CN105177108A - 一种可高压灭菌的菌落显色培养基、制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可高压灭菌的菌落显色培养基、制备方法及用途。该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯SE-11？0.005-0.015g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑0.005-0.015g。可用于测定食品、食品添加剂中的菌落数，其菌落显色为红色或浅红色，边界清晰，菌落显色明显，易于计数，可以将其推广至实际检测中，方便试剂检测工作。
Description
技术领域
本发明涉及菌落书面鉴定领域，尤其涉及一种可高压灭菌的菌落显色培养基、制备方法及用途。
背景技术
菌落总数就是指在一定条件下(如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等)每克(每毫升)检样所生长出来的细菌菌落总数。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
目前国内对食品中菌落总数的的标准检验方法(GB4789.2-2010)中所使用的培养基是平板计数琼脂(复配食品添加剂中菌落总数检测方法并没有详细规定，一般按照标准《GB4789.2》中的方法检测)。经过笔者多年的微生物检测工作，用普通的平板计数琼脂来检测复配食品添加剂中的菌落总数往往会出现下面的结果，第一因某些细菌菌落太小或菌落形态与样品颗粒十分相似，导致菌落与样品颗粒不易区分，特别是颗粒多时会使计数结果出现较大误差，影响了菌落计数结果的准确性；第二在复配食品添加剂均质后倒入平板培养后，因试样本身的颗粒与菌落形态很像，使得计数出现误差，而影响实验结果。
有研究表明，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)是一种氧化剂，细菌在其新陈代谢过程中会产生琥珀酸脱氢酶，在琥珀酸脱氢酶的作用下，TTC接受氢(H)成为红色而稳定的三苯甲臢(TPF)从而使菌落呈现红色或浅红色，故在平板计数琼脂中添加TTC,可使菌落与食品均质样中的固体小颗粒区分开，从而提高检测数据的准确性。但是TTC不能直接加入到培养基中与培养基一同灭菌，否则灭菌后会使培养基变成褐色而导致TTC显色反应失效，进而不能用于实验。
中国专利申请CN103725744A公开了一种显色培养基，除了琼脂等必要营养物质外还加入了TTC及吐温80，但吐温80是一种油状物质，不能同其他琼脂等粉末状物质共同存在，所以不能制备为最终可售的平板计数琼脂。
故开发一种能够最终可市售的菌落显色培养基就成为必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种边界清晰，菌落显色明显，易于计数的可售平板计数琼脂培养基。
为实现上述目的，本发明提供一种可高压灭菌的菌落显色培养基，其特征在于，该培养基每升中包含琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯SE-110.005-0.015g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑0.005-0.015g。所述琼脂是市售平板计数琼脂。
进一步，将各组分按照配比溶于蒸馏水中，煮沸溶解，用1mol/LHCL或1mol/LNaOH调节其pH值为7.0±0.2，115℃高压灭菌15min后制备得到。pH值为7.0±0.2，适于微生物培养，同时满足国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中的要求。
本发明还保护所述菌落显色培养基用于测定食品、食品添加剂中菌落数的用途。
所述的食品添加剂包括所有的食品添加剂，比如复配食品添加剂。
蔗糖脂肪酸酯是非离子表面活性剂，可作用于细菌细胞膜某些受体，使休眠状态的细菌迅速感知外界适宜的生长环境，快速生长，同时降低细菌表面和培养基的表面张力，使营养物质更易吸收。蔗糖脂肪酸酯SE-11是粉末状，与2,3,5-氯化三苯基四氮唑TTC、琼脂等其他营养物质物理状态一致，可以按比例充分混合后制成菌落总数显色计数琼脂出售，而且可与2,3,5-氯化三苯基四氮唑TTC、琼脂等物质共同灭菌而不破坏2,3,5-氯化三苯基四氮唑TTC的显色反应，其加入量少，成本低，并且研究表明蔗糖脂肪酸酯为一种环境友好型的非离子表面活性剂。本发明的发明人进行了大量的前期试验，最后将加入的蔗糖脂肪酸酯(SE-11)加入量的范围缩小到0.005g-0.020g，将2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)加入量的范围缩小到0.005g-0.020g，并以0.005g为单位递增做试验，确定最后蔗糖脂肪酸酯(SE-11)以及2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)加入量，及菌落显色培养基的组分确定。
本发明的有益效果：2,3,5-氯化三苯基四氮唑TTC、蔗糖脂肪酸酯SE-11可与该培养基的其它组分一起经高温高压灭菌后备用而不影响TTC的显色效果；该培养基成本低，易推广，操作简便；菌落显色明显，易于计数。
本发明的实施例3-实施例6分别选取了食品添加剂单体(胶体黄原胶、乳化剂蔗糖脂肪酸酯(SE-11))、复配蛋白饮料稳定剂(复配食品添加剂)以及植物蛋白饮料(食品)为试样进行了显色菌落总数对比实验，从4个实施例的数据比对结果可知，本发明的菌落显色培养基在运用中所得的菌落总数结果与国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中所规定使用的平板计数琼脂培养基(对照组)所得的结果差异不显著，其菌落显色为红色或浅红色，边界清晰，菌落显色明显，易于计数。因为本发明中在原有的市售平板计数琼脂中加入了蔗糖脂肪酸酯SE-11，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，而实施例4中的样品为蔗糖脂肪酸酯SE-11与培养基中的蔗糖脂肪酸酯为同一型号，根据实施例4的结果对比可知，本发明的菌落显色培养基虽然加入蔗糖脂肪酸酯但也不影响对试样蔗糖脂肪酸酯中菌落总数的检测。
综上所述，本发明一种可高压灭菌的菌落显色培养基，其菌落显色为红色或浅红色，边界清晰，菌落显色明显，易于计数，可用于食品，食品添加剂(包括复配食品添加剂)中的菌落总数的测定。由于其相对于平板计数器的低成本以及环保角度考虑，建议其推广，并制成市售菌落显色培养基。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：菌落显色培养基的制备方法及组分含量确定
在大量前期试验中，最后将加入的蔗糖脂肪酸酯(SE-11)加入量的范围缩小到0.005g-0.020g，将2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)加入量的范围缩小到0.005g-0.020g，并以0.005g为单位递增做试验，确定最后蔗糖脂肪酸酯(SE-11)以及2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)加入量，及菌落显色培养基的组分确定。
试验如下：
培养基制备：
第一组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.005g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.005g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第二组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.005g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.010g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第三组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.005g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.015g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第四组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.005g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.020g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第五组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.010g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.005g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第六组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.010g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.010g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第七组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.010g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.015g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第八组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.010g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.020g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第九组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.015g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.005g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第十组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.015g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.010g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第十一组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.015g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.015g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第十二组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.015g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.020g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第十三组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.020g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.005g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第十四组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.020g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.010g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第十五组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.020g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.015g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
第十六组，该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.020g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.020g；按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
样品稀释：称取25.0g植物蛋白饮料置盛有225mL生理盐水的无菌均质杯内，10000r/min均质1min，制成1:10体积比的样品匀液。用1mL无菌微量移液器吸取1:10体积比样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。以此类推，制成相应10倍系列稀释样品匀液。
倒平板：根据样品的物理性质(如粘度)、污染程度等来选择样品的稀释度。本实验由于样品粘度较高，有一定污染，所以选择1:100稀释度的样品匀液。吸取1mL样品匀液于相应组别的无菌平皿内，及时将15mL～20mL冷却至46℃的培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注到相应的平皿中并转动平皿使其混合均匀。每组做十个平行测定，每组都有空白对照。
培养：待琼脂凝固后，将平皿翻转，于36℃±1℃下培养48h±2h。
计数、结果：依据国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中6.3菌落计数和7结果与报告进行计数与报告。十六组琼脂组检测结果和数据比对分别如下表1、表2所示：
表1：十六组琼脂组的检测结果表
注：1、菌落总数报告数(CFU/g)为检测结果X(CFU/g)十个数值的平均值。以下表格同此。
2、空白值试验是
表2：十六组琼脂组的数据比对结果表
从表1、表2中可见当蔗糖脂肪酸酯(SE-11)及2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的加入量不在0.005g-0.015g的范围内的时候，菌落形态各异，红色边界不清晰，不易计数。所以，本发明最终将蔗糖脂肪酸酯(SE-11)及2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的加入量范围控制在分别加入0.005g-0.015g。
从表1和表2可以看出，本发明的菌落显色培养基在原有的市售平板计数琼脂中加入了蔗糖脂肪酸酯SE-11，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)后，在运用中所得的菌落总数结果与国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中所规定使用的平板计数琼脂培养基(对照组)所得的结果差异不显著，其菌落显色为红色或浅红色，边界清晰，菌落显色明显，易于计数。
实施例2：菌落显色培养基的制备
该培养基每升中包含市售平板计数琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯(SE-11)0.005g-0.015g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.005g-0.015g；
按上述各组分称量后，无先后顺序溶于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
实施例3：
对照组培养基(也即国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中所规定使用的平板计数琼脂培养基)：将市售平板计数琼脂23.5g溶于1000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
实验组：实施例2所得。
样品稀释：称取25.0g黄原胶(食品添加剂单体，胶体，粉末状)置盛有225mL生理盐水的无菌均质杯内，10000r/min均质1min，制成1:10重量体积比的样品匀液。用1mL无菌微量移液器吸取所得样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。以此类推，制成相应10倍系列稀释样品匀液。
倒平板：根据样品的物理性质(如粘度)、污染程度等来选择样品的稀释度。本实验由于样品粘度较高，有一定污染，所以选择1:100稀释度的样品匀液，做成对照组和试验组。吸取1mL样品匀液于相应组别的无菌平皿内，及时将15mL～20mL冷却至46℃的培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注到相应的平皿中，对照组内倾注对照组培养基()，实验组倾注实施例1所得培养基；并转动平皿使其混合均匀。每组做二十个平行测定，每组都有空白对照。
培养：待琼脂凝固后，将平皿翻转，于36℃±1℃下培养48h±2h。
计数、结果：依据国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中6.3菌落计数和7结果与报告进行计数与报告。两组琼脂组检测结果和数据比对分别如下表3、表4所示：
表3：两组琼脂组的检测结果表
表4：两组琼脂组的数据比对结果表
备注：采用数理统计学中的成组数据t检验对试验均值进行显著性差异检验，首先进行方差齐性F检验，说明两组数据方差具备齐性；在α＝5％的水平下，t＝0.613<t38/2,0.05＝2.024，所以两组数据(即菌落报告数)在95％置信度下差异不显著。
从表3和表4可以看出，本发明的菌落显色培养基在原有的市售平板计数琼脂中加入了蔗糖脂肪酸酯SE-11，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)后，在运用中所得的菌落总数结果与国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中所规定使用的平板计数琼脂培养基(对照组)所得的结果差异不显著，其菌落显色为红色或浅红色，边界清晰，菌落显色明显，易于计数。
实施例4：
对照组培养基(也即国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中所规定使用的平板计数琼脂培养基)：将市售平板计数琼脂23.5g溶于1000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
实验组：实施例2所得。
样品稀释：称取25.0g蔗糖脂肪酸酯(SE-11，食品添加剂单体，乳化剂，粉末状)置盛有225mL生理盐水的无菌均质杯内，10000r/min均质1min，制成1:10重量体积比的样品匀液。用1mL无菌微量移液器吸取所得样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。以此类推，制成相应10倍系列稀释样品匀液。
倒平板：根据样品的物理性质(如粘度)、污染程度等来选择样品的稀释度。本实验由于样品粘度较高，有一定污染，所以选择1:100稀释度的样品匀液，做成对照组和试验组。吸取1mL样品匀液于相应组别的无菌平皿内，及时将15mL～20mL冷却至46℃的培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注到相应的平皿中，对照组内倾注对照组培养基，实验组倾注实施例1所得培养基；并转动平皿使其混合均匀。每组做二十个平行测定，每组都有空白对照。
培养：待琼脂凝固后，将平皿翻转，于36℃±1℃下培养48h±2h。
计数、结果：依据国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中6.3菌落计数和7结果与报告进行计数与报告。两组琼脂组检测结果和数据比对分别如下表5、表6所示：
表5：两组琼脂组的检测结果表
表6：两组琼脂组的数据比对结果表
备注：采用数理统计学中的成组数据t检验对试验均值进行显著性差异检验，首先进行方差齐性F检验，说明两组数据方差具备齐性；在α＝5％的水平下，t＝4.7×10-4<t38/2,0.05＝2.024，所以两组数据(即菌落报告数)在95％置信度下差异不显著。
从表5和表6可以看出，本发明的菌落显色培养基在原有的市售平板计数琼脂中加入了蔗糖脂肪酸酯SE-11，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)后，在运用中所得的菌落总数结果与国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中所规定使用的平板计数琼脂培养基(对照组)所得的结果差异不显著，其菌落显色为红色或浅红色，边界清晰，菌落显色明显，易于计数。而本实施例的样品为蔗糖脂肪酸酯SE-11与培养基中的蔗糖脂肪酸酯为同一型号，根据本实施例的结果对比可知，本发明的菌落显色培养基虽然加入蔗糖脂肪酸酯但也不影响对试样蔗糖脂肪酸酯中菌落总数的检测。
实施例5：
对照组培养基(也即国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中所规定使用的平板计数琼脂培养基)：将市售平板计数琼脂23.5g溶于1000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
实验组：实施例2所得。
样品稀释：称取25.0g复配蛋白饮料稳定剂(复配食品添加剂，粉末状)置盛有225mL生理盐水的无菌均质杯内，10000r/min均质1min，制成1:10重量体积比的样品匀液。用1mL无菌微量移液器吸取所得样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。以此类推，制成相应10倍系列稀释样品匀液。
倒平板：根据样品的物理性质(如粘度)、污染程度等来选择样品的稀释度。本实验由于样品粘度较高，有一定污染，所以选择1:100稀释度的样品匀液，做成对照组和试验组。吸取1mL样品匀液于相应组别的无菌平皿内，及时将15mL～20mL冷却至46℃的培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注到相应的平皿中，对照组内倾注对照组培养基，实验组倾注实施例1所得培养基；并转动平皿使其混合均匀。每组做二十个平行测定，每组都有空白对照。
培养：待琼脂凝固后，将平皿翻转，于36℃±1℃下培养48h±2h。
计数、结果：依据国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中6.3菌落计数和7结果与报告进行计数与报告。两组琼脂组检测结果和数据比对分别如下表7、表8所示：
表7：两组琼脂组的检测结果表
表8：两组琼脂组的数据比对结果表
备注：采用数理统计学中的成组数据t检验对试验均值进行显著性差异检验，首先进行方差齐性F检验，说明两组数据方差具备齐性；在α＝5％的水平下，t＝0.321<t38/2,0.05＝2.024，所以两组数据(即菌落报告数)在95％置信度下差异不显著。
从表7和表8可以看出，本发明的菌落显色培养基在原有的市售平板计数琼脂中加入了蔗糖脂肪酸酯SE-11，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)后，在运用中所得的菌落总数结果与国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中所规定使用的平板计数琼脂培养基(对照组)所得的结果差异不显著，其菌落显色为红色或浅红色，边界清晰，菌落显色明显，易于计数。
实施例6：
对照组培养基(也即国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中所规定使用的平板计数琼脂培养基)：将市售平板计数琼脂23.5g溶于1000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH为7.0±0.2，高压灭菌后备用，高压灭菌条件为：115℃，15min。
实验组：实施例2所得。
样品稀释：称取25.0g植物蛋白饮料(液体)置盛有225mL生理盐水的无菌均质杯内，10000r/min均质1min，制成1:10重量体积比的样品匀液。用1mL无菌微量移液器吸取所得样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。以此类推，制成相应10倍系列稀释样品匀液。
倒平板：根据样品的物理性质(如粘度)、污染程度等来选择样品的稀释度。本实验由于样品粘度较高，有一定污染，所以选择1:100稀释度的样品匀液，做成对照组和试验组。吸取1mL样品匀液于相应组别的无菌平皿内，及时将15mL～20mL冷却至46℃的培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注到相应的平皿中，对照组内倾注对照组培养基，实验组倾注实施例1所得培养基；并转动平皿使其混合均匀。每组做二十个平行测定，每组都有空白对照。
培养：待琼脂凝固后，将平皿翻转，于36℃±1℃下培养48h±2h。
计数、结果：依据国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中6.3菌落计数和7结果与报告进行计数与报告。两组琼脂组检测结果和数据比对分别如下表9、表10所示：
表9：两组琼脂组的检测结果表
表10：两组琼脂组的数据比对结果表
备注：采用数理统计学中的成组数据t检验对试验均值进行显著性差异检验，首先进行方差齐性F检验，说明两组数据方差具备齐性；在α＝5％的水平下，t＝1.4×10-3<t38/2,0.05＝2.024，所以两组数据(即菌落报告数)在95％置信度下差异不显著。
从表9和表10可以看出，本发明的菌落显色培养基在原有的市售平板计数琼脂中加入了蔗糖脂肪酸酯SE-11，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)后，在运用中所得的菌落总数结果与国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中所规定使用的平板计数琼脂培养基(对照组)所得的结果差异不显著，其菌落显色为红色或浅红色，边界清晰，菌落显色明显，易于计数。
从实施例3-实施例6分别选取了食品添加剂单体(胶体黄原胶、乳化剂蔗糖脂肪酸酯(SE-11))、复配蛋白饮料稳定剂(复配食品添加剂)以及植物蛋白饮料(食品)为试样进行了显色菌落总数对比实验，从4个实施例的数据比对结果可知，本发明的菌落显色培养基在运用中所得的菌落总数结果与国标GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中所规定使用的平板计数琼脂培养基(对照组)所得的结果差异不显著，其菌落显色为红色或浅红色，边界清晰，菌落显色明显，易于计数。因为本发明中在原有的市售平板计数琼脂中加入了蔗糖脂肪酸酯SE-11，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，而实施例4中的样品为蔗糖脂肪酸酯SE-11与培养基中的蔗糖脂肪酸酯为同一型号，根据实施例4的结果对比可知，本发明的菌落显色培养基虽然加入蔗糖脂肪酸酯但也不影响对试样蔗糖脂肪酸酯中菌落总数的检测。
综上所述，本发明一种可高压灭菌的菌落显色培养基，其菌落显色为红色或浅红色，边界清晰，菌落显色明显，易于计数，可用于食品，食品添加剂(包括复配食品添加剂)中的菌落总数的测定。由于其相对于平板计数器的低成本以及环保角度考虑，建议其推广，并制成市售菌落显色培养基。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (3)
1.一种可高压灭菌的菌落显色培养基，其特征在于，该培养基每升中包含琼脂23.5g，蔗糖脂肪酸酯SE-110.005-0.015g，2,3,5-氯化三苯基四氮唑0.005-0.015g。
2.权利要求1所述菌落显色培养基，其特征在于，将各组分按照配比溶于蒸馏水中，煮沸溶解，用1mol/LHCL或1mol/LNaOH调节其pH值为7.0±0.2，115℃高压灭菌15min后制备得到。
3.权利要求1所述菌落显色培养基用于测定食品、食品添加剂中菌落数的用途。
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