CN111733069B - 一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法 - Google Patents

一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111733069B
CN111733069B CN202010665247.0A CN202010665247A CN111733069B CN 111733069 B CN111733069 B CN 111733069B CN 202010665247 A CN202010665247 A CN 202010665247A CN 111733069 B CN111733069 B CN 111733069B
Authority
CN
China
Prior art keywords
yeast
mold
visible light
fluorescence
colony counting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010665247.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111733069A (zh
Inventor
陈萍
徐琳琳
王蕾
孙博
孙雯
王思琪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin Agricultural University
Original Assignee
Jilin Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin Agricultural University filed Critical Jilin Agricultural University
Priority to CN202010665247.0A priority Critical patent/CN111733069B/zh
Publication of CN111733069A publication Critical patent/CN111733069A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111733069B publication Critical patent/CN111733069B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/045—Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法，属于食品检测技术领域。从上至下，依次由带有粘性下表面的透明塑料上层膜、带有镂空区域的塑料中层板和印刷有方格的底板三部分组成；透明塑料上层膜的粘性下表面涂覆有复配冷水可溶性凝胶粉末；塑料中层板的镂空区域为圆形、椭圆形或方形结构，镂空区域面积与塑料中层板面积的比例范围为1:1.6～2.7，在镂空区域填充有形状与镂空区域相同的浸渍有霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数显色培养基的灭菌无纺布。霉菌和酵母利用测试片中荧光/显色底物水解后释放的发色基团呈色，该测试片既能在365nm紫外灯下进行荧光菌落计数，也能够在可见光条件下进行菌落计数。

Description

一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试 片及制备方法
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法。
背景技术
霉菌和酵母计数测定指标是反映食品质量卫生安全的重要指标，用来判定食品受污染的程度。霉菌和酵母计数检测是各类食品重要的检测项目。目前GB4789.15-2016食品安全国家标准《食品微生物学检验-霉菌和酵母计数》，采用琼脂平皿计数法。该方法检测程序繁琐，检测消耗时间较长，难以满足食品质量卫生现场监测检测结果的时效性。微生物计数测试片类检测产品省去了配制培养基、消毒灭菌和培养器皿的清洗处理等大量辅助性工作，计数便捷，只需要个简单的步骤样品制备、增殖培养和计数，是国内外进行微生物污染计数测定较为理想的检测产品。
虽然现有的商业化微生物测试片检测产品具有方便实用的突出优势，但霉菌和酵母菌落计数测试片仍然存在一些关键技术瓶颈需解决。突出问题集中在计数准确性差；检测周期长，一般为48h～72h。
发明内容
本发明针对上述存在问题研制了一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法。既能在365nm紫外灯下进行荧光菌落计数，又能在可见光条件下对显色菌落进行计数。本发明所述测试片采用复配显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(BCIP-2Na)和4-硝基苯棕榈酸酯(PNP-PAL)构成霉菌和酵母落计数测试片的显色系统；同时，在测试片培养基中加入荧光增敏剂——乙醇以及非离子表面活性剂Tween-80和TritonX-100，加速了霉菌和酵母菌落在测试片中呈色，其中荧光检测可在培养18h后进行菌落计数，无背景干扰；当培养30h后可在可见光下肉眼准确计数。该荧光/可见光双重检测测试片霉菌和酵母菌落呈色清晰、计数准确。
本发明的目的之一在于提供一种操作简单、检测时间短、计数结果准确的霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片。该菌落计数测试片从上至下，依次由带有粘性下表面的透明塑料上层膜、带有镂空区域的塑料中层板和印刷有方格的底板三部分组成；透明塑料上层膜的粘性下表面涂覆有复配冷水(温度范围是20～45℃)可溶性凝胶粉末；塑料中层板的镂空区域为圆形、椭圆形或方形结构，镂空区域面积与塑料中层板面积的比例范围为1:1.6～2.7，在镂空区域填充有形状与镂空区域相同的浸渍有霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数显色培养基的灭菌无纺布。
复配冷水可溶性凝胶粉末是将经研磨后过10～150目标准筛的丙酮酸钠和瓜尔胶混合后得到，按丙酮酸钠和瓜尔胶的重量和100％计算，丙酮酸钠的重量百分含量为15～25％，其余为瓜尔胶。
霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数显色培养基的重量组份为：蛋白胨10～20g，葡萄糖10～20g，无水乙醇4～40mL，硫酸铜0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.3g，氯化锌0.05～0.25g，Tween-80 1mL～3mL，TritonX-100 1mL～3mL，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(BCIP-2Na)0.1～1.0g，4-硝基苯棕榈酸酯(PNP-PAL)0.1～1.0g，氯霉素0.05～0.2g和蒸馏水1000mL。
以灭菌无纺布作为显色培养基的载体，其为密度50～80g/m2的水刺无纺布。
透明塑料上层膜为透明度高、无毒无刺激性气味、防水透气的PET硅胶膜，厚度为0.05～0.10mm，PET硅胶膜的下表面自身带有粘性；带有镂空区域的塑料中层板为硬度较好且透明高的PP塑料板或PVC塑料板，厚度为0.15～0.30mm；印刷有方格的底板为防水、防渗透的白色铜版纸，厚度为0.10～0.20mm；方格的尺寸范围是(1～2)cm×(1～2)cm。以上材料耐高温的温度范围为130～150℃。
本发明另一个目的是提供上述霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片的制备方法，其步骤如下：
(1)霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数培养基的制备
称取蛋白胨10～20g，葡萄糖10～20g，硫酸铜0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.3g，氯化锌0.05～0.25g，加入蒸馏水900mL搅拌溶解后，经121℃高温灭菌15～20min放置室温，得到液体培养基，冷却至室温；将氯霉素0.05～0.2g，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(BCIP-2Na)0.1～1.0g和4-硝基苯棕榈酸酯(PNP-PAL)0.1～1.0g加入100mL含有无水乙醇4～40mL，Tween-80 1mL～3mL，TritonX-100 1mL～3mL的蒸馏水中，用孔径0.22μm的一次性过滤器过滤除菌后加入到灭菌后的液体培养基中，得到霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数培养基；将灭菌无纺布充分浸泡在霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数培养基中，浸泡的时间为15～30min，再于无菌条件下20～45℃烘干，得到浸渍有霉菌和酵母荧光/可见光显色培养基的灭菌无纺布；
(2)复配冷水可溶性凝胶的制备
将经研磨后过100～150目标准筛的丙酮酸钠和瓜尔胶混合，得到复配冷水可溶凝胶粉末，其中丙酮酸钠的重量百分含量为15～25％；
(3)霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片的制备
将透明塑料上层膜、塑料中层板和印刷有方格的底板剪裁成相同尺寸(长度9～12cm，宽度7～10cm)，用聚丙烯酸树脂压敏胶(透明、无毒、无味、无菌)将贴有标签的一侧封闭粘合，粘合宽度为4～6mm；
将上述复配冷水可溶凝胶粉末均匀地涂在透明塑料上层膜的粘性下表面上，厚度为0.10～0.20mm；
在塑料中层板镂空区域露出的底板上均匀涂覆聚丙烯酸树脂压敏胶，厚度为0.05～0.10mm，将浸渍有霉菌和酵母计数显色培养基的灭菌无纺布放在塑料中层板的镂空区域内并压实；
进行真空包装，然后采用环氧乙烷灭菌法进行灭菌，从而得到用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片。
(4)霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片法测定的操作步骤
固体或半固体样品：称取25g样品(样品可以是米面制品、糕点类食品、坚果制品)，加入225mL无菌稀释液(蒸馏水、生理盐水或磷酸盐缓冲液)，充分振摇或用拍击式均质器拍打1～2min，制成1:10的稀释匀液。
液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品(样品可以是饮料)置于盛有225mL无菌稀释液(蒸馏水、生理盐水或磷酸盐缓冲液)的容器或无菌均质袋中，充分振摇或用拍击式均质器拍打1～2min，制成1:10的稀释匀液。
取1mL上述1:10的稀释匀液加入盛有9mL无菌稀释液的试管中，在漩涡混合器上混匀，得到1:100的稀释匀液；依次制备10倍梯度稀释匀液，得到不同稀释度的稀释匀液，备用。
根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的稀释匀液，掀开霉菌和酵母计数测试片的透明塑料上层膜，取上述样品稀释匀液1mL加至中层浸渍有霉菌和酵母荧光/可见光菌落计数显色检测培养基的灭菌无纺布上，使样品匀液均匀分布于整个培养区；将塑料上层膜缓缓落下，避免挤压，静置30s～60s待复配冷水可溶性凝胶与水固化，放入25～30℃恒温培养箱培养18～48h，于365nm紫外灯或可见光下，按照GB 4789.15-2016食品安全国家标准《食品微生物学检验-霉菌和酵母计数》方法进行菌落计数。同时作空白对照。
本发明研制的是霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片，与同类产品相比，突出特征在于该测试片既能够在365nm紫外灯下进行荧光菌落计数，也可以在可见光条件下计数。其中荧光计数能够大幅度缩短霉菌和酵母的检测时间。该测试片由基础营养培养基、无机盐、抑菌剂、显色剂、荧光增敏剂及非离子表面活性剂组成。主要包括3个重要特征。
重要技术特征1：本发明通过特异性荧光/显色底物组成和用量设计与优化，显著缩短了霉菌和酵母检测时间。此外，底物释放的荧光发色基团显著提高了由于早期霉菌和酵母污染无显著菌落特征而被忽略的技术难题。试验结果表明，显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(BCIP-2Na)和4-硝基苯棕榈酸酯(PNP-PAL)复配后，霉菌和酵母培养18h便可在365nm紫外灯下呈蓝色荧光(图2)。与GB 4789.15-2016食品安全国家标准《食品微生物学检验-霉菌和酵母计数》中描述的琼脂平皿法(5～7d)相比较显著缩短了检测时间，背景干扰低，计数结果也更加准确。
重要技术特征2：首次分析了极性溶剂乙醇在霉菌和酵母落计数测试片中对菌落荧光的增敏作用。极性溶剂乙醇在霉菌和酵母计数测试片荧光计数方法中对菌落荧光强度具有显著的增敏作用。水与乙醇形成的共溶剂对复配底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(BCIP-2Na)和4-硝基苯棕榈酸酯(PNP-PAL)中发色基团的荧光特征具有辅助增强作用。此外，研究发现，菌落的荧光强度高度依赖乙醇浓度，乙醇浓度微量的变化对菌落荧光强度影响显著，在对霉菌和酵母孢子生长无影响的前提下，极性溶剂乙醇终浓度为8mL/L时，测试片中霉菌和酵母落呈现的荧光计数最为清晰(图3，图4)。
重要技术特征3：研究了非离子表面活性剂在霉菌和酵母落计数测试片中对霉菌和酵母生长的影响。非离子表面活性剂Tween-80和TritonX-100对霉菌和酵母菌落计数和菌落直径的影响十分显著。研究结果表明，1mL的Tween-80和TritonX-100能够在较短的培养时间内加速霉菌和酵母菌落的形成(图5)。
本发明基于上述组分制备的霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片，既能够在培养18h后，365nm紫外灯下进行荧光菌落计数，也能够在培养30h后可见光条件下对显色菌落进行计数(图6)。利用本专利的霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片检测多类食品中霉菌和酵母，程序简便、菌落呈色清晰、检测时间短，计数准确。此外培养基中形成的水/乙醇共溶剂以及添加的非离子表面活性剂对菌落荧光/可见光双重检测时间和菌落形成具有促进作用。该测试片将在食品生产企业出厂检验、卫生防疫、市场监督、商检及进出口检疫领域有着较为广阔的应用前景。
附图说明
图1：霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片结构示意图；
如图1所示，各部分为：标签1、上层透明PET硅胶膜2、中间带有镂空区域的透明PVC中层板3、培养区域4、白色铜版纸5；
图2：霉菌和酵母荧光/可见光菌落示意图；
如图2所示，可视化菌落判读(图A)：酵母菌：小型菌落、边界清晰、绿色或深绿色或蓝绿色，颜色均一，菌落有立体感；霉菌：菌落体型较大、边界模糊，中间颜色深暗，蓝色或自然色(即黑色、黄色、绿色等)。365nm处荧光菌落判读(图B)：酵母菌：小型菌落、边界清晰，菌落呈蓝绿色荧光，细胞核明显；霉菌：菌落体型较大、边界模糊，荧光均一。
图3：乙醇浓度梯度对霉菌和酵母落荧光的影响；
如图3所示，1-10为无水乙醇在培养基的终浓度：4mL/L，8mL/L，12mL/L，16mL/L，20mL/L，24mL/L，28mL/L，32mL/L，36mL/L，40mL/L。A:可见光菌落图像；B:365nm紫外光处的荧光菌落图像。极性溶剂乙醇的存在对菌落计数有荧光增敏作用，当乙醇浓度为8mL/L菌落计数和视觉效果最佳。但随着乙醇浓度的增加霉菌和酵母的生长被显著抑制。
图4：乙醇浓度梯度对霉菌和酵母菌落计数的影响；
如图4所示，极性溶剂乙醇的浓度与霉菌和酵母的生长速率成反比。当复配显色底物终浓度为0.2g/L，低浓度乙醇4mL/L不能控制霉菌菌丝的过度扩散，使菌落相互覆盖，不利于菌落计数的准确性。当乙醇浓度为8mL/L时，霉菌和酵母菌落计数和视觉效果最佳。但随着乙醇浓度的增加霉菌和酵母的生长被显著抑制。
图5：不同非离子表面活性剂及浓度对霉菌和酵母生长的影响；
如图5所示，非离子表面活性剂Span-80、Tween-20、Tween-80和TritonX-100分别以1mL/L、1.5mL/L和2.0mL/L的终浓度施用。柱状图上标注的字母(菌落数：a-f；菌落直径：u-z)为经Duncan多重极差检验差异显著(P＝0.05)。当Tween-80和TritonX-100添加量1mL/L时霉菌和酵母菌落计数和菌落直径显著高于Span-80和Tween-20。
图6：本发明霉菌和酵母荧光/可见光菌落计数测试片回归方程与相关系数曲线
如图6所示，测试片可见光菌落计数与GB 4789.15-2016食品安全国家标准《食品微生物学检验-霉菌和酵母计数》达到高度相关(R2霉菌＝0.9954,P<0.001,R2酵母＝0.9921,P<0.001)。测试片荧光菌落计数与GB 4789.15-2016食品安全国家标准《食品微生物学检验-霉菌和酵母计数》达到高度相关(R2霉菌＝0.9985,P<0.001,R2酵母＝0.9964,P<0.001)。
具体实施方式
实施例1：霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数培养基的制备
霉菌和酵母计数检测培养基的制备方法是：将15g蛋白胨，15g葡萄糖，0.2g硫酸铜，0.2g氯化钙，0.1g氯化锌加入900mL蒸馏水中搅拌溶解后，121℃高压灭菌15min，得到液体培养基，冷却至室温；将0.1g氯霉素，0.2g 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(BCIP-2Na)和0.2g 4-硝基苯棕榈酸酯(PNP-PAL)加入100mL含有8mL无水乙醇、1mL Tween-80、1mLTritonX-100的蒸馏水中，用孔径0.22μm的一次性过滤器过滤除菌后加入到灭菌后的液体培养基中，得到霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数培养基。放入密度为60g/m2、直径为6cm、厚度为0.15mm的灭菌无纺布充分浸泡在霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数培养基中15min，25℃无菌烘干，备用。
复配冷水可溶性凝胶粉末的制备方法是：将冷水可溶性凝胶瓜尔胶、丙酮酸钠分别研磨成粉末，过120目筛，按瓜尔胶和丙酮酸钠的重量百分含量80％和20％充分混匀，备用。
实施例2：霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片的制备
(1)测试片由三层组成，分别为带有粘性下表面的上层透明PET硅胶膜、中层带有镂空区域的透明PVC板、下层白色铜板纸。三部分均裁剪成9cm×7cm，中间镂空区域(直径6cm圆形)与底板粘合成培养区。将上、中、下三部分用聚丙烯酸树脂压敏胶将标签一侧边缘互相粘合，粘合宽度为5mm。
(2)将复配冷水可溶凝胶粉末，均匀地涂在测试片上层膜的粘性下表面上，厚度为0.15mm，每片测试片的冷水凝胶粉末的质量为0.2g。
(3)以密度为60g/m2，直径为6cm圆形的无纺布为培养基载体。
(4)在中层镂空区域对应的底板上先均匀涂上透明聚丙烯酸树脂压敏胶0.2g，厚度为0.06mm，再将载有培养基的无纺布黏附于培养区。
(5)将测试片进行真空包装。
(6)采用环氧乙烷灭菌法进行测试片灭菌。
实施例3：霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片的检测方法
(1)实验菌株为黑曲霉(CICC 40374)和酿酒酵母(CICC1946)。
(2)为了获取新鲜菌株，取黑曲霉和酿酒酵母接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)28℃培养5d。在霉菌的平皿中分别加入10mL无菌水，无菌涂布棒轻轻涂布，吸取霉菌孢子洗液，所得孢子悬液于4℃保存，用于后续实验。无菌接菌环挑取酵母单菌落，转移接种至YPD培养基中180r/min恒温28℃扩大培养12h，4℃保存备用。用血球计数板对黑曲霉孢子和酿酒酵母悬浊液浓度进行测定，计数后进行梯度稀释。取25mL原菌液加入225mL无菌水，重复以上操作，制备10倍系列稀释的菌悬液备用。混合菌液将菌液稀释液按1:1比混合均质后备用。
(3)取1mL菌悬液，掀开测试片上层膜，在测试片培养区域中缓缓加入菌悬液，使菌悬液分布于整个培养区，将上膜缓缓落下，静置30s待凝胶固化，放入培养箱于28℃培养。每个稀释度做三个平行样品，同时取1mL无菌水作空白对照，以GB 4789.15-2016食品安全国家标准《食品微生物学检验-霉菌和酵母计数》为参照。结果见表1。研究结果经Duncan多重极差检验分析结果表明，霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片在培养18h后对霉菌和酵母进行荧光菌落计数的结果，以及在培养30h后可见光下对霉菌和酵母进行菌落计数的结果，与GB 4789.15-2016食品安全国家标准《食品微生物学检验-霉菌和酵母计数》中描述的琼脂平皿法(5d)的菌落计数结果无显著性差异(P＞0.05)，且随着培养时间的继续增加霉菌和酵母菌落计数结果趋于稳定。
(4)将完成增殖培养的测试片置于365nm紫外灯下对菌落进行观察，霉菌：菌落体型较大、边界模糊，荧光均一，酵母：小型菌落、边界清晰，菌落呈蓝色荧光中心细胞核明显；可见光肉眼观察，霉菌：菌落体型较大、边界模糊，中间颜色深暗，蓝色或自然色(即黑色、黄色、绿色等)，酵母：小型菌落、边界清晰、绿色或深绿色或蓝绿色，颜色均一，菌落有立体感。计数方法参照GB 4789.15-2016食品安全国家标准《食品微生物学检验-霉菌和酵母计数》进行计数。
若所有稀释度的测试片上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的测试片进行计数，其他测试片可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
若所有稀释度的测试片菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
若所有稀释度(包括液体样品原液)测试片均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
若所有稀释度的测试片菌落数均不在10CFU～150CFU之间，其中一部分小于10CFU或大于150CFU时，则以最接近10CFU或150CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
表1：霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片检测时间
平均±标准差分别表示霉菌和酵母的计数结果。经Duncan多重极差检验，上角标霉菌(a-d)和酵母(v-z)表示检测结果差异显著(P<0.05)。
Pearson相关性分析结果见表2。分析结果表明，本发明研制的霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片的荧光菌落计数(18h)和可见光菌落计数(30h)的菌落计数结果与GB 4789.15-2016食品安全国家标准《食品微生物学检验-霉菌和酵母计数》中描述的琼脂平皿法(5d)的计数结果相关性显著(荧光计数：r霉菌＝0.999，P霉菌＜0.001；r酵母＝0.998，P酵母＜0.001；可视化计数：r霉菌＝0.998,P霉菌＜0.001；r酵母＝0.996，P酵母＜0.001；荧光计数与可视化计数r霉菌＝0.999,P霉菌＜0.001；r酵母＝0999，P酵母＜0.001)，表明测试片荧光与可见光肉眼计数方法与国标法检测结果的相关性显著(0.800＜r＜1.00，P＜0.05)。上述结果表明，霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片的荧光菌落计数法和可见光菌落计数法与国标法均有高度相关性，因此，霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片可用于霉菌和酵母检测，且荧光计数法可用于霉菌和酵母的快速检测。
表2：霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片与国标法相关性分析
P<0.05表示相关性显著。
(5)测试片特异性检测
将实验菌株酿酒酵母、黑曲霉等16株霉菌和酵母分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基28℃培养5d。在霉菌的平皿中分别加入10mL无菌，无菌涂布棒轻轻涂布，吸取霉菌孢子洗液，所得孢子悬液于4℃保存，用于后续实验。无菌接菌环挑取酵母单菌落，转移接种至酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中180r/min恒温28℃扩大培养12h，4℃保存备用。用血球计数板对黑曲霉孢子悬浊液浓度进行测定，计数后进行梯度稀释。酿酒酵母按上述方法进行同样操作。混合菌液将菌液稀释液按1:1比混合均质后备用。制备成原菌液备用。将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡糖球菌等4株细菌分别接种于100mL Luria-Bertani培养基液体培养基中，于37℃恒温摇床180r/min振荡培养12h，制备成原菌液备用。取25mL原菌液加入225mL无菌水，重复以上操作，制备10倍系列稀释的菌液，采用本发明霉菌和酵母测试片实例3方法和GB 4789.15-2016食品安全国家标准《食品微生物学检验-霉菌和酵母计数》进行9株霉菌和7株酵母、4株细菌的菌落计数测定。
实验结果表明，9株霉菌和7株酵母在培养18h均能在365nm紫外灯下进行荧光菌落计数，培养30h后可在可见光条件下对显色菌落进行计数，4株细菌不生长，测试片特异性良好。测试片法与GB 4789.15-2016食品安全国家标准《食品微生物学检验-霉菌和酵母计数》测定计数结果无差异显著性(P>0.05)，计数结果准确。实验结果见表3。实验结果表明，本研究得到的霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片可对霉菌和酵母进行特异性检测，可用于食品中霉菌和酵母的快速检测。
表3：霉菌和酵母荧光/可见光菌落计数测试片测试片特异性检验
-ve表示检测结果为阴性。

Claims (3)

1.一种霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片，其特征在于：该菌落计数测试片从上至下，依次由带有粘性下表面的透明塑料上层膜、带有镂空区域的塑料中层板和印刷有方格的底板三部分组成；透明塑料上层膜的粘性下表面涂覆有复配冷水可溶性凝胶粉末；塑料中层板的镂空区域为圆形、椭圆形或方形结构，镂空区域面积与塑料中层板面积的比例范围为1：1.6 ~ 1：2.7，在镂空区域填充有形状与镂空区域相同的浸渍有霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数显色培养基的灭菌无纺布；且该霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片由如下步骤制备得到，
(1) 霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数培养基的制备
将15g蛋白胨、15g葡萄糖、0.2g硫酸铜、0.2g氯化钙、0.1g氯化锌加入900mL蒸馏水中搅拌溶解后，121℃高压灭菌15min，得到液体培养基，冷却至室温；将0.1g氯霉素、0.2g 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐和0.2g 4-硝基苯棕榈酸酯加入100mL含有8mL无水乙醇、1mLTween-80、1mL TritonX-100的蒸馏水中，用孔径0.22μm的一次性过滤器过滤除菌后加入到灭菌后的液体培养基中，得到霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数培养基；将灭菌无纺布充分浸泡在霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数培养基中，浸泡的时间为15~30min，再于无菌条件下20~45℃烘干，得到浸渍有霉菌和酵母荧光/可见光显色培养基的灭菌无纺布；
(2)复配冷水可溶性凝胶粉末的制备
将冷水可溶性凝胶瓜尔胶、丙酮酸钠分别研磨成粉末，过120目筛，按瓜尔胶和丙酮酸钠的重量百分含量80%和20%充分混匀；
(3)霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片的制备
将透明塑料上层膜、塑料中层板和印刷有方格的底板剪裁成相同尺寸，用聚丙烯酸树脂压敏胶将贴有标签的一侧封闭粘合，粘合宽度为4~6mm；
将上述复配冷水可溶凝胶粉末均匀地涂在透明塑料上层膜的粘性下表面上，厚度为0.10~0.20mm；
在塑料中层板镂空区域露出的底板上均匀涂覆聚丙烯酸树脂压敏胶，厚度为0.05~0.10mm，将浸渍有霉菌和酵母计数显色培养基的灭菌无纺布放在塑料中层板的镂空区域内并压实；
进行真空包装，然后采用环氧乙烷灭菌法进行灭菌，从而得到用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片。
2.如权利要求1所述的一种霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片，其特征在于：灭菌无纺布为厚度0.10~0.20mm、密度50~80g/m2的水刺无纺布。
3.如权利要求1所述的一种霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片，其特征在于：透明塑料上层膜为PET硅胶膜，厚度为0.05~0.10mm，PET硅胶膜的下表面自身带有粘性；带有镂空区域的塑料中层板为PP塑料板或PVC塑料板，厚度为0.15~0.30mm；印刷有方格的底板为白色铜版纸，厚度为0.10~0.20mm；方格的尺寸范围是（1~2）cm ×（1~2）cm。
CN202010665247.0A 2020-07-11 2020-07-11 一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法 Active CN111733069B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010665247.0A CN111733069B (zh) 2020-07-11 2020-07-11 一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010665247.0A CN111733069B (zh) 2020-07-11 2020-07-11 一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111733069A CN111733069A (zh) 2020-10-02
CN111733069B true CN111733069B (zh) 2023-07-18

Family

ID=72654399

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010665247.0A Active CN111733069B (zh) 2020-07-11 2020-07-11 一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111733069B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106854620A (zh) * 2017-01-22 2017-06-16 贵州勤邦食品安全科学技术有限公司 一种快速高效检测菌落总数的测试片及其制备方法
CN107090486A (zh) * 2010-12-30 2017-08-25 3M创新有限公司 用于检测靶微生物的制品和方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2976952A1 (fr) * 2011-06-27 2012-12-28 Commissariat Energie Atomique Procede pour caracteriser la presence ou l'absence d'un microorganisme dans un milieu biologique
US8921067B2 (en) * 2013-02-04 2014-12-30 3M Innovative Properties Company Method and culture device for detecting yeasts and molds
US20180355404A1 (en) * 2015-04-07 2018-12-13 Novozymes A/S Methods for selecting enzymes having lipase activity
CN105754849B (zh) * 2016-03-31 2018-02-16 吉林农业大学 一种菌落总数测试片、制备方法及其应用
CN106520542A (zh) * 2016-12-16 2017-03-22 天津科技大学 一种菌落总数测试片及其制作方法
CN109182445B (zh) * 2018-09-20 2021-10-22 吉林农业大学 一种霉菌和酵母计数测试片、制备方法及其应用
CN110129406A (zh) * 2019-05-06 2019-08-16 上海源本食品质量检验有限公司 一种铜绿假单胞菌显色培养基及利用其快速检测的方法
CN110591906B (zh) * 2019-10-17 2023-02-03 吉林农业大学 一种大肠菌群计数测试片、制备方法及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107090486A (zh) * 2010-12-30 2017-08-25 3M创新有限公司 用于检测靶微生物的制品和方法
CN106854620A (zh) * 2017-01-22 2017-06-16 贵州勤邦食品安全科学技术有限公司 一种快速高效检测菌落总数的测试片及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111733069A (zh) 2020-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105754849B (zh) 一种菌落总数测试片、制备方法及其应用
CN110591906B (zh) 一种大肠菌群计数测试片、制备方法及其应用
CN101012477B (zh) 一种快速检测食品内微生物的方法及培养基
JP6920212B2 (ja) 嫌気性微生物用培養デバイス
CN101497914A (zh) 一种快速检测微生物的测试片及其制备方法和应用
CN109182445B (zh) 一种霉菌和酵母计数测试片、制备方法及其应用
JP2020072687A (ja) 好気性菌を検出するための物品及び方法
JP2016533727A (ja) 内蔵型嫌気性環境生成培養デバイス及び使用方法
JP6448818B2 (ja) 乳酸菌用培養デバイス
CN104673876B (zh) 一种用于微生物检测的透明吸水凝胶及检测板
Hyman et al. Modified crystal violet pectate medium (CVP) based on a new polypectate source (Slendid) for the detection and isolation of soft rot erwinias
CN104313112A (zh) 用于检测食醋中产气、产膜菌的培养基及检测方法
CN106854620A (zh) 一种快速高效检测菌落总数的测试片及其制备方法
CN111733069B (zh) 一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法
JP6452853B2 (ja) 二酸化炭素発生剤を有する薄膜培養デバイス
CN104789635B (zh) 一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法
CN108220384A (zh) 一种弧菌测试片及其制备方法
JP3630737B2 (ja) 簡易培地
CN106811403A (zh) 一种快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片及其制备方法、检测方法
CN209307376U (zh) 一种微生物测试片
CN108265009A (zh) 一种用于培养布氏白僵菌的培养基及其培养方法
CN109576179B (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌菌株及其在稻曲病上的应用
CN109439595B (zh) 一种防治稻曲病的贝莱斯芽孢杆菌
CN105177108A (zh) 一种可高压灭菌的菌落显色培养基、制备方法及用途
CN208218869U (zh) 一种检测牛奶中菌落总数的装置

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant