各复方在加味前后抑菌的作用和各复方对不同炎症反应的作用效果。
3.1中药复方及其组方MIC和MBC的测定结果
表22:加味药对体外抑菌组方抑菌效果的影响(mg/mL)
3.2中药复方对二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀的影响
表23:中药复方对二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀的影响
组别 | 剂量(g/kg) | 肿胀度(mg) | 抑制率(%) |
模型组 | - | 13.83±1.00 | - |
阿司匹林组 | 0.60 | 7.00±0.70 | 49.39 |
复方组 | 2.10 | 6.80±0.17 | 50.83 |
3.3角叉菜胶致炎性小鼠血清PGE2、IL-1β、TNF-α含量测定
表24:中药复方对交叉菜胶致炎性小鼠血清PGE2、IL-1β及TNF-α含量的影响
组别 | PGE<sub>2</sub>(pg/ml) | IL-1β(pg/ml) | TNF-α(pg/ml) |
模型组 | 3.05±0.17 | 1.80±0.09 | 2.47±0.19 |
空白对照组 | 1.58±0.95** | 1.10±0.11** | 1.79±0.36* |
阿司匹林组 | 1.70±0.27** | 1.42±0.15 | 1.80±0.21* |
复方组 | 2.61±0.14 | 1.34±0.08* | 1.96±0.16 |
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。
3.4小结
体外抑菌试验结果表明,各加味后的复方对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的体外抑菌效果与组方一致,加味药对各组方的体外抑菌效果没有明显的影响;抗炎试验结果表明,阿司匹林组、复方对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有很好的抑制作用,抑制率分别为49.39%、50.83%;与模型组相比,复方组对IL-1β、的抑制作用均为显著(P<0.05)。本试验证实,抗奶牛乳房炎中药复方均具有较好的抗炎作用,期为临床试验打下基础。
实施例八:药物安全性检测
1.复方提取物对乳房炎致病菌的影响
对复方提取液通过发明其3种常见奶牛乳房炎致病菌生长曲线的影响,进而对该复方抑菌机理的发明提供基础。
制作复方中草药制剂,其成分如下:
复方Ⅰ:骆驼蓬子6g、黄连2g、小檗果1.5g、阿魏1g;
上述各组复方均由本实验室通过体外抑菌试验及体外抗炎试验,并结合清热解毒、消肿散结、活血化瘀的治疗原则合理配比组成。
1.1复方提取物对奶牛乳房炎致病菌生长曲线的影响
1.1.1各组复方提取物对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响
各组复方对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响参见附图1所示,由图可知空白对照组是金黄色葡萄球菌的正常生长曲线,而各试验组实验菌株生长曲线无明显波动,说明本发明复方组对金黄色葡萄球菌的生长均具有显著的抑制作用。
1.1.2各组复方提取物对大肠杆菌生长曲线的影响
本发明复方组对大肠杆菌生长曲线的影响参见附图2所示,由图可知空白对照组是大肠杆菌的正常生长曲线,而各试验组实验菌株生长曲线无明显波动,说明本发明复方组对大肠杆菌的生长均具有显著的抑制作用。
1.1.3各组复方提取物对无乳链球菌生长曲线的影响
本发明复方组对无乳链球菌生长曲线的影响参见附图3所示,由图可知空白对照组是无乳链球菌的正常生长曲线,而各试验组实验菌株生长曲线无明显波动,说明本发明复方组对无乳链球菌的生长均具有显著的抑制作用。
1.2结论
复方提取物对奶牛乳房炎致病菌生长曲线的影响试验结果表明,复方提取液均对临床常见3种奶牛乳房炎致病菌有较好的抑制作用。
2.复方提取物对实验性小鼠乳房炎模型乳腺组织病理变化的影响
本发明以复方为发明对象,通过建立实验性小鼠乳房炎模型,探究各组复方对乳腺组织病例变化的影响,为利用复方乳房灌注剂治疗奶牛乳房炎奠定基础。
表25:实验分组及给药方案
2.1实验性小鼠乳房炎模型的建立及筛选结果
2.1.1对照组结果
参见附图4所示,对照组模型小鼠在24h、48h和72h的乳腺组织切片无明显病理变化,腺泡上皮细胞排列有序。
2.1.2模型组Ⅰ结果
参见附图5所示,模型组Ⅰ小鼠的乳腺组织在注入高浓度菌液后发生严重病理变化,24h时乳腺上皮脱落,腺泡内有大量的脓球细胞,出现渗出液浸润,可见明显的蓝紫色细菌团块,间质血管扩张,充满大量红细胞;48h时发现乳腺上皮细胞大量脱落,组织结构模糊,腺泡内及间质可见大量的中性粒细胞浸润;72h时病变程度加深,部分乳腺结构消失,可见大量细菌团块。
2.2四种复方提取物的应用结果
2.2.1生理盐水对照组乳腺组织病理变化
参见附图6所示,生理盐水对照组小鼠的乳腺组织在注入混合菌悬液后,0~24h乳腺组织内均可见明显的细菌团块,从24h开始至72h腺泡结构逐渐破坏,腺泡上皮细胞变性坏死,脱落程度逐渐加重,腺泡内浸润的中性粒细胞逐渐增多,特别是72h时上述病变均加重,并带有出血,部分乳腺腺泡结构消失,出现大面积脓团。
2.2.2环丙沙星组乳腺组织病理变化
参见附图7所示,环丙沙星组小鼠的乳腺组织在注入混合菌悬液后,0~24h乳腺上皮细胞脱落,间质增宽,可见明显细菌团块,有大量中性粒细胞浸润,腺泡内充满渗出液,至48~72h时病变逐渐减轻,但乳腺腺泡组织结构仍未恢复。
2.2.3复方组乳腺组织病理变化
参见附图8所示,复方组小鼠的乳腺组织在注入混合菌悬液后,0~24h时乳腺上皮细胞脱落,间质增宽较为严重,可见中性粒细胞浸润,无明显细菌团块,水肿较为严重;48~72h上皮脱落明显减少,乳腺腺泡内渗出物逐渐减少,中性粒细胞减少,病变程度明显减轻,乳腺腺泡组织结构与正常乳腺组织比较无明显差异。
3.复方乳房灌注剂的制备及实验室安全性评价
表26:皮肤刺激反应评分标准
表27:皮肤刺激强度评价标准
分值 | 皮肤刺激强度评价 |
0~0.49 | 无刺激性 |
0.5~2.99 | 轻度刺激性 |
3.0~5.99 | 中度刺激性 |
6.0~8.00 | 重度刺激性 |
3.1皮肤用药过敏性试验
取健康豚鼠24只随机分成6组,分别为复方组、空白对照组和阳性药物组。给药前将各组豚鼠背部皮肤脱毛处理,面积6×6cm2。各复方组取相应受试药液涂于豚鼠脱毛区皮肤上,无刺激敷料覆盖,再以胶布固定,进行致敏接触。动物单笼放置,包裹固定6h后,用温水擦去皮肤上残留药液。以同样方法在第7d和第14d各重复1次,第28d涂抹相应受试药液激发接触。阳性药物组用1%DNCB(1-氯-2,4-二硝基苯)进行首次致敏,并于第7d和第14d各重复一次,第28d用0.1%DNCB激发接触;空白对照组用生理盐水涂抹,方法同阳性药物组。末次激发给药包裹固定6h后,温水擦去受试药液,即刻观察,然后于24h,48h,72h再次观察皮肤红斑和水肿等过敏反应情况,并按表28、表29中的《皮肤过敏反应评分标准》、《皮肤致敏性评价标准》进行评分,记录各组在不同时间的评分值及恢复情况。
表28:皮肤过敏反应评分标准
备注:平均反应值=(红斑形成总分+水肿形成总分)/动物总数
致敏率=阳性反应动物数/受试动物总数×100%
阳性反应:皮肤出现红斑或水肿(不论程度轻重)。
表29:皮肤致敏性评价标准
致敏发生率(%) | 皮肤致敏强度评价 |
0~10 | 无致敏性 |
20~30 | 轻度致敏性 |
40~60 | 中度致敏性 |
70~80 | 高度致敏性 |
90~100 | 极度致敏性 |
3.2黏膜用药刺激性试验
选取眼部无损伤的新西兰大白兔12只,采用自身对照法,分别考察不同受试药液对实验动物眼部粘膜的影响。各组分别给右眼滴入相应受试药液2滴(0.1mL),左眼滴入等体积的灭菌生理盐水,使实验动物被动闭合眼睑5s。记录操作结束后0h、1h、6h、24h、48h、72h至第7d时实验动物眼睛的局部反映情况。并按表30、表31中的《眼刺激反应评分标准》、《眼刺激性评价标准》进行评分,记录各组在不同时间的评分值。
表30:眼刺激反应评分标准
备注:受试动物刺激反应积分总和=眼角膜+虹膜+结膜的刺激反应分值之和受试物对眼刺激积分=全部受试动物刺激反应积分总和/受试动物总数
表31:眼刺激性评价标准
分值 | 眼刺激强度评价 |
0~3 | 无刺激性 |
4~8 | 轻度刺激性 |
9~12 | 中度刺激性 |
13~16 | 强度刺激性 |
3.3复方乳房灌注剂的质检结果
按上述方法各组复方乳房灌注剂均随机选取5支供试品(规格为20mL),将内容物分别置于50mL量筒中,倾尽内容物,读出装量如下表32所示,各供试品读数结果均在规定容量100~110%之间,符合相关规定。
按照相关规定,进行无菌检查试验,在硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基上进行培养,发现各复方灌注剂供试品管均澄清,阳性对照管微生物生长良好,阴性对照管无微生物生长,证明本发明复方组灌注剂符合相关规定。
表32:供试品装量读数
3.4皮肤用药急性毒性试验结果
各完整皮肤及破损皮肤组受试动物在试验期间全部存活,且自主活动、饮食、体重等均未见异常,给药前后试验组和对照组实验动物的体重均无明显变化,试验结果见表33。
表33:皮肤用药急性毒性试验平均体重变化(单位:Kg)
分组 | 实验前 | 1d | 2d | 3d | 4d | 5d | 6d | 7d |
完整皮肤复方组 | 2.00 | 2.00 | 2.15 | 2.15 | 2.15 | 2.25 | 2.25 | 2.25 |
完整皮肤对照组 | 1.90 | 2.00 | 2.05 | 1.90 | 1.90 | 2.00 | 2.05 | 1.95 |
破损皮肤复方组 | 2.00 | 2.05 | 2.05 | 1.95 | 2.00 | 2.05 | 2.05 | 2.05 |
破损皮肤对照组 | 2.25 | 2.20 | 2.25 | 2.30 | 2.15 | 2.20 | 2.30 | 2.40 |
3.5皮肤用药刺激性试验结果
各复方灌注剂对实验动物皮肤的刺激性试验结果显示(详见表34)。各组复方乳房灌注剂涂抹于试验实验动物皮肤时,完整皮肤及破损皮肤均未出现红斑和水肿反应,刺激评分值低于0.49,表明复方组均无皮肤刺激性。
表34:皮肤用药刺激性试验结果
3.6皮肤用药过敏性试验结果
试验过程中,复方组和空白组豚鼠均未出现红斑、水肿等过敏表现,致敏率为0%,表明复方组乳房灌注剂均无致敏性。而用DNCB的阳性组豚鼠皮肤局部出现严重红斑,并伴发水肿,触摸用药部位时豚鼠疼痛反应明显,致敏率为100%,具有极度致敏性。上述结果表明各组受试复方对豚鼠皮肤无致敏性。试验结果见表35。
表35:皮肤用药过敏性试验结果
分组 | 0h | 24h | 48h | 72h |
复方组 | 0 | 0 | 0 | 0 |
空白对照组 | 0 | 0 | 0 | 0 |
阳性给药组 | 1.25 | 3.75 | 4.75 | 3.50 |
3.7黏膜用药刺激性试验结果
各组复方乳房灌注剂对实验动物眼睛局部黏膜的刺激性试验结果显示(详见表36)。各复方乳房灌注剂滴入试验实验动物眼睑内时,用药一侧与对照一侧角膜、虹膜及结膜均未出现浑浊、损伤、充血、水肿和分泌物,刺激评分值低于3,表明各组复方乳房灌注剂均无黏膜刺激性。
表36:黏膜用药刺激性试验结果
基于上述实施例可见,本发明以地方特色中药复方为发明对象,检测各组复方提取物对奶牛乳房炎致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌)的抑菌作用,通过建立小鼠乳房炎模型,观察各组复方提取物对小鼠乳腺组织病理变化的影响,合理制备复方乳房灌注剂,并通过无菌检查法及装量检查进行质检,在此基础上通过皮肤及黏膜用药试验,评估各组复方乳房灌注剂用药安全性,为临床用药提供基础。
如上所述,即可较好地实现本发明,上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进,均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (3)
1.用于制备防治奶牛乳房炎的中草药复方制剂,其特征在于,按照重量份数计,所述的中草药复方制剂由以下原料制成:骆驼蓬子60-15份、黄连20-5份、小檗果60-15份、阿魏10-5份。
2.如权利要求1所述的用于制备防治奶牛乳房炎的中草药复方制剂,其特征在于,按照重量份数计,所述的中草药复方制剂由以下原料制成:骆驼蓬子60份、黄连20份、小檗果15份、阿魏10份。
3.如权利要求1至2中任意所述用于制备防治奶牛乳房炎的中草药复方制剂在制备防治奶牛乳房炎治疗药物中的应用。
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