CN110373447A - 一种多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物体外诊断领域，公开了一种多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡及制备方法。其中，联合药敏组合包含粘菌素+美罗培南、粘菌素+磷霉素、粘菌素+替加环素、粘菌素+头孢他啶、替加环素+阿米卡星、替加环素+美罗培南、替加环素+磷霉素、舒巴坦+美罗培南、舒巴坦+多西环素、舒巴坦+替加环素、阿米卡星+磷霉素、美罗培南+阿米卡星、美罗培南+磷霉素、美罗培南+左氧氟沙星。本发明的联合药敏试验卡同时提供9种单药及其14组联合药敏结果，明显提高测试效率，降低测试工作量和测试成本，且提供满足临床需求的MIC结果，为临床针对多药耐药细菌实现精准用药提供依据。

Description

一种多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡及制备方法

技术领域

本发明涉及微生物体外诊断领域，具体是涉及一种多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡及制备方法。

背景技术

抗菌药物的敏感性试验(简称药敏试验)是指使用体外方法测定抗菌药物抑制病原微生物生长的能力，主要用来预测抗菌药物的临床治疗效果，并为临床医生针对某一特定的临床感染菌选用药物提供依据。临床上微生物实验室采用多种实验方法，包括纸片扩散法、琼脂稀释法、微量肉汤稀释法或各种商品化检测系统，对临床分离菌进行药物敏感性检测。不同细菌需要测定药敏的抗菌药物品种不同，各类细菌药敏测试的抗菌药物品种选择及药敏结果判定折点通常参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)指南、欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(EUCAST)指南等。

近年来随着临床抗菌药物的使用，细菌耐药率越来越高，且细菌耐药性已成为影响人类健康的主要威胁之一。临床常见的多重耐药菌主要来自革兰氏阴性菌，其中包括肠杆菌科细菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌及嗜麦芽窄食单胞菌等。而用于多重耐药菌感染的有效治疗药物很少，抗菌药物单药治疗的疗效往往并不满意，多数需要联合用药。

为帮助临床医师诊断与治疗革兰氏阴性菌的感染，中国相关专家制定了《广泛耐药革兰阴性菌感染的实验诊断、抗菌治疗及医院感染控制：中国专家共识》，推荐采用联合用药治疗多药耐药的革兰氏阴性菌导致的感染。然而，目前临床商业化的药敏试验卡仅针对单一药物品种，均无法提供联合药敏结果，在遇到多药耐药细菌感染时，医师往往只能根据各自的临床经验来选择联合用药的品种和剂量，无法通过有效的联合药敏试验测试结果制定合理有效的治疗方案，以致临床治疗的失败率明显增加。。

为了解决联合药敏的问题，部分实验室采用纸片扩散法进行不同药物的联合药敏试验，考察不同药物之间是否具有协同作用从而进行指导用药，但该方法仅能根据单药与联合后抑菌圈的变化推测二者是否存在协同作用，无法提供准确的MIC结果从而无法指导临床进行精准用药。部分学者采用手工肉汤稀释法进行了不同药物的联合药敏研究，如陆一丹、张亚莉等研究了美罗培南与多西环素、环丙沙星、舒巴坦及头孢哌酮/舒巴坦联合用药，周梦兰、王瑶等研究了头孢哌酮、头孢他啶、亚胺培南、替加环素、黏菌素单药及其与舒巴坦联合用药，但上述研究均存在如下问题：(1)采用手工方法进行试验卡的制备、测试等，耗时长、结果时效性差、成本高且制备的试验卡无法长期储存，因此无法在临床有效推广；(2)药物浓度设计全部采用常规的倍比稀释设计，在部分药物的浓度上没有完全满足药物的精准用药需求。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供了一种多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡及制备方法。本发明的多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡采用肉汤稀释法对待测菌株测试，同时提供9种单药及其14组联合药敏结果，解决常见多药耐药革兰阴性菌的联合药敏测试，明显提高测试效率，降低测试工作量和测试成本，且提供满足临床需求的MIC 结果，为临床针对多药耐药细菌实现精准用药提供依据。

为达到本发明的目的，本发明的多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡可同时进行单药和多药联合药敏测试，其中，用于测试的单药及其浓度为：粘菌素0.125-16μg/ml、美罗培南2-1024μg/ml、磷霉素8-1024μg/ml、阿米卡星4-512μg/ml、舒巴坦2-256μg/ml、替加环素0.125-16μg/ml、多西环素4-256μg/ml、左氧氟沙星2-256μg/ml、头孢他啶8-512μg/ml；联合药敏组合包括粘菌素+美罗培南、粘菌素+磷霉素、粘菌素+替加环素、粘菌素+头孢他啶、替加环素+阿米卡星、替加环素+美罗培南、替加环素 +磷霉素、舒巴坦+美罗培南、舒巴坦+多西环素、舒巴坦+替加环素、阿米卡星+磷霉素、美罗培南+阿米卡星、美罗培南+磷霉素、美罗培南+ 左氧氟沙星。

上述联合药敏测试药物组合是基于临床中对革兰氏阴性菌体内外均有疗效的药物，综合考虑药物的作用机制、结合临床实际的选药思路，同时考虑联合药物在体内的毒性反应是否增加得出，可供临床直接选用。

进一步地，所述联合药敏组合中粘菌素浓度覆盖包括0.0625μg/ml、 0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml；所述联合药敏组合中美罗培南浓度覆盖包括0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、 2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml、24μg/ml；所述联合药敏组合中磷霉素浓度覆盖包括2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/m、256μg/ml；所述联合药敏组合中替加环素浓度覆盖包括0.0625μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、 2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml；所述联合药敏组合中阿米卡星浓度覆盖包括0.125 μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、 6μg/ml；所述联合药敏组合中舒巴坦浓度覆盖包括1μg/ml、2μg/ml、4 μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml、24μg/ml；所述联合药敏组合中多西环素浓度覆盖包括0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、 8μg/ml、16μg/ml；所述联合药敏组合中左氧氟沙星浓度覆盖包括0.25 μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml；所述联合药敏组合中头孢他啶浓度覆盖包括1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml。

优选地，所述联合药敏组合中粘菌素浓度覆盖包括0.0625μg/ml、0.125 μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml；所述联合药敏组合中美罗培南浓度覆盖包括1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml；所述联合药敏组合中磷霉素浓度覆盖包括2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16 μg/ml、32μg/ml、64μg/ml；所述联合药敏组合中替加环素浓度覆盖包括 0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml；所述联合药敏组合中阿米卡星浓度覆盖包括0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2 μg/ml、4μg/ml、6μg/ml；所述联合药敏组合中舒巴坦浓度覆盖包括4μg/ml、 6μg/ml、8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml、24μg/ml；所述联合药敏组合中多西环素浓度覆盖包括0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml；所述联合药敏组合中左氧氟沙星浓度覆盖包括0.25μg/ml、0.5μg/ml、1 μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml；所述联合药敏组合中头孢他啶浓度覆盖包括1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml。

进一步地，所述联合药敏组合中美罗培南用亚胺培南代替，粘菌素用多粘菌素B代替。

进一步地，所述联合药敏组合中的药物组合和浓度组合，采用棋盘法设计。

进一步地，本发明还提供一种所述多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡的制备方法，该方法采用无菌稀释液和所需的抗生素粉末制备试验卡中所覆盖的药物溶液，然后将制备完成的药物溶液包被于空白试验卡中。

进一步地，所述无菌稀释液为MH肉汤+0.0001～0.001％聚山梨酯80溶液，PH7.2-7.4；或0.2％牛肉膏+1.75％酪蛋白酸水解物+0.0001～0.001％聚山梨酯80溶液，PH7.2-7.4。

进一步地，如果试验孔中含有磷霉素，则该孔的无菌稀释液中还需添加25μg/ml的6-磷酸葡萄糖。

进一步地，所述试验卡是一块具有足够所需测试孔数的空白试验卡试验卡或多块试验卡的组合。

进一步地，所述试验卡中药物溶液的包被量为10-200ul，例如25-100ul。

进一步地，所述包被采用冷冻干燥的方式进行干燥，或采用低温减压的干燥方式进行干燥。

所述试验卡制备完成即可进行测试，即采用无菌生理盐水将待测菌(菌龄为16-24h的新鲜菌落)调整至5*10⁵CFU/ml成为待测菌液，置于35±1℃空气条件下孵育16-20h观察结果。

与现有技术相比，本发明多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡中的药物浓度设计改变常规肉汤稀释法的倍比稀释，针对不同药物更加精准设计，比常规设计更加符合药物PK/PD参数以及临床需求，从而更加有利于满足临床的精准用药；提供准确的单药MIC结果以及联合用药MIC结果，相比纸片扩散法，更加有利于临床根据PK/PD进行用药方案设计；将联合药物直接包被于试验孔中解决了药物长期储存问题，将细菌生长所需营养物质直接包被于试验孔中使测试过程简单无需另外制备药敏培养液，相比手工方法明显有利于缩短测试时间、降低测试成本、提高时效，便于临床实验室的推广使用。

附图说明

图1是本发明实施例1以144孔试验卡为例，采用4块144孔试验卡进行布局的试验卡1；

图2是本发明实施例1以144孔试验卡为例，采用4块144孔试验卡进行布局的试验卡2；

图3是本发明实施例1以144孔试验卡为例，采用4块144孔试验卡进行布局的试验卡3；

图4是本发明实施例1以144孔试验卡为例，采用4块144孔试验卡进行布局的试验卡4；

其中：MP-美罗培南；CL-粘菌素；TG-替加环素；SU-舒巴坦；FM-磷霉素；AK-阿米卡星；DX-多西环素；LE-左氧氟沙星；CZ-头孢他啶；C+表示阳性对照孔；举例说明：CL0.25+TG0.125表示该孔包被0.25ug/ml粘菌素和0.125ug/ml替加环素。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1 至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

对于线性药代动力学的药物，当MIC按常规肉汤稀释法倍比浓度递增时，MIC每递增一个梯度，药物的给药剂量也需要上升一倍；因此，临床在进行该类药物用药时，尤其是进行超常规剂量用药的情况下，在常规倍比浓度的基础上提供更加精准的MIC结果有利于临床更精准合理的用药。比如美罗培南，根据临床抗菌药物优化给药的设计原则，要使该药达到较好疗效，应该使该药的PK/PD参数也就是给药间隔内游离血药浓度超过致病菌最小抑菌浓度(MIC)的时间(fT>MIC)至少达40％以上，重症感染患者可考虑达到100％。当病原菌的MIC≥4μg/ml(肠杆菌科细菌)或者8 μg/ml(鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌)时，临床常规不选择该药物进行治疗。但是实际上，在2.0g，q8h延长静滴的给药方案下，部分病人的谷浓度可以达到8～24μg/ml，因此当病原菌MIC在24μg/ml以下时，临床仍可通过特殊的给药方案(如大剂量延长静滴)使体内药物浓度达MIC以上或使该药的PK/PD参数达到40％～100％，从而达到一定的抗菌临床疗效。因此，本联合药敏试验卡在常规倍比的基础上增加测试美罗培南12μg/ml和 24μg/ml的浓度更加有利于临床精准合理的用药。

对于药物毒性反应与剂量密切相关的药物，临床在使用时希望尽量选用有效的最低剂量，尤其是针对超过常规剂量用药或者针对肾功能不全的患者。比如阿米卡星，PK/PD参数Cmax/MIC为8-12，给药剂量为15mg/kg/d，一日一次给药方案下要求峰浓度56-64mg/L，谷浓度不超过1mg/L，按峰浓度64μg/ml计算，MIC最多为8μg/ml方能使PK/PD达标。对于碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌，MIC不超过4μg/ml时，可以用15mg/kg/d的剂量，但当MIC＞4μg/ml时，剂量需要随着细菌MIC的增加呈线性增加。因此，本联合药敏试验卡在常规倍比的基础上增加测试1.5μg/ml、/3μg/ml和 6μg/ml有利于帮助临床更加精准和合理的调整用药剂量。

本发明试验卡覆盖舒巴坦单药及联合药敏测试。舒巴坦对鲍曼不动杆菌具有不同于其它β内酰胺类药物的独特杀菌作用，但是目前商业化试验卡中，仅有舒巴坦与其它内酰胺类复方药物的药敏测试，没有舒巴坦单独药敏测试。本发明将舒巴坦做为一个单药进行测试，可以获得该药的单药药敏及其与其它不同药物的联合药敏结果，其结果对于临床选药更有针对性，满足临床使用舒巴坦单药的使用需求。

此外，舒巴坦对鲍曼不动杆菌的PK/PD参数为fT>MIC超过40％。对于鲍曼不动杆菌，舒巴坦的日剂量可达6-9g/d，最大可达12g/d，当MIC分别为4μg/ml与8μg/ml时，肾功能正常患者分别采用舒巴坦3g q8h 4h(9g/d) 与2g q8h 4h静滴(6g/d)静滴可使PK/PD达标，MIC值从4上升至8，日剂量需要从6g上升至9g，如果在4μg/ml和8μg/ml中间设一个6μg/ml，将有可能使患者的剂量更加精准化。舒巴坦本身肾毒性较小，在体内主要以原形从肾脏排泄。对于肾功能下降的患者，采用较大剂量时，谷浓度或稳态浓度有可能达到24及以上。因此本发明设定的舒巴坦的最高浓度为24 μg/ml。

而且，本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

试验卡布局：以144孔试验卡为例，采用4块144孔试验卡进行布局，设计方式如附图1-4所示或表1-4所示。

表1 4块144孔试验卡1

表2 4块144孔试验卡2

表3 4块144孔试验卡3

表4 4块144孔试验卡4

注：1、MP-美罗培南；CL-粘菌素；TG-替加环素；SU-舒巴坦；FM-磷霉素；AK- 阿米卡星；DX-多西环素；LE-左氧氟沙星；CZ-头孢他啶；C+表示阳性对照孔

2、举例说明：CL0.25+TG0.125表示该孔包被0.25ug/ml粘菌素和0.125ug/ml替加环素。

实施例2

试验卡制备，步骤如下：(1)配制MH肉汤+0.0001％聚山梨酯80溶液(PH7.2-7.4)，采用121℃，15min进行高压灭菌，制备成稀释液；(2)将所需的抗生素采用所需的溶剂溶解并采用0.22um过滤膜进行过滤；(3)按照实施例1中药物布局，采用灭菌的稀释液稀释抗生素母液制备所需的抗生素溶液；(4)将制备完成的抗生素溶液实施例1中的布局添加至144孔卡中，每孔50ul；(5)采用冷冻干燥的方式进行干燥；(6)最后采用铝膜袋进行真空包装并储存于2-8℃。

试验卡测试，步骤如下：(1)取菌龄为16-24h的新鲜菌落作为待测菌株；(2)采用无菌生理盐水将待测菌调整至0.5麦氏；(3)取所需量的0.5 麦氏菌液至50ml生理盐水中，调整至5*10⁵CFU/ml成为待测菌液；(4)将菌悬液添加于试验卡中，每孔50ul；(5)将完成加样的试验卡置于35±1℃空气条件下孵育16-20h观察结果。

实施例3

临床病例1：患者，男，74岁，重症肺炎合并脓毒血症，下呼吸道分泌物及血培养均显示全耐药鲍曼不动杆菌，商业化药敏系统初步测试显示没有可供选择的单药，包括粘菌素、美罗培南、磷霉素、阿米卡星、舒巴坦、多西环素、左氧氟沙星、头孢他啶全部高浓度耐药。采用本发明所设计的联合药敏试验卡进行测试，结果显示：仅美罗培南联合磷霉素具有协同作用，具体测试结果如下表5所示。

表5临床病例1使用联合药敏试验卡测试结果

上述结果表明，美罗培南浓度在常规耐药折点浓度(8μg/ml)联合磷霉素最高浓度(128μg/ml)也不能达到抑菌效果，而在美罗培南12μg/ml和 16μg/ml的浓度下与磷霉素联合才能达到抑菌效果。根据联合药敏结果，该患者使用了美罗培南2.0g q8h静滴4小时+磷霉素4g q8h的联合给药方案，患者美罗培南的血药谷浓度测定结果显示在19.6μg/ml，经计算T＞MIC接近 90％。患者使用该方案9天后，感染得到有效控制。

因此，对于本实施例，如果采用纸片法进行联合药敏测试，仅能得出美罗培南+磷霉素具有协同作用，但无法得出具体的MIC值，可能导致临床按照常规剂量进行用药而无法获得理想效果；如果没有测试非常规浓度 12ug/ml浓度，则可能导致临床进一步增加临床用药剂量从而加重患者负担。

实施例4

临床病例2：某患者，女，69岁，重症肺炎合并脓素血症，下呼吸道分泌物培养为多重耐药铜绿假单胞菌，常见单药药敏结果全部耐药。采用本发明所设计的联合药敏试验卡进行测试，结果显示，粘菌素单药MIC值为4μg/mL，阿米卡星单药MIC为16μg/mL，美罗培南单药MIC为32ug/ml。粘菌素联合阿米卡星具有协同作用，CL0.5+AK6、CL1+AK6、CL2+AK6测试孔细菌不生长；美罗培南联合阿米卡星也具有协同作用，MP12+AK6、 MP16+AK6测试孔细菌不生长。

患者为老年人，肾功能不全，粘菌素与阿米卡星联合后肾毒性增加，故选用美罗培南联合阿米卡星方案。根据联合后阿米卡星的MIC值，选择阿米卡星15mg/kg，qd静滴30min+美罗培南2.0g q8h静滴3h方案。给药3天后，患者美罗培南的血药谷浓度测定结果显示在21.6μg/ml，阿米卡星峰浓度测定结果显示在58.2μg/ml，美罗培南PK/PD参数fT>MIC基本达到100％，阿米卡星PK/PD参数Cmax/MIC也达到了9以上。用药第5天，患者感染指标明显下降，患者用药7天后感染得到有效控制，停用该方案，肾功能较用药前无明显下降。

如果试验卡中没有覆盖6μg/ml的阿米卡星而选择常规浓度的8ug/ml，则需要按阿米卡星MIC为8μg/ml进行计算，Cmax/MIC达到9，则峰浓度需要至少达到72μg/ml，该患者的给药剂量将会要达到20mg/kg/d，大剂量及高浓度的阿米卡星可能会引起肾毒性的产生。

实施例5

本试验卡在临床进行多重耐药革兰氏阴性杆菌感染相关病例的验证 186例，单药药敏结果均为全耐药，无敏感药物可供选择，采用本试验卡测试后166例获得了有效的联合组合方案；166例病例中，有15例因为经济问题放弃使用有效联合药物进行治疗全部死亡，其它151例选用了有效的联合方案，并根据得出的具体MIC值进行了给药剂量的计算。151例患者中，有 105例感染得到有效控制，有效率达69.5％，远高于常规经验性联合方案有效率的20～30％。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡，其特征在于，所述多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡可同时进行单药和多药联合药敏测试，其中，用于测试的单药及其浓度为：粘菌素0.125-16μg/ml、美罗培南2-1024μg/ml、磷霉素8-1024μg/ml、阿米卡星4-512μg/ml、舒巴坦2-256μg/ml、替加环素0.125-16μg/ml、多西环素4-256μg/ml、左氧氟沙星2-256μg/ml、头孢他啶8-512μg/ml；联合药敏组合包含粘菌素+美罗培南、粘菌素+磷霉素、粘菌素+替加环素、粘菌素+头孢他啶、替加环素+阿米卡星、替加环素+美罗培南、替加环素+磷霉素、舒巴坦+美罗培南、舒巴坦+多西环素、舒巴坦+替加环素、阿米卡星+磷霉素、美罗培南+阿米卡星、美罗培南+磷霉素、美罗培南+左氧氟沙星。

2.根据权利要求1所述的多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡，其特征在于，所述联合药敏组合中粘菌素浓度覆盖包括0.0625μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml；所述联合药敏组合中美罗培南浓度覆盖包括0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml、24μg/ml；所述联合药敏组合中磷霉素浓度覆盖包括2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/m、256μg/ml；所述联合药敏组合中替加环素浓度覆盖包括0.0625μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml；所述联合药敏组合中阿米卡星浓度覆盖包括0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、6μg/ml；所述联合药敏组合中舒巴坦浓度覆盖包括1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml、24μg/ml；所述联合药敏组合中多西环素浓度覆盖包括0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml；所述联合药敏组合中左氧氟沙星浓度覆盖包括0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml；所述联合药敏组合中头孢他啶浓度覆盖包括1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml。

3.根据权利要求2所述的多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡，其特征在于，所述联合药敏组合中粘菌素浓度覆盖包括0.0625μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml；所述联合药敏组合中美罗培南浓度覆盖包括1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml；所述联合药敏组合中磷霉素浓度覆盖包括2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml；所述联合药敏组合中替加环素浓度覆盖包括0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml；所述联合药敏组合中阿米卡星浓度覆盖包括0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml；所述联合药敏组合中舒巴坦浓度覆盖包括4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml、24μg/ml；所述联合药敏组合中多西环素浓度覆盖包括0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml；所述联合药敏组合中左氧氟沙星浓度覆盖包括0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml；所述联合药敏组合中头孢他啶浓度覆盖包括1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml。

4.根据权利要求1所述的多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡，其特征在于，所述联合药敏组合中美罗培南用亚胺培南代替，粘菌素用多粘菌素B代替。

5.根据权利要求1所述的多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡，其特征在于，所述联合药敏组合中的药物组合和浓度组合，采用棋盘法设计。

6.权利要求1-5任一项所述多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡的制备方法，其特征在于，该方法采用无菌稀释液和所需的抗生素粉末制备试验卡中所覆盖的药物溶液，然后将制备完成的药物溶液包被于空白试验卡中。

7.根据权利要求6所述的多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡的制备方法，其特征在于，所述无菌稀释液为MH肉汤+0.0001～0.001％聚山梨酯80溶液，PH7.2-7.4；或0.2％牛肉膏+1.75％酪蛋白酸水解物+0.0001～0.001％聚山梨酯80溶液，PH7.2-7.4。

8.根据权利要求6所述的多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡的制备方法，其特征在于，如果试验孔中含有磷霉素，则该孔的无菌稀释液中在权利7所述的无菌稀释液基础上还需添加25μg/ml的6-磷酸葡萄糖。

9.根据权利要求6所述的多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡的制备方法，其特征在于，所述试验卡中药物溶液的包被量为10-200ul，例如25-100ul。

10.根据权利要求6所述的多药耐药革兰氏阴性菌联合药敏试验卡的制备方法，其特征在于，所述包被采用冷冻干燥的方式进行干燥，或采用低温减压的干燥方式进行干燥。