CN106148179A - 葡萄球菌药敏板条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种葡萄球菌药敏板条，通过下列步骤制得：1)配置鼠尾草酚水溶液、2)分装、3)配置抗生素原液、4)分装液料、5)加样分装板条、6)板条干燥、7)真空包装、8)存储。本发明组合19种抗生素于同一块检测板，更准确提供各抗生素的MIC值。所述抗生素包括庆大霉素、利福平、红霉素、克林霉素、复方磺胺、万古霉素、青霉素、苯唑西林、氨苄西林、米诺环素、利奈唑胺、加替沙星、左氟沙星、头孢西丁、达托霉素、替加环素、呋喃妥因、链霉素、红霉素/克林霉素。本发明可以减少耐药菌株的滋生，更好的指导患者用药。对特殊耐药菌株的变异及疾病的防治起到监控的作用，具有重要的临床指导意义，有较大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物制剂。具体涉及一种葡萄球菌药敏板条及其制备方法。
背景技术
近20年来，由于临床上广泛大量使用种类繁多的抗菌药物，细菌的耐药性越来越普遍，有的细菌可同时耐2-7种药物，耐药菌株的广泛传播给临床治疗带来了很大的困难，加之临床诊治手段不断更新，虽然提高了诊断和治疗效果，但也带来了更多的交叉感染机会，使机体的免疫状态趋于低下。尤其引人注目的是感染类型发生了很大的变迁，而且还处于变化之中，这对临床微生物药敏的检测提出了更高的要求。目前用于微生物药敏检验的方法主要有纸片扩散法和稀释法。纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，通过细菌生长情况来判断药物对微生物的MIC值，此法在临床实验中存在一次性检测药物少、无法定量MIC值的缺点。稀释法是将抗菌药物的浓度经过倍比稀释，其中能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度为最小抑菌浓度(MIC)。稀释法通常通过微生物药敏板进行，但目前产品的药敏板条种类较少，不能满足各种类型细菌的药敏实验；药敏板条中抗生素的浓度梯度较少，大部分只可报告定性的敏感、中度敏感和耐药结果，而不能准确的报告出药物的MIC值。200510112030.2专利公开了一种葡萄球菌药敏板条及其制备方法。但是，该专利的葡萄球菌药敏板在临床使用时抗生素种类少，不能提供足够的用药信息，满足不了最新用药需求；抗生素类型不能适应临床菌株耐药性的改变；抗生素的浓度设计不能反映最新临床用药信息等。因而，本发明人根据最新的临床需求和美国临床实验室标准化委员会(CLSI)最新的相关标准，对葡萄球菌药敏板进行了创新性的改进，研究开发更有利于临床使用的葡萄球菌药敏板条。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种快速准确的，能够满足多种类型细菌检测的葡萄球菌药敏板。
本发明提供了一种葡萄球菌药敏板条。
本发明所述葡萄球菌药敏板条组合19种抗生素于同一块板；所述抗生素包括庆大霉素、利福平、红霉素、克林霉素、复方磺胺、万古霉素、青霉素、苯唑西林、氨苄西林、米诺环素、利奈唑胺、加替沙星、左氟沙星、头孢西丁、达托霉素、替加环素、呋喃妥因、链霉素和红霉素/克林霉素。
本发明人根据最新的临床需求和美国临床实验室标准化委员会(CLSI)最新的相关标准，对葡萄球菌药敏板进行了创新性的改进，研究开发更有利于临床使用的葡萄球菌药敏板条。本发明的药敏检测实验基于下列原理：药物敏感实验是指抗菌药物在体外对病原体有无抑制或杀灭作用的实验。各种细菌对不同抗菌药物的敏感性不同，同一种细菌中不同菌株的药敏也常有差异。药敏实验结果对临床合理选用抗菌药物有重要的参考价值。为测定微生物对某一抗感染药的敏感性，通常应用最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)表示，MIC值越高说明该微生物对该抗生素的敏感性越低。葡萄球菌药敏板使用微量稀释法进行MIC值的测定。本发明葡萄球菌药敏板条用于检测革兰阳性葡萄球菌的药敏板。对每种抗生素都有一系列倍比稀释浓度的抗生素试剂，通过加入待检细菌与肉汤培养液稀释的菌悬液，经18-24小时孵育后，用微生物鉴定药敏分析系统或肉眼判读的方法对葡萄球菌药敏板进行读数，经数据分析得到MIC值，并根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)的相应标准获得相应敏感(S)、中度敏感(I)和耐药(R)的结果。
本发明的另一目的是提供了所述葡萄球菌药敏板条的制备方法，该方法包括下列步骤：
(1)配置鼠尾草酚水溶液
蒸馏水中加入鼠尾草酚，使配制好的溶液中鼠尾草酚浓度为0.2mg/mL，进行121℃，15min灭菌处理，冷却后备用；
(2)分装
将配置好的鼠尾草酚水溶液分装为每试管15mL备用；
(3)配置抗生素原液
葡萄球菌药敏板条使用的抗生素原液浓度如下：
(4)分装液料
根据板条浓度稀释要求，将步骤(3)的抗生素原液加入到相应的分装好的(2)试管中；
(5)加样分装板条
使用分装系统在96孔的相应位置对指定的葡萄球菌药敏板加样，每孔加50μL；
(6)板条干燥
上述板条真空干燥4℃，610.5Pa条件下处理16-18小时；
(7)包装：
使用真空包装机对板条进行真空包装；
(8)板条存贮：包装完毕的板条于-20℃保存。
本发明制备中所述96孔板中各个孔的位置与常规板相同。
本发明所述葡萄球菌药敏板条的制备方法，所述步骤(4)分装液料中所述的板条浓度稀释如下：
本发明所述葡萄球菌药敏板条在使用过程中需加入100μL的样本，加入样本后，板条中抗生素浓度如下：单位为：μg/mL
葡萄球菌板条板药敏浓度梯度表
表注：POS＝positive control阳性对照孔
NEG＝negtive control阴性对照孔(操作时加入无菌肉汤培养液)。
葡萄球菌药敏板参考值(参考范围)的确定引用了美国临床实验室标准化委员会对葡萄球菌/肠球菌各种抗生素折点范围的规定。
抗菌药物的判定折点表
本发明与梅里埃的同类产品比对，结果的一致性达到了95％，达到了国际水准。同时，本发明创新设计组合19种抗生素于同一块检测板上，覆盖了现有葡萄球菌和肠球菌最新的临床用药，选择新增加的抗生素种类，根据CLSI用药指导，按照倍比稀释法创新性地设计了不同抗生素的使用浓度，使板条满足所有抗生素的使用浓度包含所有葡萄球菌的敏感和耐药点；将选定的抗生素合理的安排入96孔板的孔位中，可以更准确的提供各抗生素的MIC值。本发明的产品目前未见国内外任何报道。
本发明人对葡萄球菌药敏板的稳定性进行了改进。在本发明的葡萄球菌药敏板中加入抗生素，同时加入抗氧化剂鼠尾草酚，来抑制抗生素发生氧化，延长葡萄球菌药敏板的保存期，利于葡萄球菌药敏板的存贮。用鼠尾草酚作为抗氧化剂具有以下优点:1、抗氧化性强，其抗氧化能力是丁基羟基茴香醚(BHA)的2-4倍，亦强于2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、维生素E和维生素C等传统抗氧化剂；2、鼠尾草酚无毒副作用，不影响细菌生长；3、鼠尾草酚不与抗生素反应，不会使抗生素效价发生改变；4、鼠尾草酚的抗氧化性可以针对多种氧化物质，具有广谱的优点；5、鼠尾草酚化学性质稳定，可耐高温，其抗氧化活性在200℃处理18小时后，仍可保留70％以上。另外，在包装时采用真空包装机进行真空包装，真空包装的除氧功能，能防止抗生素的氧化。确保有效的延长葡萄球菌药敏板的保存期，使其能在2℃-25℃条件下保存，对于产品的储存更方便，并节约资源。
本发明产品与已有的微生物检测产品相比，具有新的临床用药指导意义，可以减少耐药菌株的滋生，更好的用于患者治疗。通过对各地区、各医院流行病学上的分析，对特殊耐药菌株的变异及疾病的防治起到监控的作用，对临床具有重要的指导意义，有较大的应用价值。
具体实施方式
实施例所用抗生素与试剂通过市售得到
使用的抗生素信息如下：所有抗生素规格均为100mg/支。
所有抗生素均采购自中国药品生物制品检定所。
实施例1
葡萄球菌药敏板条产品的生产:
(1)配置鼠尾草酚水溶液
称取0.4g鼠尾草酚充分溶解到2000mL蒸馏水中。
(2)将配置好的鼠尾草酚水溶液于121℃，15min灭菌处理，然后分装到灭菌好的96根试管中，每管分装15mL。
(3)配置各抗生素原液。
按照下表的浓度配置各抗生素的原液：
(4)配置各孔抗生素溶液
按照下述要求将抗生素原液或稀释液加入到待用的装有鼠尾草酚水溶液的15mL试管中。
(5)加样分装板条
将配置好的96根试管装在加样机上，使用加样机对指定的葡萄球菌药敏板加样，每孔加50μL；
(6)将加样好的板条放入干燥间的真空泵中4℃、610.5Pa进行真空抽干和干燥，16-18小时后板条干燥完毕；
(7)板条包装；
将干燥好的板条从干燥间传递窗送至包装间，使用东富龙真空冷冻干燥系统对板条进行真空包装。
(8)板条存贮：包装完毕的板条放入-20℃环境进行保存。
实施例2
葡萄球菌药敏板性能检测，方法来自于CLSI的肉汤稀释法。
(1)菌种复苏
启开质控菌株金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)(购自北京宝特医疗器械有限公司ATCC29213第一代菌株)，用0.9％生理盐水制成菌悬液，并适量接种至营养琼脂培养基中，35℃培养18-24小时。
(2)菌种传代
取适量上述复苏后的培养物接种至营养琼脂培养基斜面，35℃培养20小时。
(3)菌种增菌培养
接种上述传代后的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，35℃培养20小时。
(4)菌悬液配制
将上述增菌培养后的金黄色葡萄球菌的新鲜培养物用0.9％无菌氯化钠溶液稀释，经比浊后，配制成浊度为0.5麦氏标准的菌悬液。
(5)肉汤稀释
取60μL(4)中菌悬液，加入到12mL的营养肉汤培养基中，混合均匀。
(6)入板
将混合均匀的(5)中稀释液分别加入到葡萄球菌药敏板中，其中每孔的加入量为100μL。
(7)培养
将加样完毕的葡萄球菌药敏板放置于35℃培养24小时。
(8)结果分析
自培养箱中取出板条，擦净板条底部，肉眼判读各个孔位的阴阳性，混浊为阳性，清澈为阴性，得出各抗生素的MIC值，结果见下表：
实验结果表明，葡萄球菌药敏板用质控菌株金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)检验合格。
实施例3
葡萄球菌药敏板性能检测
(1)菌种复苏
启开质控菌株粪肠球菌(ATCC 29212)(同上)，用0.9％生理盐水制成菌悬液，并适量接种至营养琼脂培养基中，35℃培养18-24小时。
(2)菌种传代
取适量上述复苏后的培养物接种至营养琼脂培养基斜面，35℃培养22小时。
(3)菌种增菌培养
接种上述传代后的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，35℃培养22小时。
(4)菌悬液配制
将上述增菌培养后的粪肠球菌的新鲜培养物用0.9％无菌氯化钠溶液稀释，经比浊后，配制成浊度为0.5麦氏标准的菌悬液。
(5)肉汤稀释
取60μL(4)中菌悬液，加入到12mL的营养肉汤培养基中，混合均匀。
(6)入板
将混合均匀的(5)中稀释液分别加入到葡萄球菌药敏板中，其中每孔的加入量为100μL。
(7)培养
将加样完毕的葡萄球菌药敏板放置于35℃培养24小时。
(8)结果分析
自培养箱中取出板条，擦净板条底部，肉眼判读各个孔位的阴阳性，混浊为阳性，清澈为阴性，得出各抗生素的MIC值，结果见下表：
| 抗生素 | CLSI质控标准 | 测试结果 |
| MIC测定 | 29212 | 29212 |
| 氨苄西林 | 0.5-2 | 1 |
| 青霉素 | 1-4 | 2 |
| 苯唑西林 | 8-32 | ＞2 |
| 米诺环素 | 1-4 | 2 |
| 利奈唑胺 | 1-4 | 2 |
| 加替沙星 | 0.12-1 | 0.5 |
| 左氟沙星 | 0.25-2 | 1 |
| 红霉素 | 1-4 | 2 |
| 克林霉素 | 4-16 | ＞4 |
| 万古霉素 | 1-4 | 2 |
| 头孢西丁 | - | - |
| 达托霉素 | 1-4 | 2 |
| 利福平 | 0.5-4 | 2 |
| 替加环素 | 0.03-0.25 | ≤0.125 |
| 庆大霉素 | 4-16 | 8 |
| 呋喃妥因 | 4-16 | 8 |
| 甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 | ≤0.5/9.5 | ≤0.5/9.5 |
| 红霉素/克林霉素 | - | - |
| 庆大霉素(高浓度) | <250 | ＜250 |
| 链霉素 | <500 | ＜500 |
实验结果表明，葡萄球菌药敏板用质控菌株粪肠球菌(ATCC 29212)检验合格。
实施例4
葡萄球菌药敏板与市售产品性能对比实验
(1)确定对比实验产品
选择法国梅里埃VITEK2GP67药敏卡片作为本次临床实验的对比试剂。其中本发明：氨苄西林、青霉素、苯唑西林、米诺环素、加替沙星、利奈唑胺、左氟沙星、红霉素、克林霉素、万古霉素、头孢西丁、利福平、达托霉素、替加环素、庆大霉素、呋喃妥因、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、红霉素/克林霉素、庆大霉素(500)、链霉素(1000)；
采用的对比试剂为梅里埃VITEK2GP67药敏卡；而梅里埃VITEK2GP67药敏卡中不包含达托霉素、加替沙星、米诺环素这三种抗生素，所以这三种抗生素采用琼脂稀释法进行对比。另外由于本发明板条中的抗生素浓度梯度为自行设计与梅里埃VITEK2GP67药敏卡片浓度梯度不一致，因此，在最后结果比对时仅比对耐药性结果。
(2)选择质控菌株
根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)的相关规定，葡萄球菌药敏板使用下表中的质控菌株。
(3)实验方法
使用步骤(2)中的质控菌株，按照实施例2的实验方法进行实验。且每一质控菌株，重复3次实验，分别记录每块药敏板的质控菌株MIC值。同时按照梅里埃VITEK2GP67的使用说明书，进行同等数量的实验，并记录药敏板的质控菌株MIC值。
(4)质控菌株的质控范围
根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)的规定，葡萄球菌药敏板质控菌株的范围规定如下表：
质控菌株的MIC(μg/mL)范围
注：ATCC：American Type Culture Collection(美国菌种收藏中心)
“-”：表示此质控菌株不能对相应抗菌剂进行质控
(5)实验试剂与对比试剂检测结果统计处理方法
葡萄球菌药敏板检测结果同梅里埃VITEK2GP67药敏卡检测结果进行比对，结果不一致的再与琼脂稀释法结果比对，一致的为符合，不一致的为不符合。根据实验结果，分别统计菌株的标准符合率(CA)、一般错误率(MIE)、严重错误率(VME)、重大错误率(ME)。
标准符合率(CA)：实验方法和参考方法的结果利用CLSI解释规则进行解释，其解释结果(例如敏感S，中介I，或者耐药R)的符合率。其计算方法见下面的公式：
一般错误率(MIE):(1)参考系统的结果是耐药R或敏感S，而实验结果是中介I；或者(2)参考系统的结果是中介而实验结果是敏感S或耐药R。其计算方法见下面的公式
严重错误指参考方法的结果为R，而实验方法的结果为S，严重错误率(VME)的计算方法见下面的公式
重大错误率指参考系统的结果是敏感S，而实验结果是耐药R，重大错误率(ME)的计算方法见下面的公式
(6)实验试剂与对比试剂检测结果及分析
本次评估对286株临床上分离的葡萄球菌/肠球菌株进行了药敏检测，具体的结果见下表：
上海市第一人民医院临床样本药敏测试结果
上海市第十人民医院临床样本药敏测试结果
7实验结果及分析
在本次临床实验过程中，严格按照临床实验方案进行，未发生过修改方案的事件。
二家医院在检测临床样本时，葡萄球菌药敏板在对286株临床分离的革兰阳性葡萄球菌/肠球菌株的药敏测试中，其标准符合率(CA)达到97.54％，一般错误率(MIE)为0.88％，重大错误率(ME)为1.02％，严重错误率(VME)为0.50％。说明本产品与梅里埃公司生产的产品在检测性能上的符合率大于95％，达到国际水准。
实施例5
葡萄球菌稳定性试验
(1)将加有鼠尾草酚的葡萄球菌药敏板和未加鼠尾草酚的葡萄球菌药敏板条置于室温4℃，敞开于空气中放置48小时。
(2)菌种复苏
启开质控菌株粪肠球菌(ATCC 29212)(质控菌株购买自北京宝特医疗器械有限公司保存的ATCC第一代菌株)，用0.9％生理盐水制成菌悬液，并适量接种至营养琼脂培养基中，35℃培养18-24小时。
(3)菌种传代
取适量上述复苏后的培养物接种至营养琼脂培养基斜面，35℃培养22小时。
(4)菌种增菌培养
接种上述传代后的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，35℃培养22小时。
(5)菌悬液配制
将上述增菌培养后的粪肠球菌的新鲜培养物用0.9％无菌氯化钠溶液稀释，经比浊后，配制成浊度为0.5麦氏标准的菌悬液。
(6)肉汤稀释
取60μL(4)中菌悬液，加入到12mL的营养肉汤培养基中，混合均匀。
(7)入板
将混合均匀的(5)中稀释液分别加入到葡萄球菌药敏板中，其中每孔的加入量为100μL。
(7)培养
将加样完毕的葡萄球菌药敏板放置于35℃培养24小时。
(8)结果分析
自培养箱中取出板条，擦净板条底部，肉眼判读各个孔位的阴阳性，混浊为阳性，清澈为阴性，得出各抗生素的MIC值，结果见下表：
实验结果表明，使用鼠尾草酚作为抗氧化剂的葡萄球菌药敏板，用质控菌株粪肠球菌(ATCC 29212)检验合格。而未加鼠尾草酚作为抗氧化剂葡萄球菌药敏板，用质控菌株粪肠球菌(ATCC 29212)检验，发现板条中抗生素已经失效。说明在板条中加入抗氧化剂可以延长板条的保存时间。
Claims (4)
1.葡萄球菌药敏板条，其特征在于，所述葡萄球菌药敏板条组合19种抗生素于同一块板上；所述抗生素包括庆大霉素、利福平、红霉素、克林霉素、复方磺胺、万古霉素、青霉素、苯唑西林、氨苄西林、米诺环素、利奈唑胺、加替沙星、左氟沙星、头孢西丁、达托霉素、替加环素、呋喃妥因、链霉素和红霉素/克林霉素。
2.如权利要求1所述葡萄球菌药敏板条的制备方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：
(1)配置鼠尾草酚水溶液
蒸馏水中加入鼠尾草酚，使配制好的溶液中鼠尾草酚浓度为0.2mg/mL，进行121℃，15min灭菌处理，冷却后备用；
(2)分装
将配置好的鼠尾草酚水溶液分装为每试管15mL备用；
(3)配置抗生素原液
葡萄球菌药敏板条使用的抗生素原液浓度如下：
(4)分装液料
根据板条浓度稀释要求，将步骤(3)的抗生素原液加入到相应的分装好的(2)试管中；
(5)加样分装板条
使用分装系统在96孔的相应位置对指定的葡萄球菌药敏板加样，每孔加50μL；
(6)板条干燥
上述板条真空干燥4℃，610.5Pa条件下处理16-18小时；
(7)包装
使用真空包装机对板条进行真空包装；
(8)板条存贮
包装完毕的板条于-20℃保存。
3.根据权利要求2所述的葡萄球菌药敏板条的制备方法，其特征在于其中所述步骤(4)分装液料中所述的板条浓度稀释要求如下：
4.根据权利要求书2所述的葡萄球菌药敏板条的制备方法，其特征在于通过该方法制得的成品葡萄球菌药敏板条，在使用过程中需加入100μL的样本，加入样本后板条中抗生素浓度如下：单位：μg/mL
葡萄球菌板条板药敏浓度梯度表
上表中：POS＝positive control阳性对照孔
NEG＝negtive control阴性对照孔；操作时加入无菌肉汤培养液。
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