CN104611403B - 食品和餐饮具中大肠菌群快速检测纸片的制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种对大肠菌群的快速检测冷水凝胶纸片，该检测纸片是一种专门用于食品、餐饮具中快速检测大肠菌群数量的卫生检验产品。通过对培养基成分与冷水凝胶成分的合理配比、科学的工艺生产和适宜的包装，使产品成本低廉，操作方法简便易行，检测步骤简捷快速，使繁琐的试管法发酵培养和理化试验简化到一步法即可完成，而且灵敏度好、特异性强、结果准确，与国标方法符合率高；同时在培养基中加入抑菌物质，可减少其他微生物生物的干扰。使用该检测纸片可使大肠菌群的检测达到快速准确、定性、定量的分析，适用于食品和餐饮具中大肠菌群的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种食品和餐饮具中大肠菌群快速检测纸片，是一种专门用于食品和餐饮具中快速检测大肠菌群的定性和定量检测试纸。
背景技术
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方。人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。大肠菌群是人畜粪便中的主要细菌，因而被用来作为反映食品中是否被粪便污染或污染程度的指示菌。大肠菌群数的高低，表明了食品被粪便污染的程度，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。大肠菌群作为评价食品卫生质量的主要指标之一，我国已将其纳入“国家标准”。检测大肠菌群传统的方法是试管发酵法，需要配制新鲜培养基，操作方法繁琐，成本较高，检测时间长，达不到快速一步法，大肠菌群的检测结果无法定量分析。因此，业内一直希望能有一种经济、简便、易行、快速、准确的方法和产品。
纸片法是上世纪80年代发展起来的一种快速检测食品及食品接触的物体表面、餐具、茶具中大肠菌群污染情况的方法。目前，国内外对大肠菌群快速检测纸片法研究较多，如中国发明专利食品中大肠菌群快速检测纸片(200710013010.9)、湿式大肠菌群快检纸片(200420059068.9)、液体食品中大肠菌群快检纸片(200610069663.4)，上述专利可以用于大肠菌群的检测，但这些专利检测纸片没有冷水凝胶成分，因此菌落形成不清晰，菌落计数较难。中国发明专利一种快速检测微生物的测试片及其制备方法和应用(200910007917.3)，该专利中添加了冷水凝胶成分，但该专利只能用于食品中大肠菌群的检测，不能用于餐饮具大肠菌群的检测。本专利弥补了上述发明专利的不足，是一种能克服已有方法和产品不足，提供一种专用于食品和餐饮具快速检测大肠菌群并可定性、定量分析的冷水凝胶试纸片。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能克服已有方法和产品不足，提供一种专用于食品和餐饮具快速检测大肠菌群并可定性、定量分析的冷水凝胶试纸片。该纸片不仅适合于多种食品中大肠菌群的检测，也可用于餐饮具中大肠菌群的快速检测。纸片操作简便易行、快速准确(一步法)，特异性强，敏感性高，成本低廉，便于基层单位特别是边沿地区及条件差的基层试验室使用。
为实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：
一种大肠菌群快速检测冷水凝胶纸片，该纸片中含有混合培养基，其特征在于：混合培养基由基础培养基和冷水凝胶混合配置。
如上所述的一种大肠菌群快速检测冷水凝胶纸片，其特征在于：基础培养基中的抑菌剂为脱氧胆酸钠，指示剂为溴甲酚紫、红四氮唑；基础培养基由乳糖胰蛋白胨、牛肉膏、氯化纳、磷酸氢二钾、乳糖配置；冷水凝胶由聚丙烯酸钠、黄原胶、卡拉胶和魔芋胶配置。
如上所述的一种大肠菌群快速检测冷水凝胶纸片，其特征在于：该纸片的制备具有如下步骤：
(1)载体纸片制备：将层析滤纸剪切成5cm×5cm规格，经辐照或高压灭菌，高压灭菌后于50℃恒温真空干燥后备用；
(2)内包装袋：将耐高温的聚丙烯塑料薄膜袋，按试验要求压合成5.2cm×5.2cm规格的联袋；
(3)基础培养基配置：每升培养基中含有胰蛋白胨10.0-15.0g、牛肉膏3.0-5.0g、氯化纳5.0-6.0g、磷酸氢二钾4.0-5.0g、乳糖15.0-20.0g；溴甲酚紫含量为60.0-70.0mg；脱氧胆酸的含量为1.0-1.5g；20.0g/L红四氮唑(TTC)溶液5-7mL，培养基的pH 6.3-6.5；
(4)冷水凝胶配置：0.2-0.4％聚丙烯酸钠、0.1-0.3％黄原胶、0.1-0.2％卡拉胶和0.1-0.2％魔芋胶；
(5)混合培养基配置：将基础培养基和冷水凝胶混合均匀，加去离子水定容至1000mL，于115℃高压灭菌15min，调节pH至6.3-6.5；
(6)试纸片制作：将灭菌载体纸片依次放入灭菌的烧杯中，加入50℃-55℃的混合培养基使之淹没纸片，浸泡5-10min，使培养基充分吸附于纸片，摆放于无菌不锈钢丝网上，50℃恒温真空干燥；
(7)试纸片包装：将浸渍烘干的纸片，无菌操作装入无菌的塑膜袋内，其中5cm×5cm的纸片，每袋1张，再装入铝铀袋，封口后室温以下保存备用。
如上所述的一种大肠菌群快速检测冷水凝胶纸片，其特征在于：该纸片可同时适用于食品和餐饮具中大肠菌群的定量、定性检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明适用于食品和餐饮具中大肠菌群定量和定性检测分析，本发明利用冷水凝胶以层析滤纸为载体，将培养基成分和冷水凝胶混合，均匀的负载到层析滤纸上，样品可均匀分布于冷水凝胶，在其表面形成鲜明的菌落特征，使大肠菌群的检测达到快速准确定量。可以用于大肠菌群菌落的计数，用于定量分析。
2、本发明适用于食品和餐饮具中大肠菌群快速检测，目前现有技术只有适用于食品或餐饮具的大肠菌群快速检测试纸，没有同时适合食品和餐饮具的大肠菌群快速检测试纸。
3、大肠菌群快检纸片含有抑菌剂，在检测中可减少微生物因素的干扰影响，产品的敏感性高、特异性强、结果准确。
4、本发明成本低廉，操作方法简便，检测时间只需16-24h，比常规发酵法缩短了4天，使繁琐的发酵培养和证实试验技术简化到一步法即可完成，一般人员都能掌握操作。
附图说明
附图1为冷水凝胶纸片的成品。
附图2为冷水凝胶纸片检测呈阴性时的效果图。
附图3为冷水凝胶纸片检测呈阳性时的效果图。
附图4为本发明冷水凝胶纸片检测大肠菌群的效果图。
附图5为其他厂家试纸片检测大肠菌群的效果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围，如未特别说明，本发明所用方法为常规技术，所用试剂均购自生化商店。
实施例1：快速检测试纸片的制备方法
(1)载体纸片制备：将层析滤纸切成5cm×5cm规格，经辐照或高压灭菌(高压后于50℃恒温真空干燥)后备用。
(2)内包装袋制备：将耐高温的聚丙烯塑料薄膜袋，按试验要求压合成5.1cm×5.1cm规格的联袋。
(3)基础培养基配置(1L)：胰蛋白胨10.0-15.0g；牛肉膏3.0-5.0g；氯化纳5.0-6.0g磷酸氢二钾(K2HPO4·2H2O)4.0-5.0g；乳糖15.0-20.0g；溴甲酚紫含量为60.0-70.0mg；脱氧胆酸的含量为1.0-1.5g；20.0g/L红四氮唑(TTC)溶液5-7mL。
(4)冷水凝胶配置(质量百分比)：0.2-0.4％聚丙烯酸钠、0.1-0.3％黄原胶、0.1-0.2％卡拉胶和0.1-0.2％魔芋胶。
(5)混合培养基配置：将基础培养基和冷水凝胶混合均匀，加去离子水定容至1000ml，于115℃高压(1×105Pa)灭菌15min，调节pH至6.3-6.5。
(6)试纸片制作：将灭菌载体纸片依次放入灭菌的烧杯中，加入50-55℃的混合培养基使之淹没纸片，浸泡5-10min，使培养基充分吸附于纸片，摆放于无菌不锈钢丝网上，50℃恒温真空干燥。
(7)试纸片包装：将浸渍烘干的纸片，无菌操作装入无菌的塑膜袋内，其中5cm×5cm的纸片，每袋1张，再装入铝铀袋，封口后室温以下保存备用，如图1。
实施例2：快速检测试纸片的特异性试验
将枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌摇瓶过夜培养，将1mL菌悬液8000r/min离心5min，将菌体重悬于1mL无菌水中，按照十倍稀释，稀释到一定倍数(103-104)后，将1mL菌悬液滴加至检测纸片上，36℃±1℃培养16-24h，观察纸片上菌落的生长情况，研究试纸片的特异性。设置5个平行组，试验重复3次。
试验结果表明，只有当大肠杆菌存在时，试纸片才会变黄并在黄色背景上呈现红色斑点菌落或片状红晕；而枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌存在时，试纸片保持紫蓝色不变，或有红色斑点但斑点周围无黄晕。
实施例3：快速检测试纸片的干扰性试验
同时将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌摇瓶过夜培养，将0.5mL菌悬液8000r/min离心5min，按照十倍稀释，稀释到一定倍数(103-104)后，依次将0.5ml枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌菌悬液与0.5mL大肠杆菌菌悬液混合，重悬于1mL无菌水中，将1mL菌悬液滴加至检测纸片上，36℃±1℃培养16-24h，观察纸片上菌落的生长情况，研究其他菌对大肠杆菌的生长是否有干扰。设置5个平行组，试验重复3次。
试验结果表明，只要混合菌液中有大肠杆菌存在时，试纸片才会变黄并在黄色背景上呈现红色斑点菌落或片状红晕。
实施例4：快速检测试纸片稳定性试验
加速保存试验：红四氮唑(TTC)是脂溶性光敏感复合物，存放时避免高温且避光，所以加速保存试验在37℃的烘箱中进行，每隔7天取出检测试纸片，分别滴加大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌菌数为10-200cfu/mL的菌悬液，36℃±1℃培养16-18h，观察纸片上菌落的生长情况，确定其稳定性。试验结果表明，在6个月内检测试纸片稳定性好。
常温保存试验：将检测试纸片在常温中避光保存，每月取出检测纸片，检测大肠菌群。分别滴加大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌菌数为10-200cfu/mL的菌悬液，36℃±1℃培养16-24h，观察纸片上菌落的生长情况，确定其稳定性。试验结果表明，在12个月内检测试纸片稳定性好。
批内重复试验：随机抽取30张检测试纸，分别滴加大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌菌数为10-200cfu/mL的菌悬液，36℃±1℃培养16-24h，观察纸片上菌落的生长情况，确定其批内重复性。试验结果表明，检测试纸片批内重复性好。
批间重复试验：随机抽取3个不同批次的自制纸片各30张，分别滴加大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌菌数为10-200cfu/mL的菌悬液，36℃±1℃培养16-24h，观察纸片上菌落的生长情况，确定产品批间重复性。试验结果表明，检测试纸片批间重复性好。
实施例5：快速检测试纸片在餐饮具检测中的应用
(1)采样：随机抽取消毒后准备使用的各类食具(碗、盘、杯等)，取样量可根据大、中、小不同饮食行业每次采样6件-10件，每件贴纸片两张，每张纸片面积25cm2(5cm×5cm)。用无菌生理盐水湿润大肠菌群检测用纸片后，立即贴于食具内侧表面，30s后取下，置于无菌塑料袋内。筷子以5只为一件样品，用灭菌1mL吸管吸取无菌生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端(约5cm)抹试纸片，每件样品抹拭两张，放入无菌塑料袋内。
(2)培养：将已采样的纸片置于36℃±1℃恒温培养箱中培养16h-24h，取出观察结果。
(3)结果判断：若纸片保持紫蓝色不变，或有红色斑点但斑点周围无黄晕者为大肠菌群阴性，如图2；在红色斑点周围有黄晕，或纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性，如图3。
实施例6：快速检测试纸片在食品检测中的应用
固体和半固体样品前处理：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min-10000r/min均质1min-2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，制成1:10的样品匀液。
液体样品前处理：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。样品匀液的pH值应在6.5-7.5之间，必要时用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节。(1)样品稀释：用1mL灭菌吸管吸取1:10样品匀液，注入含有9mL稀释液的试管内，振摇试管制成1:100的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，一次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换一支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。(2)接种：选取两个稀释度进行接种，普通食品一般采用1:10和1:100这两个稀释度，饮料采用原液和1:10两个稀释度。(3)用灭菌吸管吸取1mL 1:10样品匀液加到检测纸片上(相当于接样品1g)，吸透后平放，做3个重复。再用1mL灭菌吸管吸取1mL 1:100样品匀液加到检测纸片上(相当于接样品0.1g)，做3个重复。再另取一支1mL灭菌吸管吸取1mL1:100样品匀液加到含有小纸片的塑料袋中(相当于接样品0.01g)，做3个重复。(4)培养：将接种好的纸片(可叠放)放入36℃±1℃培养箱中培养16-24h。(5)大肠菌群检测结果：若纸片变黄或在黄色背景上呈现红色斑点为大肠菌群阳性纸片，纸片保持紫蓝色不变或在紫蓝色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄色均为大肠菌群阴性纸片。记录每个稀释度大肠菌群菌落数。
实施例7：与其它大肠菌群试纸片定量检测比较
将大肠杆菌摇瓶过夜培养，将1mL菌悬液8000r/min离心5min，将菌体重悬于1mL无菌水中，按照十倍稀释，稀释到一定倍数(103cfu/mL)后，将1mL菌悬液滴加至检测纸片上，36℃±1℃培养16-24h，观察纸片上菌落的生长情况。其他大肠菌群试纸片按照说明说要求操作，36℃±1℃培养16-24h，观察纸片上菌落的生长情况。设置6个平行组，试验重复3次。从图4可知，本专利产品菌落清晰可见，菌落在试纸片上均匀分布；从图5可知，其它试纸片菌落特征不明显，在测试片小部分区域有菌落分布，其他区域无菌落分布。
Claims (2)
1.一种大肠菌群快速检测冷水凝胶纸片，该纸片中含有混合培养基，混合培养基由基础培养基和冷水凝胶混合配置,其特征在于：冷水凝胶配置为0.2-0.4％聚丙烯酸钠、0.1-0.3％黄原胶、0.1-0.2％卡拉胶和0.1-0.2％魔芋胶。
2.根据权利要求1所述的一种大肠菌群快速检测冷水凝胶纸片，其特征在于：该纸片的制备具有如下步骤：
(1)载体纸片制备：将层析滤纸剪切成5cm×5cm规格，经辐照或高压灭菌，高压灭菌后于50℃恒温真空干燥后备用；
(2)内包装袋：将耐高温的聚丙烯塑料薄膜袋，按试验要求压合成5.2cm×5.2cm规格的联袋；
(3)基础培养基配置：每升培养基中含有胰蛋白胨10.0-15.0g、牛肉膏3.0-5.0g、氯化纳5.0-6.0g、磷酸氢二钾4.0-5.0g、乳糖15.0-20.0g；溴甲酚紫含量为60.0-70.0mg；脱氧胆酸的含量为1.0-1.5g；20.0g/L红四氮唑(TTC)溶液5-7mL，培养基的pH6.3-6.5；
(4)冷水凝胶配置：0.2-0.4％聚丙烯酸钠、0.1-0.3％黄原胶、0.1-0.2％卡拉胶和0.1-0.2％魔芋胶；
(5)混合培养基配置：将基础培养基和冷水凝胶混合均匀，加去离子水定容至1000mL，于115℃高压灭菌15min，调节pH至6.3-6.5；
(6)试纸片制作：将灭菌载体纸片依次放入灭菌的烧杯中，加入50℃-55℃的混合培养基使之淹没纸片，浸泡5-10min，使培养基充分吸附于纸片，摆放于无菌不锈钢丝网上，50℃恒温真空干燥；
(7)试纸片包装：将浸渍烘干的纸片，无菌操作装入无菌的塑膜袋内，其中5cm×5cm的纸片，每袋1张，再装入铝铀袋，封口后室温以下保存备用。
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