KR20070041021A - 헬리코박터 파이로리의 항생제감수성검사용 키트 및항생제감수성검사방법 - Google Patents

헬리코박터 파이로리의 항생제감수성검사용 키트 및항생제감수성검사방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori; H. pylori)의 항생제 감수성 검사용 키트 및 이를 이용한 항생제 감수성 검사방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 발색제를 첨가한 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 배지에, 배수 희석시킨 각종 항생제를 가하여 일정 농도가 되게 한 후 소정의 용적을 가지는 웰(well)이 다수개 포함되는 플레이트에 담지시켜 간단한 키트로 제조하여, 헬리코박터 파이로리가 매우 느리게 성장하는 미호기성 세균인 특성으로 인해 표준화된 항생제 감수성 검사방법을 결정하기가 어렵고 성장 여부를 눈으로 확인하기도 어려워 최소억제농도의 판정에 오류가 생기기 쉬운 문제점을 간단하게 해결하여 헬리코박터 파이로리가 소량 성장하더라도 배지의 색이 변하여 최소억제농도를 육안으로 쉽게 판정할 수 있도록 한 헬리코박터 파이로리의 항생제 감수성 검사용 키트 및 이를 이용한 항생제 감수성 검사방법에 관한 것이다.
헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 항생제 감수성 검사 (antimicrobial susceptibility test), 발색제, 항생제, 배지, 키트

Description

헬리코박터 파이로리의 항생제감수성검사용 키트 및 항생제감수성검사방법 {Kit for antimicrobial susceptibility testing of Helicobacter pylori and testing method for them}
도 1은 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 키트를 사용하여 측정한 항생제(MTZ와 CLR)에 대한 헬리코박터 파이로리의 최소억제농도(MIC)의 분포를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 헬리코박터 파이로리의 항생제 감수성 검사용 키트 및 이를 이용한 항생제 감수성 검사방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 발색제를 첨가한 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 배지에, 배수 희석시킨 각종 항생제를 가하여 일정 농도가 되게 한 후 소정의 용적을 가지는 웰(well)이 다수 개 포함되는 플레이트에 담지시켜 간단한 키트로 제조하여, 헬리코박터 파이로리가 매우 느리게 성장하는 미호기성 세균인 특성으로 인해 표준화된 항생제감수성검사방법을 결정하 기가 어렵고 성장 여부를 눈으로 확인하기도 어려워 최소억제농도의 판정에 오류가 생기기 쉬운 문제점을 간단하게 해결하여 헬리코박터 파이로리가 소량 성장하더라도 배지의 색이 변하여 최소억제농도를 육안으로 쉽게 판정할 수 있도록 한 헬리코박터 파이로리의 항생제 감수성 검사용 키트 및 이를 이용한 항생제 감수성 검사방법에 관한 것이다.
헬리코박터 파이로리는 인터루킨-8, 우레아제 등을 분비하여 위의 염증을 유발하고, 포스포리파제, 뮤시나제, 시토톡신 등을 분비하여 위점막의 보호작용을 방해하여 지속적인 위염을 일으키는 것으로 알려진 병원균이다. 헬리코박터 파이로리 감염 환자 중 소화성 궤양이 발생되는 비율은 10 ~ 20 % 이며, 십이지장 궤양 환자의 95 ~ 100%, 위궤양 환자의 75 ~ 85%에서 관찰되어, 헬리코박터 파이로리가 소화성 궤양의 중요한 발생 위험인자로 알려지게 되었다. 또한, 헬리코박터 파이로리에 의한 만성 표재성 위염이 완치되지 못할 경우 만성 위위축으로 진행되어 위선암의 발생률을 증가시키게 되므로 헬리코박터 파이로리의 감염은 위암의 위험인자가 되기도 한다.
헬리코박터 파이로리 감염이 소화성 궤양의 중요 유발인자로 밝혀지면서 소화성 궤양 치료에 큰 변화가 나타나게 되었다. 지속적인 위산분비 억제제 사용보다는 항생제치료에 의한 헬리코박터 파이로리 박멸이 궤양 재발에 더욱 효과적이라고 알려지고 있다. 헬리코박터 파이로리가 분리되는 소화성 궤양의 치료 시 위산분비억제제나 제산제만을 사용할 경우, 일 년후 재발율이 약 90%에 이르나 헬리코박터 파이로리를 박멸시키는 항균제로 병합치료 시에는 일 년후 재발율이 20% 이하로 떨 어진다고 알려져 있다. 그러나 병합요법 (Clarithromycin, CLR; Metronidazole, MTZ; Amoxicillin, AMX 등)에 사용되는 약제에 내성이 생기면 헬리코박터 파이로리의 박멸률은 상당히 떨어지므로, 헬리코박터 파이로리가 분리되는 소화성 궤양환자의 약물치료 시작 전에 감수성검사를 시행하여 특정 항생제에 내성인 경우에는 감수성이 있는 다른 약제를 사용하는 것이 바람직할 것이다.
한편, 헬리코박터 파이로리의 항균제 감수성 검사는 최근까지도 표준화된 방법이 없었으므로 연구자에 따라 다양한 방법, 배지, 균 접종량, 배양 기간 등이 사용되어왔었다[20-24]. 일반 세균의 항생제감수성검사 방법으로 널리 사용되고 있는 한천배지희석법, 액체배지희석법, E test 등이 주로 이용되었으나, 항균제 감수성검사법 중 가장 널리 쓰이고 있는 디스크확산법은 헬리코박터 파이로리의 경우에는 정확도가 떨어지는 것으로 보고되고 있다.
상기한 문제점을 해결하기 위하여, 미국의 NCCLS에서는 1999년에 최초로 혈액한천배지를 사용하는 한천배지희석법을 헬리코박터 파이로리 감수성 검사의 표준법으로 제시하였다[9]. 즉, 일반 세균의 감수성검사에서는 균부유액의 농도를 0.5 MacFarland 단위(1.5 x 108 CFU/mL) 사용하나 헬리코박터 파이로리의 경우에는 2 MacFarland 단위(6 x 108 CFU/mL)를 사용하도록 권장하고 있다. 상기 표준법이 나오기 전에는 연구자마다 각기 다른 균농도를 사용하였고 배양기간도 3 ~ 5일로 다양하여 최소억제농도 및 내성률을 판정하거나 비교하는 것이 어려웠다.
상기한 방법으로 헬리코박터 파이로리의 항균제 감수성 검사법은 표준화되었 으나, 내성 판정을 위한 브레이크 포인트(breakpoint)가 크라리트로마이신( clarithromycin)만 정해져 있고, 다른 항균제의 경우 내성 판정의 브레이크 포인트가 표준화되어 있지 않으므로 내성률 조사에서도 문제는 계속 남아 있다.
그러나, 한천배지희석법을 시행하기 위해서는 여러 농도의 항균제가 포함된 한천배지를 제조해야 하고 다점접종기(multipoint inoculator)를 사용하면 동시에 수십 개의 균주를 검사해야 하므로, 몇 개의 분리주를 대상으로 신속하게 항생제감수성검사를 실시해야 하는 병원 미생물검사실에서 일상적인 검사법으로 사용하기에는 많은 문제점이 존재한다.
상기한 문제점들을 해결하기 위하여 최근에는 희석법과 확산법을 병용한 연속적 항생제 농도 차이(continuous antibiotic concentration gradient) 원리를 이용하여 간편하게 항균제의 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정할 수 있는 제품 (E test, AB BIODISK, Sweden)이 개발되어 헬리코박터 파이로리의 항생제감수성검사에 도입되고 있다.
그러나, 상기 E test 방법은 항생제감수성검사용 스트립이 수입품이며 상당히 고가여서 의료보험수가로는 일반 병원에서 사용하기가 거의 불가능한 실정이다.
이러한 상황에서 연구자는 환자에게서 매일 분리되는 소수의 균주에 대해서도 간편하게 적용할 수 있는 실용적인 항생제감수성검사용 키트 및 감수성검사 방법을 개발한 것이다.
본 발명의 발명자는 상기한 문제점들을 해결하고 헬리코박터 파이로리에 대한 보다 간편하고 경제적인 항생제감수성검사법을 찾기 위하여 연구 노력하였다.
그 결과, 헬리코박터 파이로리의 항생제 감수성 검사용 배지에 테트라졸리움 염(tetrazolium salt) 계열의 발색제인 트리페닐테트라졸리움 클로라이드(triphenyltetrazolium chloride)나 알라마 블루(Alamar blue)를 가하고 함유시키고, 여기에 배수 희석시킨 각종 검사대상 항생제(metronidazole, clarithromycin, amoxicillin 등)를 일정 농도로 첨가하여 소정의 용적을 가지는 웰(well)을 다수개 가지는 용기에 담지한 다음 밀봉하여 키트를 제조할 경우 상기한 문제점을 해결할 수 있음을 알게되어 본 발명을 완성하였다.
상기한 본 발명의 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트에 검사 대상인 헬리코박터 파이로리를 접종하여 배양시킬 경우 헬리코박터 파이로리가 소량 성장하더라도 연한 미색인 액체배지의 색이 변색하여 최소억제농도를 육안으로 쉽게 판정할 수 있다.
따라서, 본 발명은 환자에게서 분리되는 소수의 균주에 대해서도 간편하게 적용할 수 있는 경제적인 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트 및 감수성검사 방법를 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 소정의 용적을 가지는 멀티-웰(multi-well) 플레이트에, 발색제와 항생제를 함유하는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 항생제 감수성 검사 용 배지가 담긴 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트를 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트에 순수 계대배양한 헬리코박터 파이로리 균집락을 멸균된 생리식염수에 부유시켜 균수를 조절한 후 상기 키트의 개별 웰에 접종하는 단계와, 상기 헬리코박터 파이로리가 접종된 키트를 CO2 5 ~ 10 부피%, O2 5 ~ 10 부피% 및 N2 75 ~ 90 부피%를 포함하는 미호기성 공기 조건으로 37℃에서 3 일간 배양시켜 키트 내에 담지된 배지의 변색 여부를 판단하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사 방법을 포함한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 발색제를 첨가한 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 배지에, 배수 희석시킨 각종 항생제를 가하여 일정 농도가 되게 한 후 소정의 용적을 가지는 웰(well)이 다수개 포함되는 플레이트에 담지시켜 간단한 키트로 제조하여, 헬리코박터 파이로리가 매우 느리게 성장하는 미호기성 세균인 특성으로 인해 표준화된 항생제 감수성 검사방법을 결정하기가 어렵고 성장 여부를 눈으로 확인하기도 어려워 최소억제농도의 판정에 오류가 생기기 쉬운 문제점을 간단하게 해결하여 헬리코박터 파이로리가 소량 성장하더라도 배지의 색이 변하여 최소억제농도를 육안으로 쉽게 판정할 수 있도록 한 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트 및 이를 이용한 항생제 감수성 검사방법에 관한 것이다.
본 발명의 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트는 소정의 용적을 가지는 멀티-웰(multi-well) 플레이트에, 발색제와 항생제를 함유하는 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 배지가 담지되어 구성된다.
상기 발색제는 테트라졸리움 염(tetrazolium salt)로서, 구체적으로 2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드(2,3,5-tri phenyltetrazolium chloride) 또는 알라마 블루(alamar blue) 등을 사용한다.
상기 발색제로서 테트라졸리움 염은 배지 내에 20 ~ 60 mg/L 농도, 바람직하기로는 30 ~ 50 mg/L 농도로 사용하는 것이 좋은데, 이때 발색제의 사용량이 20 mg/L 미만이면 발색이 선명하지 않고, 60 mg/L를 초과하면 비특이적인 발색이 생길 수 있는 문제점이 있다.
상기 항생제는 헬리코박터 파이로리 감염 환자 치료에 이용되는 것을 사용하며, 이러한 항생제로서는 클라리쓰로마이신(clarithromycin, CLR), 아목시실린 (amoxicillin, AMX), 메트로니다졸(metronidazole, MTZ) 등이 있다.
상기한 각 항생제를 일정 농도로 배수 희석하여 본 발명의 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트에 사용할 수 있는데, 상기한 항생제 중 어느 하나의 항생제에 내성을 보인 경우에는 헬리코박터 파이로리 감염 환자 치료의 특성상 새로운 항생제를 사용하여야 한다. 본 발명의 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트에는 상기 다양한 항생제를 변경하여 적용할 수 있으므로 사용자 친화적인 방법이라 할 수 있다.
본 발명의 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트에 사용할 배지는 통상적으로 실험실에서 적용되는 방법으로 제조할 수 있으며, 그 제조방법은 특별 히 한정하지 않지만, 일례를 들어 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
즉, 본 발명의 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트에 사용할 배지는 제조사에서 추천하는 방식대로 제조하여 멸균시키는데, 바람직하기로는 121 ℃에서 15 분 멸균시키는 방법을 적용한다. 상기 각종 항생제와 이외의 배지 제조에 필요한 BBL IsoVitaleX, 송아지 혈청, 양 혈액 등의 첨가제와, 테트라졸리움 염을 유효성분으로 하는 발색제를를 상기 멸균된 배지를 약 50℃ 정도로 식힌 후 첨가한다.
이때, 상기 항생제는 키트를 이루는 각 웰에 서로 다른 농도로 포함시키는데, 예를 들어, 각종 검사대상 항생제를 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32 mg/mL 등으로 달리하여 포함된 배지를 상기 키트를 구성하는 각 웰에 넣는다.
상기 배지의 양은 멀티-웰 플레이트를 구성하는 개별 웰의 용적에 따라서 달라지나 일반적으로 각 웰에 평균 200 ㎕ 씩 넣는다.
상기 배지는 필요에 따라 액상, 반고상, 및 고상으로 제조될 수 있으며, 반소상 및 고상의 배지를 제조하고자 할 경우에는 배지를 굳힐 수 있는 성분을 배지에 부가할 수 있으며, 일반적으로 한천 분말(agar powder)를 사용할 수 있고, 상기 반고상 및 고상의 배지를 제조하기 위하여 사용되는 한천 분말 등은 배지의 성상을 다르게 할 뿐, 특성에는 영향을 미치지 않는 것을 선택사용하여야 한다.
상기 제조된 키트는 알루미늄 필름 등의 밀봉 가능한 재료를 사용하여 실러( sealer) 등을 사용하여 밀봉 팩킹하여 제품화된다.
상기 제품화된 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트는 4 ~ 10℃ 에서 냉장 보관시킬 경우 평균 30일 간 장기보관 가능하다.
본 발명의 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트는 소정의 용적을 가지는 멀티-웰(multi-well) 플레이트에 상기한 바와 같은 발색제와 항생제를 함유하는 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 배지가 담지되어 구성되는데, 상기 멀티-웰(multi-well) 플레이트는 특별히 한정하는 것은 아니지만, 통상적으로 사용하는 세포 배양용 또는 면역검사용 플레이트를 사용할 수 있으며, 웰의 개수는 사용자의 편의에 따라 헬리코박터 파이로리 한 균주용, 두 균주용, 5 균주용, 10 균주용 등 사용자의 주문대로 만들 수 있어 매우 실용적이고 경제적이다. 바람직하기로는 세포 배양용 또는 면역검사용 플레이트 중 8개씩 분리되는 96-웰 플레이트[도 1 참고]를 사용할 수도 있다.
이하, 본 발명의 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트를 사용한 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사 방법을 구체적으로 설명한다.
먼저, 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트에 순수 계대배양한 헬리코박터 파이로리 균집락을 멸균된 생리식염수에 부유시켜 균수를 조절한 후 상기 키트의 개별 웰에 접종한다.
상기 계대배양한 헬리코박터 파이로리 균집락은 균수를 맥 파란드 넘버 2(McFarland No. 2, 6 x 108 CFU/mL)에 맞춘 다음 배지에 접종시킨다. 이때, 상기 배지가 액상일 경우에는 각 웰에 상기 균수가 조절된 부유액을 약 20 ㎕씩 가 하는 것이 가장 바람직하며, 상기 배지가 반고상 또는 고상일 경우에는 상기 균수가 조절된 부유액을 약 1 ~ 2 ㎕ 씩 각 웰에 접종시킨다.
상기 헬리코박터 파이로리가 접종된 키트를 CO2 5 ~ 10 부피%, O2 5 ~ 10 부피% 및 N2 75 ~ 90 부피%를 포함하는 미호기성 공기 조건으로 평균 37℃에서 3 ~ 6 일간 배양시켜 키트 내에 담지된 배지의 변색 여부를 판단한다. 이때, 상기 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트의 개별 웰 중에서 변색되지 않은, 즉, 균이 성장되지 않은 개별 웰에 포함된 가장 낮은 항생제의 농도로서 헬리코박터 파이로리 성장의 최소억제농도를 판단한다. 항생제의 농도가 헬리코박터 파이로리의 성장을 억제하지 못할 경우에는 헬리코박터 파이로리가 자라게 되므로 발색제의 유효성분인 테트라졸리움 염에 의해 배지가 변색되게 된다. 이때, 변색되지 않는 가장 낮은 농도, 즉 헬리코박터 파이로리의 성장을 억제하는 항생제 농도 중 가장 낮은 농도를 찾아서 최소억제농도를 결정하는 것이다.
상기와 같은 본 발명에 의하면 성장 속도가 느리고 배양하기 어려워서, 항생제감수성검사시 내성과 감수성을 판별하는 최소억제농도를 결정하기 어려운 헬리코박터 파이로리의 성장 여부를 눈으로 쉽게 식별할 수 있으며, 미국 임상 및 검사표준화기관(Clinical and Laboratory Standards Institute)에서 추천하는 한천배지희석법 등과는 달리 환자에게서 분리되는 소수의 균주를 대상으로도 간편하고 정확하게 적용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시 예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
참고예 1
본 발명에서 사용된 헬리코박터 파이로리 균주는 한양대학교 구리병원 소화기내과환자들에게서 채취한 위생검 (stomach biopsy) 조직에서 분리하였으며, 검체는 채취 후 즉시 수송배지(20% 포도당 용액)에 넣어 진단검사의학과 미생물검사실로 가져온 후 멸균된 공이(micropestle)로 분쇄하여 5% 면양혈액한천배지에 접종시켰다. 37℃, 고습도의 미호기성 조건(CampyPak Plus, BBL, Cockeysville, USA)에서 3일 내지 6일간 배양시킨 후 헬리코박터 파이로리로 의심되는 균집락이 관찰되면 그람(gram) 염색, 우레아제(urease), 카탈라제(catalase), 옥시다제(oxidase) 검사를 시행하였다. 그람염색에서 핑크색의 만곡된 간균이 관찰되고, 우레아제(urease), 옥시다제(oxidase), 카탈라제(catalase) 양성이면 헬리코박터 파이로리로 동정하고 계대배양을 실시하여 항생제감수성검사에 사용하였다.
실시예: 변법 액체배지 미량희석법(Modified Broth Microdilution Method, M-BMD)
Brain Heart Infusion (BHI) 분말 37 g을 증류수 1 L에 넣고 약 1분간 잘 저으면서 끓인 다음 121℃에서 15분간 멸균시킨다. 약 50℃로 식힌 후, 발색제인 2,3,5-트리 페닐테트라졸리움 클로라이드(2,3,5-tri phenyltetrazolium chloride)를 40 mg/L 가한다.
BHI 액체배지를 160 uL씩 멀리-웰 플레이트의 각 웰에 넣은 후, 배수 희석시킨 메트론이미다졸(metronidazole, MTZ)과 클라리쓰로마이신(clarithromycin , CLR)을 각각 20 uL씩 가하여 각 웰의 MTZ 농도가 0.25 mg/L 부터 128 mg/L까지, CLR은 0.125 mg/L부터 64 mg/L가 되도록 하였다.
여기에 순수 계대배양시킨 헬리코박터 파이로리 집락을 송아지 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS) 5%와 2,3,5-트리 페닐테트라졸리움 클로라이드 40 mg/L가 든 BHI 액체배지에 부유시켜 맥파란드 넘버 2 (McFarland No. 2 ; 6 × 108 CFU/mL)에 맞춘 다음 20 uL씩 각 well에 가하였다. 이를 미호기성 조건에서 37℃, 3일간 배양시킨 후 최소억제농도를 판정하였으며, 그 결과는 첨부도면 그림 2에 나타낸 바와 같았다. 도 1에 의하면 헬리코박터 파이로리 119 균주의 최소억제농도(MIC)는 0.5 mg/L 5예, 1 mg/L 19예, 2 mg/L 23예, 4 mg/L 17예, 8 mg/L 19예, 16 mg/L 19예, 32 mg/L 9예, 64 mg/L 6예, 128 mg/L 2예의 비교적 고른 분포를 나타내었고, MIC50 및 MIC90은 각각 4 mg/L, 32 mg/L이었으며, 헬리코박터 파이로리의 MTZ 내성률을 46.2% 이었다.
비교예 1 : E 테스트
BHI 액체배지에 맥 파란드 넘버 2.0 혼탁도에 해당하는 헬리코박터 파이로리 부유액을 만들었다. 면봉에 상기 부유액을 충분히 묻힌 후 테트라졸리움 40 mg/L가 든 난황 에멀젼(egg yolk emulsion, EYE) 배지에 골고루 바른 다음 CLR 및 MTZ E 테스트 스트립을 놓았다. 이를 미호기성 조건, 37℃ 하에서 3일간 배양시킨 후 항균제에 의한 억제대가 E 테스트 스트립과 교차하는 점을 찾아 최소억제농도를 판정하였다.
비교예 2 : 디스크확산법
헬리코박터 파이로리 부유액을 맥파란드 넘버 2.0의 표준액에 맞추고 E 테스트와 같은 방식으로 접종한 후 MTZ 디스크(5mg, Oxoid, Unipath Ltd, UK)와 CLR 디스크(15mg, Oxoid, Unipath Ltd, UK)를 놓았다. 디스크확산법에서도 테트라졸리움 솔트 40 mg/L가 든 EYE 배지를 사용하였다. 접종시킨 EYE 배지를 37℃ 미호기성 조건에서 3일간 배양시킨 후 억제대의 직경을 측정하였다.
참고예 2
[내성판정의 기준]
분리된 균주의 MTZ에 대한 MIC 값이 8 mg/L 이상, 또는 디스크법의 억제대 직경이 15 mm 미만일 경우를 내성으로 판독하였고, CLR에 대해서는 MIC가 1 mg/L 이상 또는 억제대 직경이 18 mm 미만을 내성으로 판독하였다.
[항생제감수성 검사법간의 정밀도와 정확도 비교를 위한 평가 기준]
항생제감수성검사법간의 정밀도 비교를 위해서 일배수 희석범위 내 희석(within-1-dilution, ± 1 log2 dilution) 일치율을 사용하였고, 정확도 비교를 위 하여 감수성 카테고리(susceptibility category) 일치율과 very major discrepancy 및 major discerpancy를 이용한 Jorgensen의 평가기준을 적용하였다.
상기 실시 예 (변법 액체배지 미량희석법, Modified Broth Microdilution Method, M-BMD) 및 비교 예 1 (E 테스트), 비교 예 2 (디스크확산법)의 MTZ 감수성검사 결과를 다음 표 1 ~ 5에 나타내었다.
log2 희석에 의한 MIC 분포
<-2 -2 -1 1 +1 +2 >2
분리주 수 2 2 6 29 23 20 10
% 2.2 2.2 6.5 31.5 25.0 21.8 10.9
± log2 일치율: 63.0 %
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 (변법액체배지희석법)를 기준으로 할 때 비교예 1 (E 테스트)의 1-범위 내 희석 일치율은 MTZ의 경우 63.0 % 이었다.
실시 예 비교예 1 (E 테스트) 계
감수성 내성
감수성 38 (43.7%) 12 (13.8%) 50 (57.5%)
내성 1 (1.1%) 36 (41.4%) 37 (42.5%)
계 39 (44.8%) 48 (55.2%) 87 (100%)
실시예 비교예 2 (디스크확산법) 계
감수성 내성
감수성 35 (40.2%) 15 (17.2%) 50 (57.4%)
내성 2 (2.3%) 35 (40.2%) 37 (42.5%)
계 37 (42.5%) 50 (57.4%) 87 (100%)
비교예 1 (E 테스트) 비교예 2 (디스크확산법) 계
감수성 내성
감수성 35 (40.2%) 4 (4.6%) 39 (44.8%)
내성 2 (2.3%) 46 (52.9%) 48 (55.2%)
계 37 (42.5%) 50 (57.5%) 87 (100%)
상기 표 2와 표 3 및 표 4에 각각 나타낸 바와 같이, 실시예를 기준으로 할 때 감수성 카테고리 일치율은 비교예 1의 경우 85.1%, 비교예 2는 80.4%였으며, 비교예 1과 비교예 2의 일치율은 93.1% 이었다.
비교 불일치율 % 일치율(%)
very major major
실시예 : 비교예 1 1.1 13.8 85.1
실시예 : 비교예 2 2.3 17.2 80.5
비교예 1 : 비교예 2 2.3 4.6 93.1
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 실시예를 기준으로 비교예 1과의 정확도를 비교하면 매우 불일치의 경우 1.1%, 불일치는 13.8%였고, 비교 예 2의 경우는 각각 2.3%와 17.2% 였다. 즉, 비교예 1 및 2는 모두 매우 불일치의 허용범위 내 이었으나, 불일치의 경우는 허용범위를 벗어나는 결과를 나타내었다. 그러나, 비교예 1을 기준으로 할 경우 비교예 2와 비교하면 각각 2.3%, 4.6%로 허용범위에 들었다.
상기 실시예 및 비교예 1 내지 2의 CLR의 감수성 검사의 측정 결과는 첨부 그림 2에 나타낸 바와 같이, 실시예에 의한 CLR의 최소억제농도(MIC)는 총 89예 중 0.125 mg/L 이하가 87 예였고, 32 mg/L 1 예, 64 mg/L 1 예였으며, MIC50 및 MIC90은 모두 0.125 mg/L 이하였다. MIC가 2mg/L 이상일 경우 모두 내성으로 판정하였으며 헬리코박터 파이로리의 CLR 내성율은 2.2%이었다. 실시예와 비교예 1, 실시예와 비교예 2, 비교예 1과 비교예 2 사이의 감수성 카테고리 일치율도 모두 100 % 이었다.
본 발명의 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트를 사용하면, 미국 임상 및 실험실 표준화 기관 (Clinical and Laboratory Standards Institite, CLSI)이 표준법으로 추천하는 한천배지희석법에 비하여 매우 간편하고 경제적으로 헬리코박터 파이로리 항생제감수성검사를 시행할 수 있어, 표준법으로도 판정하기 힘든 H. pylori의 최소억제농도를 쉽고 정확하게 판독할 수 있으므로 감수성검사결과가 정확하여 환자 진료에 도움이 될 것이다.
또한, 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사 방법이 쉬워져서 헬리코박터 파이로리 감염이 있는 환자들에 대해 항생제치료를 시작하기 전에 항생제감수성검사를 실시하여 불필요한 항생제 치료를 막을 수 있고, 치료 성공률을 높일 수 있다.
또한, 현재 많은 병원에서 사용하고 있는 수입품 (E test strip)을 대체하여 외화 절약 및 국산품 대체 효과를 기대할 수 있으며, 사용자의 선택에 따라 각종 치료용 항생제가 든 키트를 쉽게 바꾸어 제조할 수 있으므로 유연성이 매우 뛰어나다.

Claims (8)

  1. 소정의 용적을 가지는 멀티-웰(multi-well) 플레이트에, 발색제와 항생제를 함유하는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 항생제 감수성 검사용 배지를 넣는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 발색제는 테트라졸리움 염(tetrazolium salt)을 유효성분으로 하는 것임을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 테트라졸리움 염(tetrazolium salt)을 유효성분으로 하는 발색제는 2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드(2,3,5-tri phenyltetrazolium chloride) 또는 알라마 블루(alamar blue)인 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 발색제는 20 ~ 60 mg/L 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 멀티-웰(multi-well) 플레이트를 구성하는 각 웰에 포함되는 항생제의 농도는 서로 다르게 조성되는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 배지가 담긴 멀티-웰 플레이트는 멸균 및 밀봉처리된 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트.
  7. 청구항 1의 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트에 순수 계대배양한 헬리코박터 파이로리 균집락을 멸균된 생리식염수에 부유시켜 균수를 조절한 후 상기 키트의 개별 웰에 접종하는 단계와,
    상기 헬리코박터 파이로리가 접종된 키트를 CO2 5 ~ 10 %, O2 5 ~ 10 % 및 N2 75 ~ 90 %를 포함하는 미호기성 공기 조건으로 평균 37℃에서 3 ~ 6 일간 배양시켜 키트 내에 있는 배지의 변색 여부를 판단하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사용 키트의 개별 웰 중에서 변색되지 않은 개별 웰에 포함된 가장 낮은 항생제의 농도로서 헬리코박터 파이로리 성장의 최소억제농도를 판단하는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 항생제 감수성 검사 방법.
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