CN104586869B - 一种提高抗生素清除病原菌的小分子代谢物 - Google Patents
一种提高抗生素清除病原菌的小分子代谢物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体公开了一种小分子化合物丙氨酸（Alanine）的新用途。本发明通过研究发现丙氨酸能够增强抗生素杀死病原菌包括耐药菌的作用。因此本发明所提供的小分子代谢物丙氨酸，可作为药物提高抗生素的杀菌功能。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种提高抗生素清除病原菌的小分子代谢物。
背景技术
病原菌严重危害人类身体健康，需要采用有效措施进行防治。虽然抗生素能够有效杀死细菌，但由于抗生素的滥用，细菌产生了耐药性。具有耐药性的细菌使原本有效的抗生素治疗效果降低或丧失，导致感染难以控制。因此，采用新的方法控制细菌特别是耐药菌的感染十分重要。
增强细菌对抗菌药物的敏感性是目前控制多重耐药菌的一个热点研究领域。这一抗菌途径需要建立在克服耐药机制的基础上。如针对细菌产生的bete-内酰胺酶，可以研究合成酶抑制剂，以便将酶抑制剂和抗菌药物联合使用，达到在克服细菌耐药的同时发挥抗菌药物杀菌作用的目的。目前，临床可供使用的有bete-内酰胺酶抑制剂和青霉素(或头孢菌素)复方应用。进一步研究促进细菌对抗生素敏感性的药物，与抗生素一起制备成复方制剂，对控制细菌特别是耐药菌的感染十分重要。
丙氨酸是构成蛋白质的基本单位，是组成人体蛋白质的20种氨基酸之一。它的分子式是C3H7O2N，有α-丙氨酸和β-丙氨酸两种同分异构体。现有技术中已公开丙氨酸可以预防肾结石、协助葡萄糖的代谢，有助缓和低血糖，改善身体能量。而关于丙氨酸能否提高抗生素和宿主清除病原菌的研究并未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供丙氨酸（Alanine，Ala）作为一种提高抗生素清除病原菌的小分子代谢物质，达到控制细菌特别是耐药菌感染目的的技术方法。
本发明发现添加丙氨酸后，卡那霉素对迟缓爱德华耐药菌的杀菌作用明显提高，呈现卡那霉素浓度效应、丙氨酸浓度依赖性和作用时间相关性。这些结果说明，丙氨酸可以增强迟缓爱德华耐药菌对卡那霉素的敏感性。作为对照组的非耐药菌也对抗生素的敏感性也得到提高。
本发明通过添加丙氨酸后，提高了迟缓爱德华菌多重耐药菌，氨苄青霉素、巴洛沙星和四环素的耐药菌株对卡那霉素敏感性，说明这种作用可以适用于不同耐药机制的耐药菌。
本发明通过添加丙氨酸后，不同程度地提高了迟缓爱德华菌多重耐药菌对庆大霉素、新霉素、头孢他啶、氨曲南、头孢唑林钠、巴洛沙星和吉他霉素的敏感性，说明这种作用可以适用于不同抗生素。
本发明通过添加丙氨酸后，不同程度地提高了迟缓爱德华菌、副溶血弧菌、乙型链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌对庆大霉素的敏感性，说明这种作用可以适用于不同病原菌。
本发明通过添加葡萄糖后，迟缓爱德华耐药菌在用卡那霉素处理时生存率明显下降，说明葡萄糖可以提高卡那霉素耐药菌对卡那霉素的敏感性。进一步通过丙氨酸和葡萄糖两种物质联用的添加试验，发现这两种添加物质具有明显的协同作用。
进一步采用小鼠慢性尿道感染模型，于尿道中植入耐药菌生物膜，然后注射卡那霉素与丙氨酸或/和葡萄糖进行治疗。结果发现，添加物质的治疗组具有明显的杀菌效果，其中以2种小分子物质与抗生素联用效果最佳。同时对肾脏组织中的细菌含量进行检测，结果发现卡那霉素与丙氨酸或/和葡萄糖治疗组细菌数明显下降，其中以2种小分子物质与抗生素联用效果最佳。这些结果说明，卡那霉素与丙氨酸或/和葡萄糖联合可以有效清除动物机体内的耐药菌。
本发明发现丙氨酸通过提高细菌质子动力势（PMF），促进抗生素进入胞内，使胞内抗生素含量增加，从而提高细菌对抗生素敏感性
综上所述，在抗生素中添加丙氨酸能够明显提高耐药菌和非耐药菌对抗生素的敏感性，为耐药菌的治疗提供了一种崭新的技术方法。
由此，发明公开并保护了丙氨酸在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用。其可用于制备抑菌或杀菌的药物，进一步增强细菌或耐药菌对抗生素的敏感性。
同时，发明公开并保护了一种提高细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于将丙氨酸与抗生素联用。
所述的细菌包括但不限于为迟缓爱德华菌、副溶血弧菌、乙型链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。因为这些细菌是常见人类和养殖动物致病菌，其中金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌为革兰氏阳性菌，迟缓爱德华菌、副溶血弧菌和肺炎克雷伯菌为革兰氏阴性菌。这些细菌可以是耐药菌，也可以是非耐药菌。这些细菌为常见的病原菌，且常见其耐药菌株，故这些细菌为耐药和非耐药菌的较好代表菌。
所述的抗生素选自但不限于为卡那霉素、庆大霉素、新霉素、头孢他啶、氨曲南、头孢唑林钠、巴洛沙星和吉他霉素。因为氨曲南、头孢他啶和头孢唑林钠为β-内酰胺类抗生素；巴洛沙星为喹诺酮类抗生素；庆大霉素、卡那霉素和新霉素为氨基糖苷类抗生素；吉他霉素为氯霉素类抗生素。这些包括了目前临床使用的主要抗生素类型。
所述的丙氨酸与抗生素的剂量比例按重量计为1:0.0015~300。
应用上述方法来提高细菌对抗生素的敏感性时，丙氨酸的使用浓度为3mg~30g/次给药。
通过本发明所公开的内容，还可制备出一种新的抑菌或杀菌剂，该剂含有抗生素和丙氨酸；或者一种提高抗生素对耐药菌抑菌或杀菌作用的制剂，其主要成分为丙氨酸和抗生素。
尽管在本发明的实施例中，所列举的细菌包括迟缓爱德华菌、副溶血弧菌、乙型链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。尤其是本发明多数验证试验是以迟缓爱德华菌作为研究对象的。但是，这些细菌并不能作为对本发明保护范围的限制。这是因为1）金黄色葡萄球菌为研究耐药机制的模式菌。2）上述细菌分别属于革兰氏阴性和阳性细菌，其中金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌为革兰氏阳性菌，迟缓爱德华菌、副溶血弧菌和肺炎克雷伯菌为革兰氏阴性菌。而所有人类和养殖动物病原菌均可以按照该染色进行分类，故上述细菌具有较好的代表性。3）细菌可以具有耐药和非耐药状态，即同一细菌的耐药和非耐药菌株，而本发明的对照菌株即为相对非耐药状态，在添加丙氨酸后亦提高了对抗生素的敏感性。因此，根据上述原理从这些菌种可以推知到更多的菌种也适宜于本发明的理念。
本发明实施例所列举的抗生素为卡那霉素、庆大霉素、新霉素、头孢他啶、氨曲南、头孢唑林钠、巴洛沙星和吉他霉素。但同样的，这些抗生素也并不能作为对本发明保护范围的限制。这是因为虽然抗生素的品种数以百计，但可以根据其化学结构和抗菌机制可以分类，相似化学结构的具有相同的抗菌机制，因此不需要一一进行验证。目前，临床主要常用抗生素分为：青霉素类抗生素，头孢菌类抗生素，喹诺酮类抗生素，氨基糖苷类抗生素等。氨曲南、头孢他啶和头孢唑林钠为β-内酰胺类抗生素；巴洛沙星为喹诺酮类抗生素；庆大霉素、卡那霉素和新霉素为氨基糖苷类抗生素；吉他霉素为氯霉素类抗生素。这些包括了目前临床使用的主要抗生素类型。因此，具有很好的抗生素代表性。本领域技术人员根据本发明的理念，可以容易地推知到，临床其余多种抗生素也同样能适用于本发明所述的方法。
发明同时发现丙氨酸和葡萄糖联用，在提高细菌对抗生素敏感性方面具有明显协同作用。
优选地，丙氨酸和葡萄糖的重量比为1：0.0001~10000。
优选地，所述的抗生素选自卡那霉素、庆大霉素、新霉素、头孢他啶、氨曲南、头孢唑林钠、巴洛沙星和吉他霉素。
附图说明
图1为丙氨酸可提高迟缓爱德华氏耐药菌对卡那霉素的敏感性结果，A、B和C图分别表明此作用具有丙氨酸浓度依赖性、卡那霉素浓度效应和与作用时间相关。
图2为迟缓爱德华菌的氨苄耐药菌、巴洛沙星耐药菌和四环素耐药菌的MIC测定结果。
图3为迟缓爱德华氏菌对多种抗生素的MIC测定结果。
图4为丙氨酸提高迟缓爱德华菌及其耐药菌对卡那霉素的敏感性（A）以及提高多种病原菌对庆大霉素的敏感性（B）结果。
图5为丙氨酸提高迟缓爱德华菌对多种抗生素敏感性的结果。
图6为丙氨酸通过提高细菌PMF（A）使进入胞内抗生素含量增多（B）而提高细菌对抗生素敏感性测定结果。
图7为丙氨酸和葡萄糖协同作用显著提高耐药菌对卡那霉素的敏感性测定结果。A、B和C图分别表明葡萄糖提高敏感性结果、丙氨酸协同葡萄糖（B）和葡萄糖协同丙氨酸（C）提高敏感性结果。
图8为丙氨酸和葡萄糖提高小鼠对迟缓爱德华菌的清除结果。A为生物膜上的清除效果，B为小鼠肾脏清除效果。
具体实施方式
下面通过说明书附图和具体实施例对本发明进一步具体描述。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有常规的方法，所使用的配料或材料，如无特殊说明，均为通过商业途径可得到的配料或材料。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
实施例1迟缓爱德华菌人工传代耐药菌株的获得和野生耐药菌的确认
1、人工传代迟缓爱德华菌LTB4耐药菌株的获得：用两倍稀释法检测迟缓爱德华菌LTB4起始株(命名为LTB4-S)对卡那霉素(Kanamycin)的最小抑菌浓度。继而将LTB4-S以105菌落形成单位/毫升的数量在含1/2最小抑菌浓度卡那霉素的培养基中连续培养10代，测定其最小抑菌浓度。如果其最小抑菌浓度/起始最小抑菌浓度 > 4, 则该菌株对该抗生素表现出耐药性，即为耐药菌株。结果发现，选择出的菌株的最小抑菌浓度为200µg/mL，是起始株LTB4-S（3.125µg/mL）的64倍，说明获得了迟缓爱德华菌LTB4的卡那霉素耐药菌株（命名为LTB4-R）。
2、野生迟缓爱德华菌卡那霉素耐药菌株的确认：将实验室-80℃保存的迟缓爱德华菌EIB202划线于LB平板上，置于30℃恒温培养箱培养24小时；从平板上挑取单菌落，接种于5mL LB培养基中，30℃、200rpm培养至饱和；按1：100（v/v）的比例接种于5mL的LB液体培养基中，30℃培养至OD600值为0.5，测定最小抑菌浓度。结果发现，EIB202的最小抑菌浓度为12.5 µg/mL，是LTB4-S（3.125µg/mL）的4倍，说明EIB202是对卡那霉素具有抗性的野生耐药菌株。
以下体外试验均采用具有耐药性的人工传代耐药菌（LTB4-R）和野生耐药菌（EIB202）进行。
3、试验用细菌的培养和样品的制备：分别挑取迟缓爱德华菌LTB4-R 和EIB202平板单克隆于100mL LB液体培养基中，30℃、200rpm培养至饱和；收取适量的饱和菌体，8000rpm离心2min。然后用无菌生理盐水洗涤菌体3次；将洗涤后的菌体用1×M9培养基调到OD值为0.2，然后分装5mL菌液于试管中备用。
实施例2丙氨酸可提高迟缓爱德华耐药菌对卡那霉素的敏感性
1、耐药菌对卡那霉素敏感性随丙氨酸浓度增加而提高：在制备好的5mL菌液中加入终浓度分别为40µg/mL（EIB202）或800µg/mL（LTB4-R）卡那霉素的同时，不加或加入不同浓度的丙氨酸，使丙氨酸的终浓度分别为0、5、10、20、40和80 mM；30℃、200rpm培养6小时，用平板检测其活菌数，计算不同代谢物浓度下的生存率。计算公式为：生存率（%）=（加入丙氨酸后活菌数/不加丙氨酸活菌数）×100%，结果见图1A。由图1A可知，即使加入最低浓度的丙氨酸，与对照只加入抗生素相比，耐药菌存活细菌数明显减少，且随着加入物质浓度提高，其活菌数越少。这些结果说明不同浓度的丙氨酸都可以提高耐药菌对卡那霉素敏感性。在40mM丙氨酸时可提高EIB202对卡那霉素敏感性约120倍，提高LTB4-R对卡那霉素敏感性约60倍。
2、耐药菌对卡那霉素的敏感性具有浓度依赖性：将制备好的5mL细菌样品，分成加或不加终浓度为40mM丙氨酸2组。这2组分别加入不同浓度的卡那霉素，其中EIB202加入终浓度分别为0、10、20、30、40和50 µg/mL；LTB4-R加入终浓度分别为0、200、400、600、800和1000µg/mL。然后30℃、200rpm培养6小时，用平板检测其活菌数，然后计算不同抗生素浓度下的生存率。计算公式为：生存率（%）=（加入抗生素后活菌数/不加抗生素活菌数）×100%，结果见图1B。由图1B可知，在不加丙氨酸的情况下，即使使用最高浓度的卡那霉素也只能杀死少量耐药菌。而加入丙氨酸后，最低浓度的卡那霉素即可明显杀死这些耐药菌，且随着加入抗生素量增多，其活菌数越少，即对抗生素敏感性越高。此结果表明丙氨酸可提高耐药菌对卡那霉素的敏感性；而且敏感性与抗生素浓度相关：抗生素浓度越高，耐药菌敏感性越高。对于EIB202，在40µg/mL卡那霉素时可提高约120倍，在50µg/mL卡那霉素时可提高约150倍；对于LTB4-R，在800µg/mL卡那霉素时可提高约60倍，在1000µg/mL卡那霉素时可提高约100倍。
3、丙氨酸提高耐药菌对卡那霉素的敏感性具有作用时间的相关性：在制备好的5mL菌液中加入终浓度为分别为40µg/mL（EIB202）或800µg/mL（LTB4-R）卡那霉素以及40mM丙氨酸。30℃、200rpm培养8h，每隔1小时用平板检测其活菌数，计算不同时间生存率。计算公式为：生存率（%）=（加入丙氨酸后在某个时间点的活菌数/不加丙氨酸在某个时间点的活菌数）×100%，结果见图1C。由图1C可见，与对照只加入抗生素相比，加入丙氨酸1小时后，细菌存活数开始减少，且随着时间延长活菌数越低。这些结果说明，丙氨酸可以提高耐药菌对卡那霉素敏感性，加入物质时间越长效果越明显。
实施例3 丙氨酸提高耐药菌对卡那霉素的敏感性具有普遍性
1、迟缓爱德华菌其他抗生素耐药菌株的筛选和鉴定：用两倍稀释法检测迟缓爱德华氏菌LTB-4起始株(命名为LTB-S)对氨苄青霉素、巴洛沙星和四环素的最小抑菌浓度。将LTB-S以105菌落形成单位/毫升的数量在含1/2最小抑菌浓度氨苄青霉素或巴洛沙星或四环素的培养基中连续培养10代，重新测定其最小抑菌浓度。如果重新测定的最小抑菌浓度/起始最小抑菌浓度>4, 则认为该菌株对该抗生素表现出耐药性。由图2的测定结果可知，筛选得到了氨苄青霉素、巴洛沙星和四环素的耐药菌株。
2、迟缓爱德华氏菌对多种抗生素的耐药性测定：将实验室保存的迟缓爱德华菌6种菌株（LTB4-S，LTB4-R，EIB202，WY37，WY28，ATCC15947）按照实施例1中的第1步方法，分别测定对卡那霉素、氨苄青霉素、四环素、链霉素、红霉素、氯霉素和利福平的最小抑菌浓度，结果见图3。从图3可看出，这些迟缓爱德华菌都是多重耐药菌。
3、丙氨酸提高野生耐药迟缓爱德华菌及其耐药菌对卡那霉素的敏感性：将迟缓爱德华菌其他菌株（LTB4-S，LTB4-R，EIB202，WY37，WY28，ATCC15947，氨苄青霉素、巴洛沙星和四环素的耐药菌株）按照实施例1中的第3步试验过程分别制备试验用样本。然后在加入40µg/mL卡那霉素（除LTB4-R为800µg/mL外）前提下，在每种样品中加入或不加入40mM的丙氨酸。30℃、200rpm培养6小时后，用平板检测其活菌数，计算加入物质后存活率。计算公式为：生存率（%）=（加入代谢物后的活菌数/不加代谢物的活菌数）×100%。结果见图4A. 由图可知，当加入物质后，活菌数都明显减少，对于丙氨酸，活菌数减少了5~123倍。这个结果说明丙氨酸不仅可提高迟缓爱德华多重耐药菌对卡那霉素的敏感性，而且可提高迟缓爱德华菌其他抗生素耐药菌对卡那霉素敏感性，表明丙氨酸提高细菌对卡那霉素敏感性具有普遍性。
4、丙氨酸可提高多种病原菌对庆大霉素的敏感性：将多种其他病原菌（副溶血弧菌、乙型链球菌、金黄色葡萄球菌、MASA和肺炎克雷伯菌）按照实施例1中的第3步试验过程分别制备试验用样本。然后在加入适量庆大霉素（副溶血弧菌25µg/mL、乙型链球菌25µg/mL、金黄色葡萄球菌8µg/mL、MASA 6.4µg/mL和肺炎克雷伯菌1µg/mL）前提下，在每种样品中加入或不加入40mM的丙氨酸。30℃、200rpm培养6小时后，用平板检测其活菌数，计算加入物质后存活率。计算公式为：生存率（%）=（加入丙氨酸后的活菌数/不加丙氨酸的活菌数）×100%。结果见图4B。由图可知，当加入丙氨酸后，不同病原菌活菌数都发生减少现象。对于副溶血弧菌，活菌数减少了近1000倍；对于乙型链球菌，活菌数减少了近30倍；对于金黄色葡萄球菌，活菌数减少了近3倍；对于MASA和肺炎克雷伯菌，活菌数减少了近20%；这个结果说明丙氨酸可提高多种病原菌对庆大霉素的敏感性。
实施例4 丙氨酸可提高迟缓爱德华菌对多种抗生素的敏感性
将制备好的EIB202样本分别用庆大霉素（16µg/mL）、头孢他啶（3.2µg/mL）、巴洛沙星（1.6µg/mL）、氨曲南（32µg/mL）、头孢唑林钠（256µg/mL）、新霉素（6.4µg/mL）和吉他霉素（1.6µg/mL）共7种抗生素处理。每种抗生素处理组分为2组，分别为仅加抗生素的对照组和加抗生素与40mM丙氨酸的试验组。30℃、200rpm培养6小时后，用平板检测其活菌数，计算加入物质后存活率。计算公式为：生存率（%）=（加入物质后的活菌数/不加物质的活菌数）×100%。从图5结果可以看出，加入物质后活菌数比只加抗生素对照组的活菌数都有下降，但不同抗生素作用效果不同。对于庆大霉素，作用非常显著，加丙氨酸后可提高300多倍；新霉素可提高5倍，其余均可提高近1.5倍。
实施例5 丙氨酸通过提高细菌PMF使进入胞内抗生素含量增多而提高细菌对抗生素敏感性
PMF（质子动力势）测定：将制备好的EIB202细菌样本分成2组：加生理盐水组和40mM丙氨酸组。30℃、200rpm培养6小时后，采用 BacLight bacterial membranepotential kit（Invitrogen）试剂盒测定PMF。过程简述如下：分别取上述每种处理菌液106CFU，加入 10 μL 3 mM DiOC2(3,3’-diethyloxa-carbocyanine iodide)，室温孵育 30分钟，用流式细胞仪 FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA,USA) 在 488 纳米测定红光和绿光的荧光强度，红光强度与绿光强度的比值表示膜电位的强度。PMF 值计算公式为 Log（10 3/2×红光荧光强度/绿光荧光强度）。PMF测定结果见图6A。从此结果可知，加入物质后，PMF提高约10倍。
卡那霉素含量测定：将制备的EIB202细菌样本分成3组：加生理盐水组、40 µg/mL卡那霉素组和40 µg/mL卡那霉素加40mM丙氨酸组。30℃、200rpm培养6小时后，采用ELISA快速检测试剂盒（北京中检维康科技有限公司）检测细菌内卡那霉素含量。
1）测定卡那霉素标准品的标准曲线：将卡那霉素标准品稀释成不同浓度梯度，分别加入酶标板的不同孔中；在每一孔中分别加入 50μL 酶标抗原和50μL抗体，加盖、37℃孵育 30 分钟；倒出孔中的液体，加洗涤液洗涤4次；每孔加入150μL显色底物，37℃避光孵育10分钟；每孔加入50μL反应终止液，混匀后用酶标仪测定450纳米处的OD值，绘出卡那霉素浓度与吸光度的标准曲线。
2）样品测定：分别离心收集各种处理组细菌，用生理盐水洗3遍后重悬于生理盐水中，调 OD600 至 1.0，取1毫升菌体超声破碎3分钟，离心后取50μL上清，按照上述同样方法测定450纳米处的OD值。再根据标准曲线计算每个样品的卡那霉素含量，结果见图6B。从此结果可以看出，在仅加入卡那霉素时，进入细菌内抗生素仅40纳克/毫升，而当加入丙氨酸后，进入细菌内的抗生素含量显著提高4倍。
实施例6 丙氨酸和葡萄糖协同作用可显著提高耐药菌对卡那霉素的敏感性
1、葡萄糖可提高耐药菌对卡那霉素的敏感性：在制备好的细菌样品（5mL菌液）中，加入终浓度分别为40µg/mL（EIB202）或800µg/mL（LTB4-R）卡那霉素同时，不加或加入不同浓度的葡萄糖，使其终浓度分别为0、1.25、2.5、5、10和20mM。然后30℃、200rpm培养6小时，用平板检测其活菌数，计算不同葡萄糖浓度下的生存率。计算公式为：生存率（%）=（加入葡萄糖后活菌数/不加葡萄糖活菌数）×100%，结果见图7A。由图7A可见，与只加入抗生素的对照相比，即使加入最低浓度的葡萄糖，耐药菌存活细菌数明显减少，且随着加入物质浓度提高而杀菌能力增加。这些结果表明，葡萄糖可提高耐药菌对卡那霉素的敏感性；而且敏感性与葡萄糖浓度相关：葡萄糖浓度越高，耐药菌敏感性越高。在10mM葡萄糖时可分别提高EIB202和LTB4-R对卡那霉素敏感性近400和300倍。
2、丙氨酸和葡萄糖的协同可显著提高耐药菌对抗生素的敏感性：将制备好的细菌样品分成两组：一组在5mL菌液中加入终浓度为40µg/mL卡那霉素（EIB202）或800µg/mL卡那霉素（LTB4-R）和10mM葡萄糖前提下，分别加入丙氨酸，使其终浓度分别为0、10、20、40和80mM；一组在5mL菌液中加入终浓度为40µg/mL卡那霉素（EIB202）或800µg/mL卡那霉素（LTB4-R）和40mM丙氨酸前提下，分别加入葡萄糖，使其终浓度分别为0、2.5、5、10和20mM。然后30℃、200rpm培养6小时后，用平板检测其活菌数，计算加入物质后存活率。计算公式为：生存率（%）=（加入代谢物后的活菌数/不加代谢物的活菌数）×100%。丙氨酸协同作用结果见图7B，葡萄糖协同作用结果见图7C。由图7B可知，加入丙氨酸后，与对照只加入葡萄糖相比，耐药菌存活细菌数明显减少，10mM丙氨酸协同葡萄糖作用效果提高近10倍；随着加入丙氨酸浓度增加，其活菌数越来越少。当丙氨酸为40mM时作用效果提高150倍。由图7C可知，加入葡萄糖后，与对照组只加入丙氨酸相比，耐药菌存活细菌数也明显减少，2.5mM丙氨酸协同葡萄糖作用效果提高50倍；随着加入物质浓度增加，其活菌数也越来越少。当葡萄糖为10mM时作用效果提高500倍。这两个结果充分说明，对提高耐药菌的卡那霉素敏感性来说，丙氨酸和葡萄糖联合使用明显优于单独使用任一物质。
实施例7 丙氨酸可提高小鼠对迟缓爱德华菌的清除
分别挑取EIB202和ATCC15947单克隆置于LB培养基中培养24h，然后按1：100转接至2mL新鲜LB培养基中，并加入经过紫外灭菌3小时的6mm PE-50生物导管，将它们分别置于30℃和37℃培养箱中培养72小时，期间每天更换一半新鲜培养基。将制备的细菌生物膜导管置于 1.5 mLEP管中，用生理盐水洗涤5遍后，植入雌性 BALB / c 小鼠（6 周，体重约 18~20 g）的尿道中。48小时后，将小鼠随机分为2大组（分别16只），即无卡那霉素和有卡那霉素组。每个大组又分生理盐水、丙氨酸、葡萄糖、丙氨酸+葡萄糖4个组。每组8只小鼠。每日两次进行腹腔注射。剂量分别为 3g kg-1丙氨酸和 1.5g kg-1葡萄糖，抗生素的剂量3 mg kg-1。连续治疗3天。最后一次治疗24小时后，取导管管材于生理盐水中超声悬浮生物膜细菌，梯度稀释并平板计数，计算导管生物膜上的细菌存活率。计算公式为注射物质组活菌数/对照组活菌数×100%。通过结果分析，发现EIB202菌加入卡那霉素后的生存率为75.82%，只加丙氨酸时为91.05%，同时加卡那霉素降低为3.79%；只加葡萄糖时为80.19%，同时加卡那霉素降低为5.43%；只加丙氨酸和葡萄糖时为78.06%，同时加卡那霉素降低为2.99%；结果见图8A。ATCC15947菌加入卡那霉素后的生存率为89.04%，只加丙氨酸时为87.38%，同时加卡那霉素降低为6.09%；只加葡萄糖时为91.87%，同时加卡那霉素降低为12.65%；只加丙氨酸和葡萄糖时为81.79%，同时加卡那霉素降低为4.11%；结果见图8A。从这些结果可以看出，1）添加抗生素同时添加丙氨酸的试验组其生物膜上的细菌明显减少，对于EIB202，与只添加丙氨酸和抗生素相比，分别减少了24和20倍；对于ATCC15947，与只添加丙氨酸和抗生素相比，均减少了14倍；2）在添加抗生素时，添加葡萄糖也可明显提高清除耐药菌的能力，对于EIB202，与只添加葡萄糖相比，减少了14倍；对于ATCC15947，与只添加葡萄糖相比，减少了7倍；3）当丙氨酸和葡萄糖联合使用时，其清除耐药菌效果明显优于只使用一种物质，其效率又可提高分别26倍和19倍。
同时，取每只小鼠的肾脏加入适量生理盐水充分研磨匀浆，平板计数检测肾脏组织中的细菌含量（活菌数/克）。统计结果见图8B。分析比较后发现，1）添加抗生素同时添加丙氨酸的试验组肾脏的活菌数明显减少，与只添加丙氨酸和抗生素的对照组相比，活菌数分别减少了2倍。2）在添加抗生素时，添加葡萄糖也可明显清除耐药菌，其效率提高2倍；3）当丙氨酸和葡萄糖联合使用时，其清除耐药菌效果明显优于只使用一种物质，其效率提高5倍。
综合以上动物试验结果说明，丙氨酸可提高机体内卡那霉素耐药菌对卡那霉素的敏感性。而且丙氨酸和葡萄糖这两种物质的作用具有协同性，当联合使用时效果更佳。
Claims (4)
1.丙氨酸和抗生素在制备提高细菌对抗生素敏感性药物中的应用，所述抗生素为卡那霉素、庆大霉素，所述的细菌为迟缓爱德华菌、副溶血弧菌、乙型链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌；所述的丙氨酸与抗生素的剂量比例按重量计为1:0.0015～300。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的细菌为敏感菌、耐药菌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的丙氨酸的使用量为3mg～30g/次给药。
4.丙氨酸和葡萄糖在制备提高细菌对抗生素敏感性药物中的应用，所述抗生素为卡那霉素、庆大霉素，所述的细菌为迟缓爱德华菌、副溶血弧菌、乙型链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌；所述的丙氨酸和葡萄糖的重量比为1：0.0001～10000。
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