CN108611394A

CN108611394A - Tcc在菌落总数测定中防止菌落弥漫生长的用途

Info

Publication number: CN108611394A
Application number: CN201810344118.4A
Authority: CN
Inventors: 郑连宝; 丁琦; 陈文祥; 嵇林凤; 施华标
Original assignee: DEQING INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Current assignee: DEQING INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2018-04-17
Publication date: 2018-10-02

Abstract

本发明提供TCC在菌落总数测定中具有防止菌落弥漫生长的用途，方法：取适宜稀释度的蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，添加0.01％、0.05％、0.08％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.8％、1.0％TTC水溶液平板计数琼脂，同时以不添加TTC的计数琼脂作为对照，观察细菌的生长状况。菌落总数测定中，如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的芽孢杆菌菌落时，可在琼脂中加入0.2％～0.3％的TTC浓度，防止菌落出现弥漫现象而导致无法计数的情况发生。

Description

TCC在菌落总数测定中防止菌落弥漫生长的用途

技术领域

本发明属于菌落总数测定领域，特别涉及一种在菌落总数测定中防止芽孢杆菌弥漫生长的方法。

背景技术

菌落总数作为食品微生物学检验的基础检验项目，有着重要的意义，它用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。如今，食品种类众多，生产原料品种广，加工工艺复杂，特别是糕点、面点等含高淀粉类食品受芽孢杆菌污染的机率大，加工过程中难以彻底灭菌，菌落计数时琼脂平板上就会出现菌落弥漫生长的现象，导致菌落难以计数，对菌落总数检验项目的准确性造成严重的干扰。

目前，在测定食品菌落总数时，琼脂培养基表面往往会出现菌落弥漫生长的现象，对菌落计数造成一定的影响。依据GB 4789.2-2016《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》中，如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4mL)，凝固后翻转平板，按要求条件进行培养。但该方法防止菌落弥漫生长的效果不佳。

发明内容

为寻求更有效的方法，便于菌落观察和计数，本发明人通过研究发现TCC在菌落总数测定中具有防止菌落弥漫生长的用途。所述菌落为芽孢杆菌。

作为优选，所述TCC的浓度为0.2％～0.3％；在本发明中，所述“浓度”为“质量分数”。

作为优选，所述菌落总数测定中使用琼脂培养基。

在本发明提供的一个具体实施方式中，本发明的发明人以蜡样芽胞杆菌为芽孢杆菌代表，以大肠埃希氏菌为革兰氏阴性菌代表，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌代表，采用琼脂中加入TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)的方法抑制芽孢杆菌菌落弥漫生长现象，并与覆盖法的效果作对比；结果发现TTC浓度为0.2％～0.3％时，能有效防止蜡样芽胞杆菌在计数琼脂上出现菌落弥漫生长，同时对其和其他细菌的生长无显著影响，而覆盖法抑制菌落弥漫生长效果欠佳。因此，食品微生物检验中测定菌落总数时，遇到易受芽孢杆菌污染的食品，可在琼脂中加入0.2％～0.3％的TTC防止菌落出现弥漫现象而导致无法计数的情况发生。

在本发明提供的一个具体的应用实施例中，所述菌落总数测定方法依据GB4789.2-2016《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》，且TCC在菌落总数测定中防止菌落弥漫生长的具体方法为：将食品样品进行稀释后，将平板计数琼脂灭菌后，加入灭菌的0.2％～0.3％TTC溶液，使其混合均匀。

需氧细菌的新陈代谢作用能将T T C还原为红色的三苯甲臢(T P F)，使得菌落呈红色，故可以将T T C作为细菌生长的指示剂，同时TTC对细菌的生长有一定的抑制作用，本发明的发明人利用TTC，经过创造性的路径寻找了抑制菌落弥漫生长的有效方法，便于菌落计数。

附图说明

图1为不同浓度TTC琼脂对蜡样芽胞杆菌菌落形态的影响效果示意图。

具体实施方式

实施例1 TTC抑制菌落弥漫生长实验

1材料与方法

1.1材料

1.1.1平板计数琼脂培养基由广东环凯微生物技术有限公司提供。

1.1.2 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)分析纯，由北京索莱宝科技有限公司(Solarbio)提供。

1.1.3蜡样芽胞杆菌(CMCC(B)63303)，大肠埃希氏菌(ATCC25922)，金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)由广东环凯微生物技术有限公司提供；

1.2方法

1.2.1 1％TTC的配制称取1g TTC，加入99mL蒸馏水，完全溶解后，用0.22μm滤膜除菌，于4℃冰箱中避光保存。

1.2.2菌液制备将蜡样芽胞杆菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌分别接种于营养琼脂斜面培养基上，置36±1℃培养24h。取上述斜面菌苔用灭菌0.85％生理制成菌悬液各5ml置灭菌试管中充分混匀，分别制成菌液浓度为约n×10⁷CFU/ml，以上菌液依次作10倍稀释，制备成浓度不同菌悬液备用。

1.2.3不同含量TTC计数琼脂将平板计数琼脂灭菌后，待冷至46℃，分别按每100ml培养基加入灭菌的(0.01％、0.05％、0.08％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.8％、1.0％)TTC溶液1ml，最终浓度分别为(0.0001g/ml、0.0005g/ml、0.0008g/ml、0.001g/ml、0.002g/ml、0.003g/ml、0.004g/ml、0.005g/ml、0.008g/ml、0.01/ml)摇匀混匀备用。

1.2.4参照国家标准GB4789.2-2016操作，用1mL灭菌吸管分别取上述细菌稀释液于2组灭菌平板内各1mL，将46℃水浴中含不同浓度TTC的计数琼脂(包括不含TTC的对照组和覆盖组)注入平板内约25mL，并转动平板使混合均匀。覆盖组，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4mL)，凝固后翻转平板，同时分别将平板计数琼脂25mL注入灭菌平板及加有1mL灭菌生理盐水平板内作空白和试剂对照，待琼脂凝固后翻转平板，置36±1℃温箱内培养48h，观察结果。

1.2.5统计方法SPSS18.0。

2结果

2.1不同浓度TTC琼脂对细菌生长的影响

表1列出了不同浓度TTC琼脂细菌菌落总数检测结果，当蜡样芽胞杆菌菌液稀释浓度为10^-6时，菌落数在适宜计数范围(30CFU～300CFU)，从表1可知，不同浓度TTC琼脂对细菌生长呈现不同的抑制效果，即TTC浓度为0.01％～0.1％时，对照组菌落总数为5.6×10⁷CFU/ml；0.01％组为5.7×10⁷CFU/ml；0.05％组为5.4×10⁷CFU/ml；0.08％组为5.5×10⁷CFU/ml；0.1％组为5.6×10⁷CFU/ml，上述浓度TTC计数琼脂细菌菌落总数无显著差异(χ²＝0.600，P＝0.896>0.05)。

结果表明：TTC浓度为0.01％～0.1％对细菌生长无显著抑制效果；TTC浓度为0.2％～0.3％时，菌落总数出现一定量的增加，并出现超过对照组和覆盖组菌落数量的现象，表明上述浓度对细菌生长亦无显著抑制效果；但当TTC浓度达0.4％以上时，菌落总数呈显著下降现象，菌落生长出现显著抑制作用。

当大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌菌液稀释浓度为10^-5时，菌落数在适宜计数范围(30CFU～300CFU)，从表1可知，TTC浓度为0.01％～1.0％时，大肠埃希氏菌对照组菌落总数为2.6×10⁷CFU/ml；0.01％组为2.6×10⁷CFU/ml；0.05％组为2.7×10⁷CFU/ml；0.08％组为2.6×10⁷CFU/ml；0.1％组为2.5×10⁷CFU/ml，0.2％组为2.4×10⁷CFU/ml；0.3％组为2.3×10⁷CFU/ml；0.4％组为2.5×10⁷CFU/ml；0.5％组为2.4×10⁷CFU/ml；0.8％组为2.5×10⁷CFU/ml；1.0％组为2.4×10⁷CFU/ml，上述浓度TTC计数琼脂细菌菌落总数无显著差异(χ²＝2.182，P＝0.702>0.05)，表明TTC浓度为0.01％～1.0％对细菌生长无显著抑制效果；TTC浓度为0.01％～0.4％时，金黄色葡萄球菌对照组菌落总数为2.5×10⁷CFU/ml；0.01％组为2.6×10⁷CFU/ml；0.05％组为2.5×10⁷CFU/ml；0.08％组为2.7×10⁷CFU/ml；0.1％组为2.6×10⁷CFU/ml，0.2％组为2.7×10⁷CFU/ml；0.3％组为2.6×10⁷CFU/ml；0.4％组为2.4×10⁷CFU/ml；上述浓度TTC计数琼脂细菌菌落总数无显著差异(χ²＝1.000，P＝0.801>0.05)，表明TTC浓度为0.01％～0.4％对细菌生长无显著抑制效果，TTC浓度达0.5％以上时，金黄色葡萄球菌菌落总数呈显著下降现象，菌落生长出现显著抑制作用。

表1

注：不同浓度TTC琼脂细菌菌落总数检测结果；*代表计数平板菌落有一定的蔓延现象，星号越多越严重；—代表计数平板无肉眼可见菌落；--代表无实验数据。

2.2不同浓度TTC琼脂对蜡样芽胞杆菌菌落形态的影响

不同浓度TTC琼脂对蜡样芽胞杆菌菌落形态也呈现出三种状态，如图1所示，即TTC浓度为0.01％～0.1％时，菌落颜色由粉色向红渐增，菌落形态和直径大小与对照组类似，计数平板上均出现菌落弥漫生长现象；TTC浓度为0.2％～0.3％时，菌落颜色愈红，菌落形态与直径大小接近对照组，但计数平板上菌落弥漫生长现象几乎消失；而TTC浓度达0.4％以上时，菌落颜色由红向朱红渐增，菌落直径渐缩至针眼大小，直至平板无菌落生长，同时计数平板上菌落弥漫生长现象消失。由图1可见，覆盖组则多为细小点状形态，但明显有菌落出现弥漫生长现象，而对照组的菌落多为弥漫状态。

具体地，TTC浓度琼脂为0.01％～0.1％时，对蜡样芽胞杆菌生长无显著抑制效果，菌落形态、直径大小与照组类似，菌落颜色显现淡红色易于辨认，但计数平板上有菌落弥漫生长现象，故抑制菌落弥漫生长效果不佳；TTC浓度琼脂为0.2％～0.3％时，对蜡样芽胞杆菌生长亦无显著抑制效果，菌落总数出现一定量的增加，并出现超过对照组和覆盖组菌落数量的现象，菌落形态、直径大小接近对照组，颜色显现红色，但菌落弥漫生长现象几乎消失，故抑制菌落弥漫生长效果佳。同时，菌落颜色也易于分辨，且数量不受TTC抑制生长而减少，反增加，原因可能是TTC抑制菌落的弥漫生长，使得原本因弥漫生长覆盖消失的菌落又重新出现便于分辨计数了；TTC浓度达0.4％以上时，蜡样芽胞杆菌菌落总数呈显著下降现象，菌落生长出现显著抑制作用，菌落颜色显现朱红，菌落直径渐缩至针眼大小，同时菌落弥漫生长现象消失，故抑制菌落弥漫生长效果显著，但菌落总数受到TTC抑制而锐减。而大肠埃希氏菌不易受到TTC浓度的剧烈影响，同时金黄色葡萄球菌也以添加0.2％～0.3％TTC浓度为宜。

试验例0.2％～0.3％TTC溶液在食品菌落总数中的作用

1样品的稀释

1.1称取25g月饼置盛有225mL生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1：10的样品匀液。

1.2用1mL无菌吸管吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。

1.3按1.2操作，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1mL无菌吸管。

1.4根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

1.5将平板计数琼脂灭菌后，待冷至46℃(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)，分别按每100mL培养基加入灭菌的0.2％～0.3％TTC溶液1mL，并转动平皿使其混合均匀，然后及时将15mL～20mL平板计数琼脂培养基倾注平皿。

2培养

2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1培养48h±2h，观察结果。

结果显示：

1.相对于覆盖法抑制菌落弥漫生长效果欠佳；TTC浓度为0.2％～0.3％时，能有效防止蜡样芽胞杆菌在计数琼脂上出现菌落弥漫生长，同时对其和其他细菌的生长无显著影响，因此，食品微生物检验中测定菌落总数时，遇到易受芽孢杆菌污染的食品，可在琼脂中加入0.2％～0.3％的TTC防止菌落出现弥漫现象而导致无法计数的情况发生。

Claims

1.TCC在菌落总数测定中防止菌落弥漫生长的用途。

2.如权利要求1所述的TCC在菌落总数测定中防止菌落弥漫生长的用途，其特征在于：所述菌落为芽孢杆菌。

3.如权利要求2所述的TCC在菌落总数测定中防止菌落弥漫生长的用途，其特征在于：所述TCC的浓度为0.2％～0.3％。

4.如权利要求1-3任意一项所述在菌落总数测定中防止菌落弥漫生长的用途，其特征在于：所述菌落总数测定方法依据GB 4789.2-2016《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》；且TCC在菌落总数测定中防止菌落弥漫生长的具体方法为：将平板计数琼脂灭菌后，加入灭菌的0.2％～0.3％TTC溶液，使其混合均匀。