CN108148888A - 霉菌和酵母菌微生物限度检测方法 - Google Patents

霉菌和酵母菌微生物限度检测方法 Download PDF

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陈建华
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唐奕
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
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Abstract

本发明提供了一种霉菌和酵母菌微生物限度检测的方法，包括步骤：将供试液加入到沙氏葡萄糖琼脂培养基中，培养后进行RS霉菌和酵母菌微生物限度检测；其中，沙氏葡萄糖琼脂培养基中含有庆大霉素。其中，所述庆大霉素为硫酸庆大霉素，硫酸庆大霉素在沙氏葡萄糖琼脂培养基中的含量为4mg/100mL～5mg/100mL。本发明通过对SDA培养基中添加硫酸庆大霉素注射液，解决了SDA培养基中生长细菌过多而导致RS霉菌和酵母菌总数超标问题，提高RS霉菌和酵母菌检验结果的准确性，使产品微生物限度质量控制更科学、合理。

Description

霉菌和酵母菌微生物限度检测方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种霉菌和酵母菌微生物限度检测的方法。
背景技术
实施2015版《中国药典》，微生物限度检测项目发生了巨大的变化，一是培养基的变化，霉菌和酵母菌总数检测用培养基由玫瑰红钠变为“沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)”，SDA为广谱性培养基，灵敏度高，有助于产品中所有存活微生物的生长，因此增加了易染菌产品微生物的检出风险。二是计数原则的改变，2010版药典规定营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基上均有霉菌和酵母菌生长时是以菌落数高的霉菌和酵母菌计数报告结果。而2015版药典规定是以SDA上生长的总菌落数(需氧菌、霉菌和酵母菌)计数报告结果。
RS国家药品标准规定：需氧菌10000cfu/g；霉菌和酵母菌100cfu/g。基于SDA培养基的性质和2015版药典计数原则的改变，RS霉菌和酵母菌总数检验结果的准确性会受到一定的干扰，我们做了10组试验，从实验结果看，SDA平板上细菌数占菌落总数的80％以上，有的甚至高达100％,导致RS霉菌和酵母菌总数检验结果超标。因此，为了提高RS霉菌和酵母菌检验结果的准确性，使微生物限度检验方法更科学、合理，我们建立一个新方法对RS霉菌和酵母菌总数进行检验。
参考资料：1.2015版中国药典四部(通则：1105非无菌产品微生物限度检查微生物计数法；1106非无菌产品微生物限度检查控制菌检查法；1107非无菌产品微生物限度标准)
2.国家药品监督管理局国家药品标准鞣酸蛋白酵母散(WS-10001-(HD-0910)-2002)
发明内容
本发明的目的在于提供一种RS霉菌和酵母菌微生物限度检测的方法，提高RS霉菌和酵母菌检验结果的准确性，使产品微生物限度质量控制更科学、合理。
本发明是通过以下技术方案来实现：
霉菌和酵母菌微生物限度检测的方法，包括步骤：将供试液加入到沙氏葡萄糖琼脂培养基中，培养后进行RS霉菌和酵母菌微生物限度检测；其中，沙氏葡萄糖琼脂培养基中含有庆大霉素。
优选地，所述庆大霉素为硫酸庆大霉素，硫酸庆大霉素在沙氏葡萄糖琼脂培养基中的含量为4mg/100mL～5mg/100mL。
优选地，硫酸庆大霉素在沙氏葡萄糖琼脂培养基中的含量为4mg/100mL。
优选地，用硫酸庆大霉素注射液配制含有庆大霉素的沙氏葡萄糖琼脂培养基。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供的霉菌和酵母菌微生物限度检测的方法，对SDA培养基中添加硫酸庆大霉素注射液，解决了SDA培养基中生长细菌过多而导致RS霉菌和酵母菌总数超标问题，提高RS霉菌和酵母菌检验结果的准确性，使产品微生物限度质量控制更科学、合理。
附图说明
图1为筛选SDA中添加硫酸庆大霉素注射液浓度流程图。
图2为培养基抑菌性检查流程图。
图3为霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验流程图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
1筛选SDA中添加硫酸庆大霉素注射液浓度
如图1所示，在制备供试液后，制备不同浓度的样品组，其中，每个浓度组取供试液1ml，根据浓度要求加入含1mg/100ml、2mg/100ml、3mg/100ml、4mg/100ml或5mg/100ml硫酸庆大霉素(选用注射液)的SDA培养基20ml，每个浓度组选用两个平皿。样品组25℃下培养5天，检测各个浓度组的菌落形成单位(cfu/ml)。
将供试液1ml与大肠埃希菌CMCC(B)44102菌悬液1ml(1：1)混合，得到1份人工污染样品2ml；然后配制具有不同浓度组的人工污染样品组，每个浓度组中含有1份人工污染样品，并根据不同的浓度要求加入含1mg/100ml、2mg/100ml、3mg/100ml、4mg/100ml或5mg/100ml硫酸庆大霉素(选用注射液)的SDA培养基20ml，每个浓度组选用两个平皿。人工污染样品组25℃下培养5天，检测各个浓度组的菌落形成单位(cfu/ml)。
将大肠埃希菌CMCC(B)44102菌悬液1ml作为菌液组，加入不含硫酸庆大霉素的SDA培养基20ml，选用两个平皿。菌液组25℃下培养5天，检测各个平皿的菌落形成单位(cfu/ml)。
实验结果展示在表1中。从试验结果看，加入含4mg/100ml、5mg/100ml硫酸庆大霉素注射液的SDA培养基时平皿中无菌落生长，含4mg/100ml或5mg/100ml硫酸庆大霉素注射液的SDA可以有效的抑制试验菌的生长，因此拟定SDA中添加硫酸庆大霉素的浓度为4mg/100ml。
表1：筛选SDA中添加硫酸庆大霉素注射液浓度试验结果
实施例2
培养基抑菌性检查
本实施例主要考察含有4mg/100mL硫酸庆大霉素注射液的SDA是否抑制细菌生长，能否达到预期效果。
如图2所示
试验组：分别取金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌CMCC(B)10104、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501的菌悬液各1ml，加入含4mg/100ml硫酸庆大霉素注射液的SDA培养基20ml作为试验组，每组选用两个平皿，25℃进行培养5天，检测各个平皿中的菌落形成单位(cfu/ml)。
菌液组：分别取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液各1ml，加入SDA培养基20ml作为菌液组，每组选用两个平皿，25℃进行培养5天，检测各个平皿中的菌落形成单位(cfu/ml)。
实验结果展示在表2中，从试验结果看，对试验组中加入含有4mg/100ml硫酸庆大霉素的SDA时，试验菌均无菌落生长，而菌液组加入SDA时，有菌落生长。因此100mlSDA含4mg硫酸庆大霉素(注射液)对试验菌有抑制作用，平板上无菌落生长，细菌数为0，试验通过，即含有4mg/100mL硫酸庆大霉素(注射液)的SDA能抑制细菌生长，能达到预期效果。
表2：SDA培养基抑菌性检查结果
实施例3
霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验
本实施例主要考察含有4mg/100mL硫酸庆大霉素(注射液)的SDA抑制细菌生长的同时对霉菌和酵母菌有无抑制作用。
如图3所示，将白色念珠菌CMCC(F)98001(购置0代干粉，无明确浓度)在SDB培养基中25℃培养3天，得到白色念珠菌CMCC(F)98001菌悬液；制成浓度＜104cfu/ml的菌悬液.。
将黑曲霉CMCC(F)98003(购置0代菌悬液，无明确浓度)在SDB培养基中25℃培养7天，得到黑曲霉CMCC(F)98003菌悬液；制成浓度＜104cfu/ml的菌悬液。
供试液制备：称取鞣酸蛋白酵母散10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇10分钟使其分散均匀，制成1:10供试液。
试验组：取制备好的1:10供试液分装于2个无菌试管中，每管装量为9.9ml,再分别加入制备好的白色念珠菌和黑曲霉试验菌液(浓度＜104cfu/m，菌悬液)0.1ml，得到试验组样品液。取试验组样品液各1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入20ml温度不超过45℃熔化的含4mg/100mL硫酸庆大霉素(注射液)的SDA培养基，混匀，凝固，每组选用两个平皿，在25℃下培养5天，计数。计算各组的平均菌落数。
供试品对照组：取制备好的1:10供试液9.9ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(稀释液)0.1ml，得到供试品对照组样品液。取供试品对照组样品液1ml,置直径90mm的无菌平皿中，注入20ml温度不超过45℃熔化的含4mg/100mL硫酸庆大霉素(注射液)的SDA培养基，混匀，凝固，每组选用两个平皿，在25℃下培养5天，计数。计算各组的平均菌落数。
菌液对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分装于2个无菌试管中，每管装量为9.9ml，再分别加入制备好的白色念珠菌和黑曲霉试验菌液(浓度＜104cfu/m)0.1ml，得到菌液对照组样品液。取菌液对照组样品液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入20ml温度不超过45℃熔化的含4mg/100mL硫酸庆大霉素(注射液)的SDA培养基，混匀，凝固，每组选用两个平皿，在25℃下培养5天，计数。计算各组的平均菌落数。
阴性对照：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液各1ml,置直径90mm的无菌平皿中，注入20ml温度不超过45℃熔化的含4mg/100mL硫酸庆大霉素(注射液)的SDA培养基，混匀，凝固，每组选用两个平皿，在25℃下培养5天，计数。
结果判断：试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值在0.5～2范围内，供试品的霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验通过。
试验结果展示在表3中，根据试验结果计算试验菌回收比值(结果比值)，计算结果在均在0.5～2，均符合药典标准，方法适用性通过。
表3：霉菌和酵母菌总数测定微生物回收试验结果
实施例4
通过对鞣酸蛋白酵母散样品中同时分别加入SDA和含有4mg/100mL硫酸庆大霉素(注射液)的SDA做了10组对比试验，SDA平板上有细菌生长，而4mg硫酸庆大霉素注射液SDA平板上无细菌生长，由此证明4mg硫酸庆大霉素注射液SDA抑制细菌生长，细菌数均为0。10组对比试验的结果展示在表5中。
表5:10组对比试验的结果
本发明提供的方法抑制SDA培养基上生长细菌，降低了因细菌生长过多导致RS霉菌和酵母菌结果超标误判产品质量不合格。提高了RS霉菌和酵母菌检验结果的准确性，使产品微生物限度质量控制更科学、合理。

Claims (4)

1.霉菌和酵母菌微生物限度检测的方法，其特征在于，包括步骤：将供试液加入到沙氏葡萄糖琼脂培养基中，培养后进行RS霉菌和酵母菌微生物限度检测；其中，沙氏葡萄糖琼脂培养基中含有庆大霉素。
2.如权利要求1所述的霉菌和酵母菌微生物限度检测的方法，其特征在于，所述庆大霉素为硫酸庆大霉素，硫酸庆大霉素在沙氏葡萄糖琼脂培养基中的含量为4mg/100mL～5mg/100mL。
3.如权利要求2所述的霉菌和酵母菌微生物限度检测的方法，其特征在于，硫酸庆大霉素在沙氏葡萄糖琼脂培养基中的含量为4mg/100mL。
4.如权利要求1所述的霉菌和酵母菌微生物限度检测的方法，其特征在于，用硫酸庆大霉素注射液配制含有庆大霉素的沙氏葡萄糖琼脂培养基。
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