CN104673876A

CN104673876A - 一种用于微生物检测的透明吸水凝胶及检测板

Info

Publication number: CN104673876A
Application number: CN201510069871.3A
Authority: CN
Inventors: 范俊; 卢新; 肖剑; 陈娟丽; 孙霞; 梁智安; 易云婷; 蒋廉华
Original assignee: GUANGZHOU OASIS BIOCHEMISTRY TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: GUANGDONG DAYUAN OASIS FOOD SAFETY TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2015-02-09
Filing date: 2015-02-09
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2035-02-09
Also published as: CN104673876B

Abstract

本发明公开了一种用于微生物检测的透明吸水凝胶及检测板，透明吸水凝胶的固形物由聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠组成。本发明的透明吸水凝胶，具有快速吸水保水的特性，稀释液会被凝胶快速吸收，分布均匀，不易在凝胶表面成股流动；同时，凝胶的凝固性好，透明度高，对微生物生长无明显抑制作用等优点，有利于准确读数，获得更为准确的检测结果。利用本发明的透明吸水凝胶，成功研制单增李斯特菌检测板、金黄色葡萄球菌检测板、沙门氏菌检测板和大肠杆菌O157检测板等一系列产品，能快速检测出食品及环境中的病原微生物。

Description

一种用于微生物检测的透明吸水凝胶及检测板

技术领域

本发明涉及微生物学检验领域。

背景技术

随着社会经济的发展和人们生活水平的不断提升，人们对生活品质的要求越来越高，食品安全问题也越来越受到重视。在食品生产、加工、存储、运输、销售等各个环节都可能被微生物污染。特别是近年来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏,可导致人类感染的致病菌的种类越来越多，病原微生物对人类的威胁越来越大。由微生物污染造成的食品卫生质量问题备受关注，采用适当的微生物检验方法是预防食源性中毒的重要手段。而传统的微生物检测方法涉及的试验较多、操作繁琐、成本较高、需要时间较长、准备和收尾工作繁重，且要大量人员参与。运用现代生化技术成果发展起来的微生物快速测试片发是近年来不断取得进展的一种新型检测方法。

快速测试片法是指以纸片、胶片、纸膜等作为培养基载体的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面生长，而显示出特定的颜色来测定食品中微生物的方法。近年来以滤纸和Petrifilm为载体的测试片已开始被广泛应用。而目前以滤纸为载体的测试片多采用不透明的纸质底板，纸板上为粉末状吸水凝胶层，吸水凝胶层上贴含有微生物显色培养基的滤纸，最上层加透明上盖膜。而由于滤纸、吸水凝胶层和底板都是不透明的，生长在滤纸下侧、吸水凝胶层和底板之间的微生物就难以计数，易引起食品微生物检出率偏低。以Petrifilm载体为代表的测试片，采用了透明的吸水凝胶，而该吸水凝胶剂吸水性能不好，稀释液在凝胶层上扩散不规则，往往成股流动，容易溢出测试片，造成检测结果偏低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于微生物检测的透明吸水凝胶。

本发明的另一目的在于提供一种快速透明微生物检测板。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于微生物检测的透明吸水凝胶，所述透明吸水凝胶的固形物由聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠组成。

进一步的，上述用于微生物检测的透明吸水凝胶中，聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠的质量比为1:(1～2):(4～8)。

进一步的，上述用于微生物检测的透明吸水凝胶中，聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠的质量比为1:1:4、1:1:8、1:2:4或1:2:8。

进一步的，上述用于微生物检测的透明吸水凝胶中，聚丙烯酸树脂的数均分子量为260000～500000。

进一步的，上述用于微生物检测的透明吸水凝胶中，羧甲基纤维素钠的数均分子量为5400～7400。

进一步的，上述用于微生物检测的透明吸水凝胶中，聚丙烯酸钠的数均分子量为100000～2000000。

进一步的，微生物选自单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157。

一种快速透明微生物检测板，其使用的透明吸水凝胶如上所述。

本发明的有益效果是：

本发明的透明吸水凝胶，具有快速吸水保水的特性，稀释液会被凝胶快速吸收，分布均匀，不易在凝胶表面成股流动；同时，凝胶的凝固性好，透明度高，对微生物生长无明显抑制作用等优点，有利于准确读数，获得更为准确的检测结果。

利用本发明的透明吸水凝胶，成功研制单增李斯特菌检测板、金黄色葡萄球菌检测板、沙门氏菌检测板和大肠杆菌(大肠埃希氏菌)检测板等一系列产品，能快速检测出食品及环境中的病原微生物。

附图说明

图1是OXOID李斯特菌显色培养基平板检测图对照；

图2是本发明单增李斯特菌检测板的检测图；

图3是科玛嘉金黄色葡萄球菌显色培养基平板检测图对照；

图4是本发明金黄色葡萄球菌检测板的检测图。

具体实施方式

进一步的，聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠的质量比为1:(1～2):(4～8)。

进一步的，聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠的质量比为1:1:4、1:1:8、1:2:4或1:2:8。

不同分子量的聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠均具有较好的吸水性和凝固性，均可用于制备透明吸水凝胶。均数均分子量为260000～500000的聚丙烯酸树脂，数均分子量为5400～7400的羧甲基纤维素钠和数均分子量为100000～2000000的聚丙烯酸钠更为常见，成本相对低廉一点，因为制备工艺成熟，质量相对更为稳定，优选上述分子量范围内的三种高分子材料为原料。

以下结合具体实验对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

吸水凝胶复合配方各项参数的测定

按照聚丙烯酸树脂:羧甲基纤维素钠:聚丙烯酸钠质量比为1:1:1，1:1:4，1:1:8，1:1:12，1:2:1，1:2:4，1:2:8，1:2:12，1:3:1，1:3:4，1:3:8，1:3:12进行混合，得到混合凝胶粉末。

分别称取各种混合粉末1.0g于洁净烧杯中，加入50mL 0.90％生理盐水，混匀后吸收5min；用80目筛沥水，测沥出水质量(每种样品做三次重复求平均值)，用下面公式计算吸水率：吸水率＝(加入的总液体质量－滤出的液体质量)/固体物质的质量。

分别称取各种混合粉末1.0g，加入50mL去离子水，并同时加入李斯特菌显色培养基沸水浴20min，制成含李斯特菌显色培养基的凝胶溶液，将冷却的凝胶溶液按照5mL/板加入有凹槽的透明吸塑模具中，烘干后观察单增李斯特菌检测板的透明度(+透明，－不透明)和平整度(+平整，－不平整包括褶皱和未完全覆盖检测板凹槽)。

分别取制作好的单增李斯特菌检测板，接种1mL单增生李斯特氏菌ATCC19115菌悬液，静置5min观察检测板的吸水情况(+完全吸水，－未完全吸水)及平整度(+平整，－不平整包括褶皱和未完全覆盖检测板凹槽)，然后倒置于37℃恒温箱培养24～48h，观察检测板的保水性(+完全保水，－未完全保水)及菌株在检测板上的生长情况(“+”表示阳性结果，目标菌长出呈蓝绿色菌落带白色晕环，“－”表示阴性结果，目标菌未长出)。

结果如表1所示：

综合表1结果可以看到吸水凝胶比例聚丙烯酸树脂：羧甲基纤维素钠：聚丙烯酸钠的质量比为1:(1～2):(4～8)时，可以制成透明度和平整度良好，吸水与保水效果理想，且微生物生长状况优良的微生物检测板。接下来以该配方的吸水凝胶为基础，制成其他几种常见的病原微生物检测板，并验证可行性。

快速透明微生物检测板实验

一、单增李斯特菌检测板的研制

1)单增李斯特菌检测板的制作

单增李斯特菌检测板的制作，将聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠按照质量比为1:1:4，用搅拌机混匀，制成混合凝胶粉末。按照1g凝胶粉末添加到50mL去离子水中，同时添加李斯特菌显色培养基沸水浴制成凝胶溶液，冷却后将含李斯特菌显色培养基的凝胶溶液按照5mL/板加入有凹槽的透明吸塑模具中，烘干，制成单增李斯特菌检测板，经过环氧乙烷或者Co₆₀灭菌完毕后，4～8℃冰箱保存备用。

2)单增李斯特菌检测板的特异性试验

将单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19115、单核细胞增生李斯特氏菌CMCC(B)54002、英诺克李斯特菌ATCC33090、金黄色葡萄球菌ATCC6538、大肠埃希氏菌ATCC8099、阪崎肠杆菌ATCC29544、肠炎沙门氏菌CMCC(B)50335、蜡样芽胞杆菌CMCC(B)63303、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104、副溶血性弧菌ATCC17802、粪链球菌ATCC29212、痢疾志贺氏菌CMCC(B)51252、白色假丝酵母ATCC10231。13种标准菌株分别活化后制成适当浓度的标准菌悬液(浓度为10⁰～10²cfu/mL)，分别取1mL菌悬液接种单增李斯特菌检测板，并同时接种1mL菌悬液至NA平板或者PDA平板为对照，37℃培养24±2h。

检测结果见表2，“+”表示阳性结果，有蓝绿色菌点并带白色晕环出现；“－”表示阴性结果，无菌点生长或者无蓝绿色点并带白色晕环出现：

由表2可知，13个标准菌株在检测板和进口的单增李斯特菌显色培养基检测结果完全一致，特异性好，除了2株单增李斯特菌标准菌株为蓝绿色阳性菌点，其他11个标准菌株在检测板上均呈阴性，因此单增李斯特菌检测板可以用于单增李斯特菌的检测和计数。图1为OXOID李斯特菌显色培养基平板检测图，图2是本发明单增李斯特菌检测板的检测图。

3)自然样品中单增李斯特菌检测的模拟试验

按照食品微生物检测国标方法，将食物样品，无菌操作称取25g(或mL)，加入到装有225mL无菌生理盐水的样品罐中，混匀做成样品液。将单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌活化后，分别挑取单菌落充分混匀，做成混合菌悬液，吸取1mL混合菌悬液加入到样品液中，做成人工污染样品，放置4～5h后，按10倍系列梯度稀释成不同的稀释度，挑取3个适宜的稀释度，接种单增李斯特菌检测板，37℃培养24～28h计数观察。

结果如表3所示：

二、金黄色葡萄球菌检测板的研制

1)金黄色葡萄球菌检测板的制作

将聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠按照质量比为1:1:8，用搅拌机混匀，制成混合凝胶粉末。按照0.1g凝胶粉末添加到50mL去离子水中沸水浴制成凝胶水溶液，冷却后将凝胶溶液按照5mL/板加入有凹槽的透明吸塑模具中，烘干后贴含有金黄色葡萄球菌显色培养基的吸水滤纸，再烘干，经过环氧乙烷或者Co₆₀灭菌完毕后，4～8℃冰箱保存备用。

2)金黄色葡萄球菌检测板的特异性试验

将金黄色葡萄球菌ATCC6538，金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003，单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19115、大肠埃希氏菌ATCC8099、阪崎肠杆菌ATCC29544、肠炎沙门氏菌CMCC(B)50335、蜡样芽胞杆菌CMCC(B)63303、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104、副溶血性弧菌ATCC17802、粪链球菌ATCC29212、痢疾志贺氏菌CMCC(B)51252、白色假丝酵母ATCC10231。12种标准菌株分别活化后制成适当浓度的标准菌悬液(浓度为10⁰～10²cfu/mL)，分别取1mL菌悬液接种金黄色葡萄球菌检测板，并同时接种1mL菌悬液至NA平板或者PDA平板为对照，37℃培养24±2h。

检测结果见表4，“+”表示阳性结果，有紫红色菌点出现；“－”表示阴性结果，无菌点生长或者无紫红色菌点出现：

由表4可知，12个标准菌株在检测板和进口的金黄色葡萄球菌显色培养基检测结果完全一致，特异性好，除了2株金黄色葡萄球菌标准菌株为紫红色阳性菌点，其他10个标准菌株在检测板上均呈阴性，因此金黄色葡萄球菌检测板可以用于金黄色葡萄球菌的检测和计数。图3是科玛嘉金黄色葡萄球菌显色培养基平板检测图；图4是本发明金黄色葡萄球菌检测板的检测图。

3)自然样品中金黄色葡萄球菌检测的模拟试验

按照食品微生物检测国标方法，将食物样品，无菌操作称取25g(或mL)，加入到装有225mL无菌生理盐水的样品罐中，混匀做成样品液。将金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌活化后，分别挑取单菌落充分混匀，做成混合菌悬液，吸取1mL混合菌悬液加入到样品液中，做成人工污染样品，放置4～5h后，按10倍系列梯度稀释成不同的稀释度，挑取3个适宜的稀释度，接种金黄色葡萄球菌检测板，37℃培养24h计数观察。

结果如表5所示：

三、沙门氏菌检测板的研制

1)沙门氏菌检测板的制作

将聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠按照质量比为1:2:4，用搅拌机混匀，制成混合凝胶粉末。按照0.1g凝胶粉末添加到50mL去离子水中沸水浴制成凝胶水溶液，冷却后将凝胶溶液按照5mL/板加入有凹槽的透明吸塑模具中，烘干后贴含有沙门氏菌显色培养基的的吸水滤纸，再烘干，经过环氧乙烷或者Co₆₀灭菌完毕后，4～8℃冰箱保存备用。

2)沙门氏菌检测板的特异性试验

将肠炎沙门氏菌CMCC(B)50335，大肠埃希氏菌ATCC8099、阪崎肠杆菌ATCC29544、、蜡样芽胞杆菌CMCC(B)63303、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104、副溶血性弧菌ATCC17802、粪链球菌ATCC29212、痢疾志贺氏菌CMCC(B)51252、白色假丝酵母ATCC10231。9种标准菌株分别活化后制成适当浓度的标准菌悬液(浓度为10⁰～10²cfu/mL)，分别取1mL菌悬液接种沙门氏菌检测板，并同时接种1mL菌悬液至NA平板或者PDA平板为对照，37℃培养24h。

检测结果见表6，“+”表示阳性结果，有紫红色菌点出现；“－”表示阴性结果，无菌点生长或者无紫红色点出现：

由表6可知，9个标准菌株在检测板和进口的沙门氏菌显色培养基检测结果完全一致，特异性好，除了沙门氏菌菌株为紫红色阳性菌点，其他8个标准菌株在检测板上均呈阴性，因此沙门氏菌检测板可以用于沙门氏菌的检测和计数。

3)自然样品中沙门氏菌检测的模拟试验

按照食品微生物检测国标方法，将食物样品，无菌操作称取25g(或mL)，加入到装有225mL无菌生理盐水的样品罐中，混匀做成样品液。将沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和志贺氏菌活化后，分别挑取单菌落充分混匀，做成混合菌悬液，吸取1mL混合菌悬液加入到样品液中，做成人工污染样品，放置4～5h后，按10倍系列梯度稀释成不同的稀释度，挑取3个适宜的稀释度，接种李斯特菌检测板，37℃培养24～28h计数观察。

结果见表7：

四、大肠杆菌(大肠埃希氏菌)O157检测板的研制

1)大肠杆菌(大肠埃希氏菌)O157检测板的制作

将聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠按照质量比为1:2:8，用搅拌机混匀，制成混合凝胶粉末。按照0.1g凝胶粉末添加到50mL去离子水中沸水浴制成凝胶水溶液，冷却后凝胶溶液按照5mL/板加入有凹槽的透明吸塑模具中，烘干后贴含有大肠埃希氏菌O157显色培养基的的吸水滤纸，再烘干，经过环氧乙烷或者Co₆₀灭菌完毕后，4～8℃冰箱保存备用。

2)大肠杆菌(大肠埃希氏菌)O157检测板的特异性试验

将大肠埃希氏菌O157NCTC12900、大肠埃希氏菌ATCC8099、肠炎沙门氏菌CMCC(B)50335、蜡样芽胞杆菌CMCC(B)63303、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104、副溶血性弧菌ATCC17802、粪链球菌ATCC29212、痢疾志贺氏菌CMCC(B)51252、白色假丝酵母ATCC10231。9种标准菌株分别活化后制成适当浓度的标准菌悬液(浓度为10⁰～10²cfu/mL)，分别取1mL菌悬液接种大肠杆菌(大肠埃希氏菌)O157检测板，并同时接种1mL菌悬液至NA平板或者PDA平板为对照，37℃培养24h。

检测结果见表8，“+”表示阳性结果，有紫红色菌点出现；“－”表示阴性结果，无菌点生长或者紫红色点出现：

由表8可知，9个标准菌株在检测板和大肠埃希氏菌O157显色培养基检测结果完全一致，特异性好，大肠埃希氏菌O157NCTC12900为紫红色阳性菌点，其他8个标准菌株在检测板上均呈阴性，因此大肠杆菌(大肠埃希氏菌)O157检测板可以用于大肠埃希氏菌O157的检测和计数。

3)自然样品中大肠杆菌(大肠埃希氏菌)O157检测板的模拟试验

按照食品微生物检测国标方法，将食物样品，无菌操作称取25g(或mL)，加入到装有225mL无菌生理盐水的样品罐中，混匀做成样品液。将大肠埃希氏菌O157、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌活化后，分别挑取单菌落充分混匀，做成混合菌悬液，吸取1mL混合菌悬液加入到样品液中，做成人工污染样品，放置4～5h后，按10倍系列梯度稀释成不同的稀释度，挑取3个适宜的稀释度，接种大肠杆菌(大肠埃希氏菌)O157检测板，37℃培养16～24h计数观察。

结果如表9所示：

Claims

1.一种用于微生物检测的透明吸水凝胶，其特征在于：所述透明吸水凝胶的固形物由聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠组成。

2.根据权利要求1所述的一种用于微生物检测的透明吸水凝胶，其特征在于：聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠的质量比为1:（1～2）:(4～8)。

3.根据权利要求1所述的一种用于微生物检测的透明吸水凝胶，其特征在于：聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠的质量比为1:1:4、1:1:8、1:2:4或1:2:8。

4.根据权利要求1所述的一种用于微生物检测的透明吸水凝胶，其特征在于：聚丙烯酸树脂的数均分子量为260000～500000。

5.根据权利要求1所述的一种用于微生物检测的透明吸水凝胶，其特征在于：羧甲基纤维素钠的数均分子量为5400～7400。

6.根据权利要求1所述的一种用于微生物检测的透明吸水凝胶，其特征在于：聚丙烯酸钠的数均分子量为100000～2000000。

7.根据权利要求1所述的一种用于微生物检测的透明吸水凝胶，其特征在于：所述微生物选自单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157。

8.一种快速透明微生物检测板，其特征在于：检测板使用的透明吸水凝胶的组成如权利要求1～7任意一项所述。