CN106811404A - 一种快速检测大肠菌群的测试片及其制备方法、检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种快速检测大肠菌群的测试片，包括下层底板，珍珠纸，上层薄膜组件和大肠菌群特征显色液体培养基，所述珍珠纸中间具有圆形凹槽，所述圆形凹槽内均匀分布有大肠菌群特征显色液体培养基。本发明快速检测大肠菌群的测试片具有目标菌落易于分辨，显色清晰，结果判定简单、检测结果可靠、检测时间短、操作简便、成本低廉等优势，可在微生物检测中发挥重要作用。

Description

一种快速检测大肠菌群的测试片及其制备方法、检测方法
技术领域
本发明属于快速检测领域，涉及微生物检测技术，具体涉及一种快速检测大肠菌群的测试片，以及该测试片制备方法、检测方法。
背景技术
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。
目前国内进出口食品中大肠菌群检测方法主要采用国家标准和原国家商检局制订的行业标准。国标和行标两个方法在检测程序上略有不同，国标法具体操作参见GB4789.3-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》，行业标准法具体操作参见SN0169-92《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》，这两种检测方法具有检测结果准确、可靠的特点，是经典的微生物检测和鉴定方法，但是这两种方法耗时长、培养基需要现配置，操作步骤繁琐，难以满足快速检测的实际需求。
纸片法的出现，弥补了国标方法检测的缺点，逐步成为微生物检测和鉴定的主要方法和标准，2007年，PetrifilmTM测试片被正式列为中国出入境检验检疫行业标准，该方法正逐渐被越来越多的食品生产加工企业及各类检测机构所认可。目前，国内长沙市宇驰检测技术有限公司2014年09月17日公开了一项授权公开号为CN203833945U，名称为大肠菌群和/或大肠菌群测试片的实用新型专利，该专利采用位于底片上的印有方格的无纺布层，位于无纺布层上的培养基和含有葡萄糖苷酶指示剂的盖膜，该实用新型专利技术存在目标菌落在无纺布上扩散生长菌落边缘模糊，影响检测结果判读的缺点。
发明内容
为了解决现有技术存在的大肠菌群测试片存在的目标菌落在无纺布上扩散生长，菌落边缘模糊，结果判读不准的问题，本发明提供了一种快速检测大肠菌群的测试片及其制备方法、检测方法。
技术方案：
一种快速检测大肠菌群的测试片，包括下层底板4，珍珠纸2，上层薄膜组件1和大肠菌群特征显色液体培养基，所述珍珠纸2中间具有圆形凹槽3，所述下层底板4、珍珠纸2、上层薄膜组件1通过不干胶粘贴，所述圆形凹槽3内均匀分布有大肠菌群特征显色液体培养基。
所述大肠菌群特征显色液体培养基每100mL含有胰蛋白胨1.0～3.0g、氯化钠0.1～1.0g、乳糖1.5～3.5g、胆盐0.1～0.4g、酵母膏粉0.2～1.0g、磷酸氢二钾0.15～0.5g、磷酸二氢钾0.15～0.5g、冷水可溶性凝胶0.5～2g，抑菌剂混合物150～500IU/mL、显色酶解底物混合剂0.02～0.05g。
所述显色酶解底物混合剂由5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷、2,3,5-三苯基氯化四氮唑、3-吲哚基-beta-D-吡喃半乳糖苷按重量比2:1:1混合组成。
所述抑菌剂混合物为胆盐与结晶紫的混合物，胆盐：结晶紫重量比为80:1。
所述的测试片上层薄膜组件1上方粘贴有测试片标签5。
本发明的另一个目的还提供了一种快速检测大肠菌群的测试片的制备方法，包括如下步骤：
a.配制大肠菌群特征显色液体培养基：每100mL按照以下方式配制，称量胰蛋白胨1.0～3.0g、氯化钠0.1～1.0g、乳糖1.5～3.5g、胆盐0.1～0.4g、酵母膏粉0.2～1.0g、磷酸氢二钾0.15～0.5g、磷酸二氢钾0.15～0.5g、冷水可溶性凝胶0.5～2g，于锥形瓶中加蒸馏水100mL搅拌溶解，在121℃高压灭菌锅条件下灭菌15min，冷却至室温后，依次加入经过滤灭菌的抑菌剂混合物15000～50000IU及显色酶解底物混合剂0.02～0.05g，得到大肠菌群特征显色液体培养基，在0～4℃下冷藏备用；
b.各组件的前处理
上层薄膜组件1处理：辐照，剂量8KGy，使用前紫外灭菌30min；
下层底板4和珍珠纸2：下层底板4与珍珠纸2粘贴贴合在一起后，辐照，剂量8KGy，使用前用紫外灭菌30min；
c.大肠菌群特征显色液体培养基添加：将步骤b中经紫外灭菌后的下层底板4和珍珠纸2结合部件水平放置在水平台面上，珍珠纸2中间圆形凹槽3开口向上，吸取1～3mL大肠菌群特征显色液体培养基添加于圆形凹槽3内，使培养基均匀分布，无菌条件下烘干后，置于0～4℃的无菌冷藏箱内，备用；
d.组装测试片：将经上述步骤b、c后得到的测试片组件上贴上经步骤a处理后的上层薄膜组件1，即得到快速检测大肠菌群的测试片。
本发明还提供了一种用快速检测大肠菌群的测试片检测样品中大肠菌群的方法，包括以下步骤：
a.样品前处理；
b.用上述快速检测大肠菌群的测试片进行接菌培养；
c.分析检测结果。
有益效果：
1.本发明快速检测大肠菌群的测试片，与现有大肠菌群测试片相比，菌落易于分辨，分布均匀，显色清楚，避免了因扩散严重而导致计数结果不准确，避免了人为操作不当引起的误差。
2.通过培养基优化，获得了颜色均一，杂质少，培养效果好的培养基；通过将待测样品直接接种于测试片上，实现对待测样品中大肠菌群的快速培养和检测。
3.本发明快速检测大肠菌群测试片具有制备方法简单，成本低廉，能够自动化生产。使用方便，可以长期存放，大大节省培养基配置、培养皿灭菌、清洗等处理的时间，降低了劳动强度，缩短了检测时间。
附图说明
图1为本发明测试片示意图；
1-上层薄膜组件；2-珍珠纸；3-圆形凹槽；4-下层底板；5-测试片标签。
图2为本发明测试片检测阳性大肠菌群样品的圆形凹槽内的显色图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明试剂如无特别说明，均为常规试剂。
实施例1快速检测大肠菌群的测试片的组成
如图1所示，一种快速检测大肠菌群的测试片，包括下层底板4，珍珠纸2，上层薄膜组件1，测试片标签5及大肠菌群特征显色液体培养基。下层底板4，珍珠纸2及上层薄膜组件1为长方形，珍珠纸2中间有圆形凹槽3，圆形凹槽3内均匀分布有大肠菌群特征显色液体培养基。每100mL大肠菌群特征显色液体培养基中含有胰蛋白胨1.0～3.0g、氯化钠0.1～1.0g、乳糖1.5～3.5g、胆盐0.1～0.4g、酵母膏粉0.2～1.0g、磷酸氢二钾0.15～0.5g、磷酸二氢钾0.15～0.5g、冷水可溶性凝胶0.5～2g，抑菌剂混合物150～500IU/mL、显色酶解底物混合剂0.02～0.05g。抑菌剂混合物为胆盐和结晶紫，重量比为80:1。显色酶解底物混合剂为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷、2,3,5-三苯基氯化四氮唑、3-吲哚基-beta-D-吡喃半乳糖苷的混合物，重量比为2:1:1。
冷水可溶性凝胶为重量比1:1的黄原胶和卡拉胶的混合物。
大肠菌群特征显色液体培养基的成分，100mL，见表1
表1大肠菌群特征显色液体培养基成分，100mL
上述试剂药品均购置于青岛海博生物技术有限公司和广东环凯微生物科技有限公司。
珍珠纸2，中间具有圆形凹槽3，长×宽×厚为90×70×1.5mm，圆形凹槽的R＝58mm。
上层薄膜组件1为透明bopp薄膜，长×宽×厚为95×70×0.1mm。
测试片标签5为不干胶贴纸，长×宽为70×10mm。
下层底板4为PVC底板，长×宽×厚为90×70×0.7mm。
最下面为下层底板4，珍珠纸2紧贴下层底板4，中间具有圆形凹槽3，上层薄膜组件1贴在珍珠纸2上，测试片标签5贴在上层薄膜组件1上，相互之间用不干胶粘合。
实施例2快速检测大肠菌群的测试片的制备
2.1大肠菌群特征显色液体培养基的制备：其中100mL大肠菌群特征显色液体培养基配制的方法：称量胰蛋白胨2.5g、氯化钠0.35g、乳糖2.5g、胆盐0.2g、酵母膏粉0.6g、磷酸氢二钾0.35g、磷酸二氢钾0.35g、冷水可溶性凝胶0.9g，于锥形瓶中加蒸馏水100mL搅拌溶解，在121℃高压灭菌锅条件下灭菌15min，冷却至室温后，依次加入经过滤灭菌的抑菌剂混合物35000IU及显色酶解底物混合剂0.03g，得到大肠菌群特征显色液体培养基，在0～4℃下冷藏备用。
2.2测试片各组件前处理：
2.2.1上层薄膜组件前处理，在有胶的一面均匀敷上冷水可溶性胶，并贴上产品标签，辐照，剂量8KGy，使用前紫外灭菌30min。
2.2.2下层底板和珍珠纸如图1所示用不干胶进行粘贴贴合处理后，辐照，剂量8KGy，使用前紫外灭菌30min。
2.2.3大肠菌群特征显色液体培养基添加：将2.2.2辐照处理后的材料平铺于水平台面，吸取1～3mL大肠菌群特征显色液体培养基添加于珍珠纸上的圆形凹槽内，使培养基均匀分布，无菌条件下烘干后，置于0～4℃的无菌冷藏箱内，备用。
2.3组装测试片：将步骤2.2.3中制备的测试片贴上上层薄膜组件，分装于自封袋，置于铝箔袋中，抽真空包装，即得到快速检测大肠菌群的测试片，制备好的快速检测大肠菌群的测试片置于2～8℃环境下，保存期限1年。
实施例3待检样品中大肠菌群的检测
使用本发明快速检测大肠菌群测试片检测样品中大肠菌群时，主要有以下几个步骤：
首先样品处理：取样品25mL(g)放入含有225mL灭菌稀释液(磷酸盐缓冲液或生理盐水)的取样器或均质杯内，制成1:10的样品匀液，用1mL的灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL灭菌稀释液的试管内，摇匀后得到1:100的样品稀释液，按照上述操作步骤依次往下稀释，制备10倍递增系列的样品稀释匀液。一般样品选2～3个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品(如饮用纯水和矿泉水等)可直接吸取原液进行检测。
其次接菌培养：将测试片置于平坦台面，打开测试片上层薄膜组件，用灭菌枪头或滴管吸取1mL样品匀液加到测试片中间凹槽位置，缓慢盖上上层薄膜组件，避免有气泡产生，使样品匀液浸润整个培养基区域，即可培养。每个稀释度接种两片，同时取1mL无菌生理盐水接种另一测试片作空白对照。将接种好的测试片放置于37±1℃培养箱中培养18～24h。
上述磷酸盐缓冲液的配制：称取34.0g的分析纯磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用175mL的1mol/LNaOH调节pH至6.0，用蒸馏水稀释至1000mL后，取1.25mL,用蒸馏水继续稀释至1000mL，分装于干净的适量容器中，121℃高压灭菌15min。
上述生理盐水的配制：取8.5g分析纯氯化钠溶解到1000mL蒸馏水或纯净水中，充分混匀溶解，分装到适量容器后，121℃高压灭菌15min。
最后分析检测结果：
1.培养后培养基区域上呈现红点蓝圈菌落的计为大肠菌群阳性，呈现红色菌落的计为大肠菌群阴性。
2.计数
上述经培养后的测试片(选取15～150CFU数值之间的测试片进行计数)，大肠菌群在测试片上呈现红点蓝圈菌落，且菌落形态较大。
选取菌落数在15～150CFU的培养皿，根据菌落形态计数大肠菌群数。
1)若两个稀释度的菌落数均在15～150CFU之间，则取其平均菌落数乘以稀释倍数计算。
2)若所有测试片上菌落数均小于15CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
3)若所有测试片上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的测试片进行计数，其他测试片可记录为多不可计，结果按其平均菌落数乘以最高稀释倍数。
4)若所有测试片均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如果为原液，则以小于1计数。单位CFU/mL或CFU/g。
为了更好的体现本发明的有益效果，发明人用本发明测试片法、国家标准检测法对样品中的大肠菌群进行检测，对比结果如下：
将处理好的样品，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液将其稀释至10-1、10-2两个梯度。用灭菌枪头或滴管吸取1mL待测样品稀释液倾注在国标法推荐的平板上和本发明的测试片上，以1mL灭菌生理盐水作为空白对照，在37±1℃条件下，培养24h后，记录观察结果如下表2：
表2样品检测结果比对表1(培养时间24h，培养温度37±1℃)
检测结果本发明与国家标准检测结果有很好的符合度。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。

Claims (7)

1.一种快速检测大肠菌群的测试片，其特征在于包括下层底板(4)，珍珠纸(2)，上层薄膜组件(1)和大肠菌群特征显色液体培养基，所述珍珠纸(2)中间具有圆形凹槽(3)，所述下层底板(4)、珍珠纸(2)、上层薄膜组件(1)通过不干胶粘贴，所述圆形凹槽(3)内均匀分布有大肠菌群特征显色液体培养基。
2.根据权利要求1所述的快速检测大肠菌群的测试片，其特征在于所述大肠菌群特征显色液体培养基每100mL含有胰蛋白胨1.0～3.0g、氯化钠0.1～1.0g、乳糖1.5～3.5g、胆盐0.1～0.4g、酵母膏粉0.2～1.0g、磷酸氢二钾0.15～0.5g、磷酸二氢钾0.15～0.5g、冷水可溶性凝胶0.5～2g，抑菌剂混合物150～500IU/mL、显色酶解底物混合剂0.02～0.05g。
3.根据权利要求2所述的快速检测大肠菌群的测试片，其特征在于所述显色酶解底物混合剂由5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷、2,3,5-三苯基氯化四氮唑、3-吲哚基-beta-D-吡喃半乳糖苷按重量比2:1:1混合组成。
4.根据权利要求2或3所述的快速检测大肠菌群的测试片，其特征在于所述抑菌剂混合物为胆盐与结晶紫的混合物，胆盐：结晶紫重量比为80:1。
5.根据权利要求1所述的快速检测大肠菌群的测试片，其特征在于所述的测试片上层薄膜组件(1)上方粘贴有测试片标签(5)。
6.一种权利要求1～5任一项所述的快速检测大肠菌群的测试片的制备方法，包括如下步骤：
a.配制大肠菌群特征显色液体培养基：每100mL按照以下方式配制，称量胰蛋白胨1.0～3.0g、氯化钠0.1～1.0g、乳糖1.5～3.5g、胆盐0.1～0.4g、酵母膏粉0.2～1.0g、磷酸氢二钾0.15～0.5g、磷酸二氢钾0.15～0.5g、冷水可溶性凝胶0.5～2g，于锥形瓶中加蒸馏水100mL搅拌溶解，在121℃高压灭菌锅条件下灭菌15min，冷却至室温后，依次加入经过滤灭菌的抑菌剂混合物15000～50000IU及显色酶解底物混合剂0.02～0.05g，得到大肠菌群特征显色液体培养基，在0～4℃下冷藏备用；
b.各组件的前处理
上层薄膜组件(1)处理：辐照，剂量8KGy，使用前紫外灭菌30min；
下层底板(4)和珍珠纸(2)：下层底板(4)与珍珠纸(2)粘贴贴合在一起后，辐照，剂量8KGy，使用前用紫外灭菌30min；
c.大肠菌群特征显色液体培养基添加：将步骤b中经紫外灭菌后的下层底板(4)和珍珠纸(2)结合部件水平放置在水平台面上，珍珠纸(2)中间圆形凹槽(3)开口向上，吸取1～3mL大肠菌群特征显色液体培养基添加于圆形凹槽(3)内，使培养基均匀分布，无菌条件下烘干后，置于0～4℃的无菌冷藏箱内，备用；
d.组装测试片：将经上述步骤b、c后得到的测试片组件贴上经步骤a处理后的上层薄膜组件(1)，即得到快速检测大肠菌群的测试片。
7.一种权利要求1～5任一项所述的快速检测大肠菌群的测试片检测样品中大肠菌群的方法，包括以下步骤：
a.样品前处理；
b.用权利要求1～5任一项所述的快速检测大肠菌群的测试片进行接菌培养；
c.分析检测结果。
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